Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

ويود المؤلفون ان يشكروا مرفق التصوير في مركز علوم النانو الحياتية ، المعهد الإيطالي لتقنيات التكنولوجيا ، للحصول علي الدعم والمشورة الفنية. ونحن ممتنون لأعضاء مركز العلوم نانو الحياة لمناقشه مفيده. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا بمنحه من AriSLA (منحه تجريبية 2016 "ستريسفوس") إلى AR.

1. صيانة iPSCs البشرية
<ol><li>
اعداد لوحات مصفوفة مغلفه
	<ol>
<li>ذوبان واحد 5 مل قارورة من مصفوفة (انظر جدول المواد) في 4 °c بين عشيه وضحيها. المخزونات الاصليه مصفوفة تاتي في تركيزات الأسهم المختلفة ويتم اجراء الارصفه وفقا لعامل التخفيف المشار اليه في ورقه البيانات ، محدده للكثير ا...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

يسمح هذا البروتوكول بتحويل iPSCs البشرية بكفاءة إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري والجمجمة بفضل التعبير المنتبائي لعوامل النسخ الخاصة بالنسب. هذه الجينات هي محفزه من قبل الدوكسيسيكلين ومتكاملة بشكل ثابت في الجينوم بفضل ناقلات المستندة إلى ترانسباك. في المجموعات السكانية المخت?...

العصبية الحركية (MN) انحطاط يلعب دورا مسببا في الامراض البشرية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وضمور العضلات الشوكي (SMA). ويعد إنشاء نظم نموذجيه للخلايا المختبرية المناسبة تلخص تعقيدات المليون البشري خطوه هامه نحو وضع نهج علاجيه جديده. الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (ipscs) ، والتي هبت مع خصائص تمايز التعددية الرائعة ، قد تم اشتقاقها الآن من عدد من المرضي المصابين بامراض الخلايا العصبية الحركية1،2. وقد تم توليد خطوط iPSC اضافيه تحمل طفرات المسببة للامراض المرتبطة بامراض MN عن طريق تحرير الجينات ، بدءا من السيطرة "صحية" مستحث الخلايا الجذعية3. وتمثل هذه الخطوط أدوات مفيده لنمذجة الامراض في المختبر وفحص المخدرات ، شريطه توافر الأساليب المناسبة لتمايز iPSC في MNs. والأساس المنطقي وراء تطوير هذه الطريقة هو تزويد المجتمع العلمي المهتم بامراض MN ببروتوكول تفاضلي سريع وفعال يؤدي إلى MNs وظيفية ناضجه. الميزة الاولي لهذا الأسلوب هو الإطار الزمني للتنفيذ. نقطه أخرى ذات صله من قوه ياتي من القضاء علي اي خطوه تنقيه. وأخيرا ، يمكن استخدام البروتوكول لتوليد اثنين من السكان متميزة من الخلايا العصبية الحركية.
امكانيه توليد أنواع فرعيه مختلفه من MNs هي ذات الصلة بشكل خاص لنمذجة امراض MN. ليس كل الأنواع الفرعية MN عرضه بنفس القدر في ALS و SMA وظهور الاعراض في وحدات المحركات المختلفة يؤثر بشكل كبير علي التكهن. في ALS, بداية العمود الفقري مع اعراض بدءا من الأطراف العلوية والسفلية يؤدي إلى الموت في حوالي 3-5 سنوات4. علي العكس من ذلك ، بداية بولبار ، بدءا من انحطاط MNs القحفيه ، لديه اسوا تكهن. وعلاوة علي ذلك ، فان النسبة المئوية لبداية بولبار اعلي بكثير في المرضي الذين يعانون من طفرات في البروتينات الريبية النيبالية ملزمه TDP-43 من الافراد الذين يعانون من طفرات SOD15. يعتمد تقريبا مجموع بروتوكولات التمايز MN البديلة علي نشاط حمض الريتينويك (RA) ، الذي يضفي علي الحرف الفقري التفريق بين ipscs6،7،8. وهذا يحد من امكانيه دراسة العوامل الجوهرية ، التي يمكن ان تكون وقائية في الأنواع الفرعية المحددة من الملايين9،10.
وتمشيا مع العمل السابق في الخلايا الجذعية الجنينية الفئران11, وقد أظهرنا مؤخرا ان في الإنسان ipscs التعبير عن Ngn2, Isl1 و LHX3 (NIL) يدفع هويه العمود الفقري MN, في حين ان Ngn2 و Isl1 زائد Phox2a (الخطة الخاصة) تحديد الجمجمة MNs12. التالي قمنا بتطوير بروتوكول فعال ، مما يؤدي إلى إنتاج MNs البشرية التي وهبها خصائص وظيفية في تحول 12 يوما. والغرض من هذه الطريقة هو الحصول ، في اطار زمني قصير ودون الحاجة إلى تنقيه (علي سبيل المثال ، من قبل FACS) ، والسكان الخلايا المخصبة للغاية ل MNs مع العمود الفقري أو الجمجمة الهوية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

