Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

De auteurs willen de Imaging Facility te bedanken bij Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, voor ondersteuning en technisch advies. Wij zijn dankbaar voor de leden van het centrum voor het leven nano wetenschap voor nuttige discussie. Dit werk werd gedeeltelijk gesteund door een toelage van AriSLA (proef toelage 2016 "StressFUS") aan AR.

1. onderhoud van de menselijke iPSCs
<ol><li>
Bereiding van matrix gecoate platen
	<ol>
<li>Dooi één 5 mL flacon van matrijs (Zie de lijst van materialen) bij 4 °c 's nachts. De originele matrijs voorraden komen op verschillende voorraad concentraties en de hoeveelheid wordt gemaakt volgens de verdunningsfactor die op het gegevensblad wordt vermeld, specifiek voor de individuele partij. Het is belangrijk om de flacon en de buizen ijskoud te houden om vroegtijdige geleer van de matri...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

Dit protocol maakt het mogelijk om efficiënt te converteren menselijke iPSCs in spinale en craniale motor neuronen dankzij de buitenbaarmoederlijke expressie van Lineage-specifieke transcriptiefactoren. Deze transgenen worden afleidbaar door doxycycline en stabiel geïntegreerd in het genoom dankzij een piggyBac op transposon gebaseerde vector. In een gemengde populatie, zal een of meerdere exemplaren van de piggyBac vector willekeurig worden geïntegreerd in het genoom van de individuele cellen, het verhogen van het ri...

Motor neuron (MN) degeneratie speelt een oorzakelijke rol bij menselijke ziekten, zoals amyotrofische lateraal sclerose (ALS) en spinale spieratrofie (SMA). Het opzetten van geschikte in vitro Cell modelsystemen die de complexiteit van de menselijke MN recapituleren is een belangrijke stap in de richting van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zijn begiftigd met opmerkelijke plurilineage differentiatie eigenschappen, zijn nu afgeleid van een aantal patiënten die getroffen zijn door motor neuron ziekten1,2. Extra iPSC lijnen die pathogene mutaties in verband met MN ziekten zijn gegenereerd door het bewerken van genen, te beginnen van de controle "gezonde" pluripotente stamcellen3. Deze lijnen vertegenwoordigen nuttige hulpmiddelen voor in vitro Disease modellering en drug screening, op voorwaarde dat passende methoden voor iPSC differentiatie in MNs beschikbaar zijn. De grondgedachte achter de ontwikkeling van deze methode is om de wetenschappelijke gemeenschap geïnteresseerd in MN ziekten met een snelle en efficiënte differentiatie protocol die aanleiding geven tot volwassen functionele MNs te bieden. Het eerste voordeel van deze methode is het tijdsbestek van de uitvoering. Een ander relevant punt van sterkte komt uit de afschaffing van om het even welke reinigingsstap. Ten slotte kan het protocol worden gebruikt om twee verschillende populaties van motorische neuronen te genereren.
De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypen van MNs is bijzonder relevant voor het modelleren van MN ziekten. Niet alle MN subtypen zijn even kwetsbaar in ALS en SMA en het begin van de symptomen in verschillende motor units sterk van invloed op de prognose. In ALS, spinale begin met symptomen die beginnen in de bovenste en onderste ledematen leidt tot de dood in ongeveer 3-5 jaar4. Omgekeerd, bulbaire begin, te beginnen met degeneratie van craniale MNs, heeft een slechtste prognose. Bovendien is het percentage van bulbaire begin significant hoger bij patiënten met mutaties in de RNA-bindende eiwitten FUS en TDP-43 dan bij personen met SOD1 mutaties5. Bijna de totaliteit van alternatieve MN differentiatie protocollen is gebaseerd op de activiteit van retinoic zuur (RA), die een spinale karakter verleent aan differentiëren iPSCs6,7,8. Dit beperkt de mogelijkheid van het bestuderen van intrinsieke factoren, die kunnen worden beschermend in specifieke MN subtypen9,10.
In overeenstemming met een eerdere werk in de muis embryonale stamcellen11, hebben we onlangs aangetoond dat in de menselijke iPSCs buitenbaarmoederlijke expressie van Ngn2, Isl1 en LHX3 (Nil) induceert een spinale MN identiteit, terwijl Ngn2 en Isl1 plus PHOX2A (NIP) specificeren craniale MNs12. We hebben dus ontwikkelde een efficiënt protocol, wat leidt tot de productie van menselijke MNs begiftigd met functionele eigenschappen in een 12 dagen turnaround. Het doel van deze methode is om, in een korte tijd en zonder de noodzaak voor de reiniging (bijv. door FACS), cel populaties zeer verrijkt voor MNs met spinale of craniale identiteit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

