Name: purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Tang kısmen Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen: GRNT31430008, NIH AR070029, NIH HL086555, NIH HL134354.

Hayvanlar onaylı protokolleri ve hayvan refahı düzenlemeleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Gürcistan tıp Koleji Augusta Üniversitesi'nde ele.
1. izolasyon ve MPC kaynaklı Exosomes arıtma
<ol><li>Tohum 5 x 10 ile 20 mL tam Dulbecco'nın bir 15 cm hücre kültür yemek6 C2C12 hücrelerde % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin içeren kartal orta (DMEM) değiştiren. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.</li>
	<li>Ya...

<ol>
	<li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy.">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li><li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain.">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li><li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules.">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li><li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy.">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li><li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy.">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li><li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy:+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database.">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li><li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy.">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies.">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy:+pathogenesis+and+therapeutics.">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li><li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction.">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li><li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy:+physiological+and+morphological+findings.">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li><li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li><li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duchenne+muscular+dystrophy:+current+cell+therapies.">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice.">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li><li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium.">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li><li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro.">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases.">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li><li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases.">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).</li><li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases.">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li><li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice.">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li><li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction.">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death &amp; Disease. 3, 381 (2012).</li><li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carvedilol-responsive+microRNA,+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes.">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes/microvesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium.">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li><li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator.">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li><li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes.">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li><li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads.">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li><li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation.">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li><li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li></ol>

Saf exosomes izole yöntemi exosomes işlev eğitim için esastır. Bir ortak teknikleri eksozom yalıtım için polietilen aracılı glikoller (mandal) yağış17,18,25' tir. Exosomes olabilir mandal içinde çöktürülmüş ve düşük hızlı Santrifüjü tarafından pelleted. PEG aracılı arıtma çok uygun, düşük maliyetli, Gelişmiş ekipman gerek değil, ama orada exosomes saflığı hakkında endişe beri diğer lip...