ونحن نقدم هنا وصفا لطريقه للحصول علي الخلايا العصبية الحركية العمود الفقري والجمجمة الوظيفية من المستحث البشرية المستحثة (iPSCs). يتم الحصول علي التحويل المباشر إلى الخلايا العصبية الحركية عن طريق التعبير عن الوحدات البديلة لعوامل النسخ ، وهي Ngn2 ، Isl1 و Lhx3 (NIL) أو Ngn2 ، Isl1 و Phox2a (خطه البرامج الخاصة). وتحدد هذه الخطة ، علي التوالي ، هويه الخلايا العصبية للمحركات الشوكية والجمجمة. يبدا البروتوكول الخاص بنا بإنشاء خطوط iPSC المعدلة التي يتم فيها دمج الصفر أو النعناع البشري بشكل ثابت في الجينوم عن طريق ناقل ترانسباك. ثم يتم الحث علي التعبير عن الجينات عبر الدوكسيسيكلين ويؤدي ، في 5 أيام ، إلى تحويل iPSCs إلى المبتدئين MN. النضج اللاحق ، لمده 7 أيام ، يؤدي إلى السكان متجانسة من MNs الشوكي أو القحفيه. طريقتنا يحمل العديد من المزايا علي البروتوكولات السابقة: انها سريعة للغاية ومبسطه. انها لا تتطلب العدوى الفيروسية أو مزيد من العزلة MN; فانه يسمح توليد مختلف السكان الفرعيين MN (العمود الفقري والجمجمة) مع درجه ملحوظة من النضج ، كما يتضح من القدرة علي إطلاق النار القطارات من إمكانات العمل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الحصول علي عدد كبير من الخلايا العصبية الحركية دون تنقيه من السكان المختلطة. ويمكن استخدام الخلايا العصبية المستمدة من iPSC العمود الفقري والجمجمة الحركية في النمذجة في المختبر من التصلب الجانبي الضموري والامراض العصبية الأخرى من الخلايا العصبية الحركية. وقد تمثل الخلايا العصبية الحركية المتجانسة موردا هاما لفحوصات المخدرات الخاصة بنوع الخلية.

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي لطريقه التفريق. تم نقل iPSCs البشرية (WT I خط3) مع Epb-BSD-tt-النيل أو Epb-BSD-tt-النعناع الخاص ، وتوليد ، بناء علي الاختيار بلاستيبين ، ومستقره والخلايا القابلة للتحويل12، يشار اليها فيما بعد باسم ipscs-NIL و IPSCS-النعناع ، علي التوالي. ميزت خل...

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

يسمح هذا البروتوكول بالتحويل السريع والفعال للخلايا الجذعية مستحث المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية ذات الهوية الشوكية أو الجمجمة ، عن طريق التعبير البعيد عن عوامل النسخ من ناقلات الحمل المحبله.

تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

إمكانية توليد أنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية الحركية ذات الصلة بشكل خاص لنمويد أمراض الخلايا العصبية الحركية الحديثة مثل التصلب الجانبي الضموري. هذه الطريقة تسمح لاقتناء مجموعات الخلايا التي هي جامدة للغاية بالنسبة للخلايا العصبية الحركية مع هوية العمود الفقري أو الجمجمة في إطار زمني قصير ودون خطوة تنقية. قد يؤدي توليد الخلايا العصبية الحركية البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو iPSC في ظل حالة ثقافة مبسطة إلى تسهيل فحص الأدوية لأمراض الخلايا العصبية الحركية.يمكن استخدام التعبير غير القابل للانتكاس من عامل النسخ البرمجة لتوليد أنواع خلايا أخرى مثل الخلايا العصبية والعضلات والهيكل العظمي والخلايا الدبقية من مستودع iPSC. بالنسبة إلى أي شيء وNIP iPSC، شطف ثقافة iPSC الإنسان مع برنامج تلفزيوني خال من الكالسيوم والمغنيسيوم قبل معالجة الخلايا مع كاشف تفكك الخلايا لمدة خمس إلى 10 دقائق في 37 درجة مئوية. عندما بدأت الخلايا في الانفصال عن حاوية الثقافة، استخدم ماصة P1000 لفصل الخلايا يدوياً من ثلاث إلى أربع مرات.نقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر وجلب حجم النهائي يصل إلى 10 ملليلتر مع برنامج تلفزيوني جديد دون الكالسيوم والمغنيسيوم للعد. جمع مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة عن طريق الطرد المركزي و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من العازلة R من عدة electroporation. إضافة 4.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما ناقل قابل للتبديل و0.5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما piggyBac transposase لنقل.Transfect مع نظام كهربائي الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع المعلمات المشار إليها. ثم، بذور الخلايا في الإنسان iPSC المتوسطة تكملها 10 مثبطات الصخور الدقيقة Y-27632 في طبق ستة ملليمتر مكسوة بالمصفوفة. بعد يومين من عملية الاستئصال، أضف 5 ميكروجرام لكل ملليلتر من البلاستيسيدين إلى الوسط الثقافي مع الاحتفاظ بالخلايا في المضادات الحيوية لمدة سبعة إلى 10 أيام على الأقل لمواجهة الخلايا التي لم تدمج الخلايا المتحولة.في نهاية الحضانة، والحفاظ على الخلايا المُصابة بالعدوى بشكل ثابت كسكان مختلطين يتألفون من خلايا ذات أعداد مختلفة من المتحولين ومواقع تكامل مختلفة أو عزل المستنسخات المفردة. إعداد طبق إضافي للسماح للتعبير الفعال عن transgenes على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الحث دوكسيسكلين ليتم تقييمها من قبل RT-PCR مع التمهيديات transgene محددة لاعصابينين -2 كما هو موضح سابقا. وفي هذه المرحلة، ينبغي أيضا تجميد مخزونات الخطوط الجديدة صفر والخطوط IPSC NIP في الوسيلة المجمدة بالنسبة للبلدان النامية.لتمايز الخلايا العصبية الحركية، افصل الثقافات الخلية المُصابة بالعدوى بشكل ثابت مع كاشف الانفصام كما هو موضح للسماح بجمع الخلايا في أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على خمسة مجلدات من DMEM/F12 المتوسطة. بعد الطرد المركزي، resuspend الخلايا في المتوسط iPSC الإنسان تستكمل مع مثبط الصخور الدقيقة للعد. بذور الخلايا على الأطباق المغلفة بالمصفوفة في 6.25 مرات 10 الخلايا الرابعة لكل كثافة مربعة سنتيمتر.في اليومين المقبلين، استبدال االنبات مع تمايز المتوسطة الطازجة تكمل مع doxycycline. في اليوم الثاني، تغيير المتوسطة إلى neurobasal B27 المتوسطة تكملها مثبطات إفرازات غاما، مثبط مستقبلات عامل النمو البطانية الوعائية، و doxycyline. في اليوم الخامس، افصل الخلايا كما هو موضح وإعادة تعليق الخلايا المنفصلة في أربعة ملليلتر من متوسطة DMEM/F12 للعد.Pipetting مهم للتفكك الكامل للخلايا. تجميد aliquot من السلف الخلايا العصبية الحركية في المتوسطة تجميد الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وجمع بقية الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في وسط الخلايا العصبية تستكمل مع 10 مثبطات الصخور الدقيقة.