We beschrijven hier een methode om functionele spinale en craniale motor neuronen te verkrijgen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Directe omzetting in motor neuron wordt verkregen door een buitenbaarmoederlijke expressie van alternatieve modules van transcriptiefactoren, namelijk Ngn2, Isl1 en Lhx3 (NIL) of Ngn2, Isl1 en Phox2a (NIP). NIHIL en NIP specificeren, respectievelijk, spinale en craniale motor neuron identiteit. Ons protocol begint met de generatie van gemodificeerde iPSC lijnen waarin nihil of NIP stabiel zijn geïntegreerd in het genoom via een piggyBac transposon vector. Expressie van de transgenen wordt vervolgens geïnduceerd door doxycycline en leidt, in 5 dagen, tot de omzetting van iPSCs in MN progenitoren. Latere rijping, voor 7 dagen, leidt tot homogene populaties van spinale of craniale MNs. Onze methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere protocollen: het is zeer snel en vereenvoudigd; het vereist geen virale infectie of verdere MN isolatie; het maakt het genereren van verschillende MN sub-populaties (spinale en craniale) met een opmerkelijke mate van rijping, zoals blijkt uit de mogelijkheid om treinen van actiepotentialen brand. Bovendien kan een groot aantal motor neuronen worden verkregen zonder zuivering van gemengde populaties. iPSC-afgeleide spinale en craniale motor neuronen kunnen worden gebruikt voor in vitro modellering van Amyotrofische laterale sclerose en andere neurodegeneratieve ziekten van de motor neuron. Homogene motor neuron populaties kunnen vertegenwoordigen een belangrijke bron voor cel type specifieke drug screenings.

Een schematische beschrijving van de differentiatie methode wordt weergegeven in Figuur 1. Human iPSCs (WT I lijn3) werden transfected met EpB-BSD-TT-Nil of EpB-BSD-TT-NIP, het genereren, op blasticidin selectie, stabiel en afleidbaar cel lijnen12, hierna aangeduid als iPSC-Nil en iPSC-NIP, respectievelijk. Onderscheidende cellen werden gekenmerkt voor de uitdrukking van de pluripotentie marker OCT4 en de pan-neuronale marker TUJ1. Immunokleuri...

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Dit protocol maakt een snelle en efficiënte omzetting van geïnduceerde pluripotente stamcellen in motorische neuronen met een wervelkolom of schedel identiteit, door buitenbaarmoederlijke expressie van transcriptiefactoren van afleidbaar piggyBac vectoren.

Conversie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) in functionele spinale en craniale motor neuronen met behulp van PiggyBac vectoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