Duchenne kas distrofisi (DMD) bir mutasyon DMD gen ve fonksiyonel dystrophin1kaybı nedeniyle bir X'e bağlı resesif, progressive nöromüsküler hastalıktır. Dystrophin öncelikle kas iskelet ve Miyokardiyum ifade edilir ve daha az düz kas, endokrin bezlerin ve nöronlar2,3' te ifade edilir. DMD 3.500-5000 yeni doğan çocuklar dünya çapında4,5başına bir bir insidansı ile Muskuler Distrofi en yaygın türüdür. Bireyler genellikle ilerleyici kas nekrozu, erken ergenlik ve ölüm nedeniyle kalp yetmezliği ve solunum yetmezliği6hayatlarının ikinci-üçüncü yıllarda tarafından bağımsız yürüme kaybı gelişir.
Dilate kardiyomiyopati, aritmi ve konjestif kalp yetmezliği DMD7,8ortak kardiyovasküler tutulum vardır. Hastalık tedavi edilemez, destekleyici tedavi semptomları veya kalp yetmezliği ilerlemesini geciktirmek, ama kalp fonksiyonu9,10artırmak çok zordur.
DMD hastaları, kas distrofisi X'e benzer (MDX) fare eksik dystrophin protein ve mevcut kardiyomiyopati11belirtileri ve bu nedenle ilişkili DMD kardiyomiyopati araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Dystrophin etkilenen kaslarda geri yükleyebilmek için Allojeneik Kök hücre tedavisi DMD12,13,14için etkili bir tedavi olduğu ispatlanmıştır. Exosomes, 30-150 nm membran veziküller çeşitli hücre tiplerinin tarafından salgılanan mesajcı RNA (mRNA) ve kodlamayan RNA'ların15,16,17 gibi genetik malzeme taşıma yoluyla hücre hücre iletişim önemli bir rol oynamaktadır ,18,19,20,21.
Bizim önceki çalışmalar myogenic progenitör hücrelerin (MPC), C2C12 hücre kültürünü gibi türetilmiş exosomes dystrophin aktarabilirsiniz göstermiştir bu allojeneik teslimini gösteren mRNA doğrudan kalp enjeksiyon22sonra ana bilgisayar cardiomyocytes için MPC kaynaklı exosomes (MPC-Exo) geçici DMD gen ekspresyonu MDX farelerde geri yükleyebilirsiniz. Bu makale MPC-Exo arıtma ve nakli teknikleri üzerinde duruluyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1064px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:424px;">0.22-&#956;m Filter</td>
			<td style="width:280px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:185px;">09-720-004</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-cm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-gauge catheter</td>
			<td style="width:280px;">TERUMO</td>
			<td>SR-OX2419CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">31-gauge insulin needle</td>
			<td style="width:280px;">BD</td>
			<td>328291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Affymetrix</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 suture</td>
			<td style="width:280px;">Pro Advantage by NDC</td>
			<td>P420697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:280px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>30-004-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Dystrophin antibody</td>
			<td style="width:280px;">Abcam</td>
			<td>ab15277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antigen retriever&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Aptum Biologics</td>
			<td>R2100-US</td>
			<td>Antigen recovery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autofluorescence Quenching Kit&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>SP-8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C2C12 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Centrifuge</td>
			<td>Unico</td>
			<td>C8606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Change-A-Tip High Temp Cauteries</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>HIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscopy</td>
			<td style="width:280px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss 780 Upright Confocal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DBA/2J-mdx mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum&#160;</td>
			<td style="width:280px;">MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:280px;">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-1389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine</td>
			<td style="width:280px;">Henry Schein</td>
			<td>056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium with DAPI&#160;</td>
			<td style="width:280px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Retractor Set</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:280px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent ventilator</td>
			<td style="width:280px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW-28 Ti rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>342207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Vevo 2100 Imaging Platform</td>
			<td style="width:280px;">FUJIFILM VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td>Ultrasound System&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>365672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine (XylaMed)</td>
			<td style="width:280px;">Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td>
			<td>1XYL003 8XYL006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and transplantation of myogenic progenitor cell derived exosomes to improve cardiac function in duchenne muscular dystrophic mice

Duchene müsküler distrofisi (DMD) fonksiyonel dystrophin protein eksikliğinden kaynaklanan bir X'e bağlı resesif genetik bir hastalıktır. Hastalık tedavi edilemez ve hastalık ilerledikçe hasta dilate kardiyomiyopati, aritmi ve konjestif kalp yetmezliği belirtileri gelişir. DMDMDX mutant fare dystrophin ifade edemediği ve DMD fare modeli olarak yaygın olarak kullanılır. Bizim son çalışmada, biz o intramyocardial enjeksiyon geniş türü (WT) gözlenen-geri geçici Miyokardiyum DMDMDX mutant farelerin dystrophin ifade myogenic progenitör hücre kaynaklı exosomes (MPC-Exo) hangi ilişkili ima kardiyak fonksiyon geçici bir iyileşme ile WT-MPC-Exo DMD kardiyak semptomlarını kontrol etmek için bir seçenek sağlar. MPC-Exo arıtma ve DMDMDX mutant farelerin kalpleri içine nakli tekniği bu makalede.

İzole edip exosomes C2C12 hücrelerden arıtma için bir akış şeması şekil 1içindeAgösterilir. Exosomes varlığını doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu çözümleme yapılır. Transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü (şekil 1B) elde edilen C2C12 exosomes parlak ve yuvarlak şekil veziküller morfolojisi gösterir. Western blot analizi doğruladı eksozom işaretleri, CD63 ve TSG101 de dahil olmak ü...

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice at JoVE.com

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Burada, geçici exosomes normal myogenic atası hücrelerden türetilmiş dikim tarafından Duchenne kas distrofisi farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için bir protokol mevcut.

Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Bu protokol, duchenne'nin kas distrofisi farelerinde normal miyojenik progenitör hücrelerinden elde edilen ekson nakli ile kardiyak fonksiyonu geçici olarak iyileştirme yöntemini sunar. Ekzozomal transplantasyon, dmd farelerde kalp fonksiyonlarını iyileştirebilir ve alıcı kalplerde distrofi ekspresyonunun artması yla ilişkili olarak. Ekson izolasyon, saflaştırma ve intramiyokardiyal transplantasyon için uygun yöntem, Duchenne kas distrofisi olan fareleriçin kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için ekson transplantasyonunun başarısına katkıda bulunur.MPC kaynaklı ekzozom tedavisi ekzozozom aracılı normal distrofin mRNA transferi ile iskelet kası fonksiyonlarını artırabilir. Bu video ekzozom arınma, intramiyokardiyal ekzozom doğum ve ekokardiyografi sonrası transplantasyon için kritik teknikleri göstermektedir. Ekokardiyografi gösterisi, laboratuarımızdan teknisyen Yan Shen tarafından yapılacak.Bu prosedürü başlatmak için, tohum beş milyon C2C12 hücreleri 15 santimetre kültür çanak içine 20 mililitre tam DMEM içeren 10% FBS ve antibiyotik. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 100, 000 kez G ve dört derece Santigrat derece exozosome-tükenmiş orta hazırlamak için 18 saat boyunca FBS ultracentrifuge için bir sallanan kova rotor kullanın.Pelet atın ve supernatant toplamak. Tek katmanlı hücreler kültür çanasında %80 birleştiğinde, tam DMEM'i ekzozom tükenmiş ortamla değiştirin. Her 48 saatte bir hücre kültürü çanağı süpernatant toplamak için bir transfer pipet kullanın.Kalan hücreleri çıkarmak için 150 kez G tüpleri on dakika santrifüj. Herhangi bir hücre enkazını ortadan kaldırmak ve filtrelenmiş ortamı ultra net tüplere aktarmak için süpernatant'ı 0,22 mikrometre filtreden filtreleyin. Daha sonra, 100, 00 kez G ve 4 derece Santigrat 120 dakika ekzozomları çökeltmek için tüpler ultracentrifuge için bir salıncak kova rotor kullanın.PBS'deki ekzozom içeren peleti yeniden askıya alın ve ultra berrak tüpün tamamını PBS ile doldurun. Ultracentrifuge bu süspansiyon 100, 00 kez G ve 4 derece santigrat 120 dakika kontamine proteinleri ortadan kaldırmak için. Supernatant atın ve PBS 100 mikrolitre ekzozom pelet resuspend.İleride kullanılmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, her bir ekstremite bant ile güvence altına alarak cerrahi bir platform üzerinde supine pozisyonda her anestezili fare düzeltmek. Üst çeneyi yerinde tutmak için üst dişlerin altına yatay olarak 3-0 dikiş yerleştirin.Daha sonra, köknarı deriden çıkarmak için farenin göğsünün sol tarafına tüy dökücü krem uygulayın. 24 gauge kateter kullanarak, oral kavite üzerinden endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. Ve dakikada 195 nefes hızında oda havası ile fareyi havalandırmak için bir kemirgen vantilatör kullanın.