بذور الخلايا على polyornithine laminin المغلفة microslide يدعم مع غطاء البوليمر زلات في مرة واحدة 10 إلى الخلايا الخامسة في كثافة مربعة سنتيمتر. في اليوم السادس، استبدل الوسيط بعناية بوسيلة عصبية جديدة بدون مثبط للثقافة حتى تحليل المصب دون فصل الخلايا عن سطح الدعم. يمكن ملاحظة تعبير موحد عن علامة متعددة الأطراف الملزمة عامل النسخ أربعة أو OTC4 في تمييز ثقافات الخلايا في اليوم صفر في غياب عموم علامة الخلايا العصبية فئة محددة ثلاثة بيتا tubulin TUJ1 الإيجابية.في اليوم الثالث، انخفاض قوي في عدد الخلايا الإيجابية OCT4 واضح. وهذا ينعكس بتعبير TUJ1 في مجموعة فرعية من iPSCs المتمايزة. في اليوم الخامس، لا يلاحظ أي تعبير عن OCT4 في السكان مما يدل على تعبير ثابت من TUJ1 ومورفولوجيا الخلايا العصبية المكتسبة.تحليل المثبط للمناعة سبعة أيام بعد إعادة طلاء الخلايا العصبية الحركية السلف يكشف عن تعبير موحد من TUJ1 وعلامة الخلايا العصبية الحركية ناضجة الكولين أستيل ترانزفيراز. الخلايا العصبية التي تستمد من iPSC NIL تعرض بنجاح تيارات الصوديوم المعتمدة على الجهد والتيارات البوتاسيوم المعتمدة على الجهد. 80٪ من الخلايا العصبية الحركية المشتقة من iPSC NIL التي فرضت في طريقة المشبك الحالية قادرة على تحفيز قطارات الارتفاع عند حقنها بنبض حالي زائد 60 بيكوamps أو أكثر.الحد الأدنى الحالي المطلوب لاستثارة تكرار اطلاق النار في أكثر من 50٪ من الخلايا المسجلة هو بالإضافة إلى 40 picoamps مع عتبة ارتفاع ما يقرب من ناقص 38 millivolts ومتوسط تردد اطلاق النار في زائد 40 picoamps من حوالي ثمانية هيرتز, مما يشير إلى أن الخلايا العصبية الحركية الشوكية iPSC NIL المستمدة المعرض خصائص وظيفية نموذجية من الخلايا العصبية الناضجة. يمكن اشتقاق الخلايا العصبية الحركية الشوكية والزعنية من iPSCs أو iPSCs التي تحمل طفرات مرضية وأنه يمكن استخدام هذه الخلايا كنماذج أطروحة أو لفحص المخدرات. ويمكن استخدام طريقتنا للمساعدة في فهم لماذا تتأثر وحدات الخلايا العصبية الحركية المختلفة تفاضلية من ALS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

كفاءة اشتقاق أسلاف الإنسان متعلق بالخلايا العصبية والخلايا العصبية من افرة القوة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

مواصفات من الخلايا العصبية الجلوتاميرجي الدماغ الانتهائي من خلايا الجذعية المحفزة

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

توجه الدوبامين العصبية التمايز من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

التقييم الوظيفي والمورفولوجية من الحجاب الحاجز تعصيب من قبل الحجابي موتور الخلايا العصبية

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

جيل بسيطة من ثقافة عالية الغلة المستحث الخلايا العصبية من الخلايا الليفية الجلد الكبار البشرية

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

أسلوب لإصابة الإنسان تمتد عالية السرعة التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا العصبية في شكل جيد 96

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

تحديد علامات سطح الخلية من الجذعية العصبية الأولية والخلايا السلف عن طريق وضع العلامات الأيضية من Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

في فيفو إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الغلية المقيمة في الخلايا العصبية المشتركة عن طريق الحقن داخل الدماغ من ناقلات الفيروسية

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D تحليل الحركية للتقييم الوظيفي في نموذج الفئران من عرق النسا الأعصاب سحق الإصابة

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...