De mogelijkheid van het genereren van verschillende subtypes van motorneuronen is vooral relevant voor het modelleren van moderne motorische neuron ziekten zoals amyotrofische laterale sclerose. Deze methode maakt het mogelijk de verwerving van celpopulaties die zeer stijf zijn voor motorische neuronen met een spinale of schedelidentiteit in een kort tijdsbestek en zonder de zuiveringsstap. De generatie van menselijke motorische neuronen uit geïnduceerde pluripotente stamcellen of iPSC onder vereenvoudigde kweekconditie kan het screenen van geneesmiddelen op motorische neuronziekten vergemakkelijken.De inducible expressie van het programmeren van transcriptie factor kan worden gebruikt om een andere cel types zoals neuronale, skeletspier, en gliacellen genereren uit een iPSC repository. Voor NIL en NIP iPSC lijn generatie, spoel de menselijke iPSC cultuur met calcium-en magnesium-vrije PBS voor de behandeling van de cellen met cel dissociatie reagens gedurende vijf tot 10 minuten op 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn begonnen los te maken van de kweekcontainer, gebruik dan een P1000 pipet om de cellen voorzichtig drie tot vier keer handmatig te scheiden.Breng de cellen naar een buis van 15 milliliter en breng het uiteindelijke volume tot 10 milliliter met verse PBS zonder calcium en magnesium voor het tellen. Verzamel een keer 10 tot de zesde cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in 100 microliters van buffer R van de elektroporatie kit. Voeg 4,5 microgram transposable vectorplasma DNA en 0,5 microgram van het piggyBac transposase plasma DNA toe voor transfectie.Transfecteer met het celelektroratiesysteem volgens de instructies van de fabrikant met de aangegeven parameters. Dan, zaad van de cellen in de menselijke iPSC medium aangevuld met 10 micromolar ROCK remmer Y-27632 in een zes millimeter matrix-gecoate schotel. Twee dagen na de transfectie, voeg 5 microgram per milliliter blasticidin aan de cultuur medium houden van de cellen in het antibioticum voor ten minste zeven tot 10 dagen om de cellen die niet hebben geïntegreerd de transgenes tegen te gaan.Aan het einde van de incubatie, handhaven van de stabiel getransfecteerde cellen als een gemengde populatie samengesteld uit cellen met verschillende aantallen transgenes en verschillende integratie sites of isoleren enkele klonen. Bereid een extra schotel om de effectieve expressie van de transgenen op een microgram per milliliter van doxycycline inductie te worden beoordeeld door RT-PCR met transgene-specifieke primers voor neurogenine-2 zoals eerder beschreven. In dit stadium moeten de voorraden van de nieuwe NIL- en NIP-iPSC-lijnen ook worden bevroren in vriesmedium voor menselijke IPSC's.Voor motorische neuron differentiatie, scheiden van de stabiel getransfecteerde celculturen met dissociatie reagens zoals aangetoond dat de cellen worden verzameld in een 15 milliliter buis met vijf volumes DMEM/F12 medium. Na centrifugatie, resuspend de cellen in menselijk iPSC medium aangevuld met micromolar ROCK remmer voor het tellen. Zaad de cellen op matrix-gecoate gerechten op een 6,25 keer 10 de vierde cellen per centimeter kwadraat dichtheid.Voor de komende twee dagen, vervang de supernatants met verse differentiatie medium aangevuld met doxycycline. Op dag twee, verander het medium naar neurobasale B27 medium aangevuld met gamma secretase remmer, vasculaire endotheelgroeifactor receptor remmer, en doxycyline. Op dag vijf, dissociate de cellen zoals aangetoond en resuspend de vrijstaande cellen in vier milliliter van DMEM/ F12 medium voor het tellen.Pipetting is belangrijk voor een volledige dissociatie van de cellen. Vries een aliquot van de motorneuron voorlopers in celvriezen medium volgens de instructies van de fabrikant en het verzamelen van de rest van de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in neuronale medium aangevuld met 10 micromolar ROCK remmer.Zaad de cellen op polyornithine laminine gecoate microslide ondersteunt met polymeer deksel slips op een keer 10 tot de vijfde cellen per centimeter kwadraat dichtheid. Op dag zes, zorgvuldig vervangen van het medium met verse neuronale medium zonder remmer voor cultuur tot downstream-analyse zonder het losmaken van de cellen van het steunoppervlak. Een uniforme uitdrukking van de pluripotentie marker octamer-bindende transcriptie factor vier of OTC4 kan worden waargenomen in differentiërende celculturen op dag nul in de afwezigheid van pan neuronale marker neuron-specifieke klasse drie beta-tubulin TUJ1 positiviteit.Op dag drie is een sterke daling van het aantal OCT4-positieve cellen duidelijk. Dat wordt weerspiegeld door de expressie van TUJ1 in een subset van differentiërende iPSC's. Op dag vijf wordt geen expressie van OCT4 waargenomen in de populatie die een consistente expressie van TUJ1 en een verworven neuronale morfologie laat zien.Immunostaining analyse zeven dagen na het replating van de motorneuron voorloper cellen onthult een uniforme expressie van TUJ1 en de volwassen motorneuron marker choline acetyltransferase. iPSC NIL-afgeleide neuronen met succes weer te geven spanning-afhankelijke natriumstromen en spanning-afhankelijke kaliumstromen. 80% van de iPSC NIL-afgeleide motorneuronen geklemd in de huidige klem modaliteit zijn in staat om spike treinen trigger wanneer geïnjecteerd met een huidige puls van plus 60 picoamps of meer.De minimale stroom die nodig is om repetitieve vuren in meer dan 50% van de opgenomen cellen uit te lokken is plus 40 picoamps met een piek drempel van ongeveer min 38 millivolt en een gemiddelde afvuren frequentie op plus 40 picoamps van ongeveer acht hertz, wat suggereert dat iPSC NIL-afgeleide spinale motorneuronen vertonen functionele eigenschappen typisch voor volwassen neuronen. Spinale en craniale motorneuronen kunnen worden afgeleid uit gecontroleerde iPSC's of IPSC's die pathologische mutaties dragen en dat deze cellen kunnen worden gebruikt als thesismodellen of voor drugscreening. Onze methode kan worden gebruikt om te helpen begrijpen waarom verschillende motorische neuron eenheden differentieel worden beïnvloed door ALS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Efficiënte Afleiding van de Mens Neuronale voorouders en neuronen van pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode voor hoge snelheid Stretch letsel van mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige neuronen in een 96-Wells-indeling

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identificeren van celoppervlak markeringen van primaire neurale stam en voorlopercellen door metabole labeling van Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo directe herprogrammering van ingezeten gliacellen in interneuronen door intracerebrale injectie van virale vectoren

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematic Analyse voor de functionele evaluatie in het Rattenmodel van Sciatische Zenuwbrekerletsel

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...