% 70 alkol ve% 10 povison iyot ile cildi dezenfekte. Sonra sol sternal kenarından sol koltuk altı için 10 ila 15 milimetre lik oblik kesi yapın. Pektoralis majör ve pektoralis minör kesmek için makas kullanın.Ve dördüncü kıyılar arası uzayda sol torakotami yapın. Torasik boşluğu sol akciğere zarar vermemeye özen tayarak 10 milimetre genişliğe yaymak için retraktör bantlarını yavaşça takın. Bundan sonra, perikard kaldırmak için iki düz cımbız kullanın.Onları ayırın ve kalbi ortaya çıkarmak için retractor ipuçları arkasına yerleştirin. MPC-Exo veya PBS intramiyokial inmiyokardial bir sitede sol ventrikül ön duvarına enjekte etmek için 31 gauge insülin iğnekullanın. Daha sonra, torasik boşluğu kapatmak için 6-0 naylon dikişler kullanın, pektoralis kasları, ve cilt, sırayla.PBS ekzozom naklinden iki gün sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi fareleri anestezi edin. Bir fareyi supine pozisyonunda düzeltmek ve sol göğüs bölgesine önceden ısıtılmış akustik jel uygulamak için bant kullanın. Daha sonra, sol ventrikül fonksiyonunu değerlendirmek için ekokardiyografi kullanın.İki boyutlu sol ventrikül parasternal uzun eksen görünümü elde ve sonra papiller kas düzeyinde bir sol ventrikül kısa eksen görünümü elde etmek için ultrason prob 90 derece döndürmek. Bundan sonra, M-modu ekokardiyografik görüntüleri kaydedin ve sol ventrikül son diyastolik çapı ölçmek, sol ventrikül end-sistolik hacim, sol ventrikül son diyastolik hacim, ve sol ventrikül sonu-sistolik hacmi. Farelerin kalp hızı kardiyak ölçüm fonksiyonu için en az 400 bpm kontrol edilmelidir.Ekzozomlar C2C12 hücrelerinden izole edilip saflaştırıldıktan sonra iletim elektron mikroskobu analizi ile varlığı doğrulanır. İletim elektron mikroskobu görüntüsü C2C12 türetilmiş ekzozomların parlak ve yuvarlak şekilli veziküllerinin morfolojisini gösterir. Batı leke analizi CD63 ve Tsg101 dahil olmak üzere ekzozom belirteçlerinin varlığını doğrular.Mdx farelerin sol ventrikülünün ön duvarına intramiyokardiyal enjeksiyon dan sonra yarı saydam ödem bölgesi gözlenir ve bu da miyokardiyuma enjeksiyonun başarılı olduğunu gösterir. Daha sonra distropofin için immünoresan boyama, kardiyak MPC-Exo doğumun mdx kalplerde distrofin-protein ekspresyonunu geri getirip getirmediğini belirlemek için yapılır. Kardiyomiyositlerin bazılarında membran lokalizasyonu ile distrofin ekspresyonunun kısmi restorasyonu gözlenmektedir.MPC-Exo transplasyonunun mdx farelerde kardiyak fonksiyonu iyileştirip iyileştirmediğini belirlemek için intramiyokal doğumdan iki gün sonra ekokardiyografi ile kardiyak fonksiyon ölçülür. MPC-Exo tedavisinin PBS ile karşılaştırıldığında iç duvar hareketini geliştirdiği görülür ve bu da MdX farelerde MPC-Exo transplantasyonunun kardiyak fonksiyonu iyileştirdiğini düşündürmektedir. Yaklaşık 20 derece ucu ile 31 gauge insülin iğnesi kullanarak miyokardiyum içine en ekzozomların teslim ivedilikle başarı için önemlidir ve kardiyomiyosit barındırmak için enjekte ekzozomların maruz kalma maksimize eder.İşlemden sonra, kardiyak MPC kaynaklı ekzozom doğumun distrofin-protein ekspresyonunu geri yükettiğini belirten immünofloresan boyama ile MPC türetilmiş ekzozom enjeksiyonundan sonra distrofin ekspresyonu saptanabilir. Bu teknik, DNA, mRNA, lncRNA veya mikroRNA'lar gibi ekzozom taşıyan terapötik genetik malzemelerle kardiyomiyopati tedavisinin önünü açacaktır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury

Bronchoalveolar lavaj Exosomes septik akciğer Lipopolysaccharide kaynaklı yaralanmalarında

Acute lung injury (ALI) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) represent a heterogeneous group of lung diseases which continues to have a high ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...