Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Les auteurs souhaitent remercier le centre d’imagerie de Center for Life nano science, Istituto Italiano di Tecnologia, pour son soutien et ses conseils techniques. Nous sommes reconnaissants aux membres du Center for Life nano science pour la discussion utile. Ce travail a été partiellement appuyé par une subvention d’AriSLA (subvention pilote 2016 «StressFUS») à l’AR.

1. maintenance des IPSC humains
<ol><li>
Préparation de plaques enrobées de matrices
	<ol>
<li>Décongeler un flacon de 5 mL de matrice (voir tableau des matériaux) à 4 ° c pendant la nuit. Les stocks matriciels originaux proviennent de différentes concentrations de stocks et les aliquotes sont effectués selon le facteur de dilution indiqué sur la fiche technique, spécifique au lot individuel. Il est important de garder le flacon et les tubes froids pour éviter une gélificat...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

Ce protocole permet de convertir efficacement les IPSC humains en neurones moteurs spinaux et crânien grâce à l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée. Ces transgènes sont inductibles par la doxycycline et sont intégrés de manière stable dans le génome grâce à un vecteur basé sur le transposon piggyBac. Dans une population mixte, une ou plusieurs copies du vecteur piggyBac seront intégrées au hasard dans le génome de cellules individuelles, augmentant ainsi le risque ...

La dégénérescence du neurone du moteur (MN) joue un rôle causal dans les maladies humaines telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et l’atrophie musculaire spinale (SMA). L’établissement de systèmes de modèles cellulaires in vitro adaptés qui récapitulent la complexité du MN humain est une étape importante vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Les cellules souches pluripotentes induites (ipscs), qui sont dotées de propriétés de différenciation plurilinéale remarquables, ont maintenant été dérivées d’un certain nombre de patients touchés par les maladies du neurone moteur1,2. D’autres lignées iPSC porteuses de mutations pathogènes associées à des maladies du MN ont été générées par l’édition génique, à partir de cellules souches pluripotentes de contrôle «saines»3. Ces lignes représentent des outils utiles pour la modélisation des maladies in vitro et le dépistage des médicaments, à condition que des méthodes appropriées pour la différenciation des iPSC dans les MNs soient disponibles. Le raisonnement qui sous-tend le développement de cette méthode est de fournir à la communauté scientifique intéressée par les maladies MN un protocole de différenciation rapide et efficace donnant naissance à des MNs fonctionnelles matures. Le premier avantage de cette méthode est son délai d’exécution. Un autre point de force pertinent vient de l’élimination de toute étape de purification. Enfin, le protocole peut être utilisé pour générer deux populations distinctes de neurones moteurs.
La possibilité de générer différents sous-types de MNs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies MN. Tous les sous-types de MN ne sont pas tout aussi vulnérables dans le SLA et le SMA et l’apparition des symptômes dans différentes unités motrices influe grandement sur le pronostic. Dans l’ALS, l’apparition spinale avec des symptômes commençant dans les membres supérieurs et inférieurs conduit à la mort dans environ 3-5 ans4. Inversement, l’apparition de bulbardes, commençant par la dégénérescence des MNs crânienne, a un pronostic pire. En outre, le pourcentage d’apparition de bulbardes est significativement plus élevé chez les patients avec des mutations dans les protéines de liaison de l’ARN FUS et TDP-43 que chez les individus avec des mutations SOD15. Presque la totalité des protocoles alternatifs de différenciation du mn repose sur l’activité de l’acide rétinoïque (RA), qui confère un caractère spinal à la différenciation des ipscs6,7,8. Cela limite la possibilité d’étudier des facteurs intrinsèques, qui pourraient être protecteurs dans des sous-types de mn spécifiques9,10.
En accord avec un travail antérieur dans les cellules souches embryonnaires de souris11, nous avons récemment montré que dans l’expression ectopique d’ipscs humaine de Ngn2, Isl1 et LHX3 (Nil) induit une identité de mn spinale, tandis que Ngn2 et Isl1 plus PHOX2A (NIP) spécifient le MNS crânien12. Nous avons donc développé un protocole efficace, conduisant à la production de MNs humaines dotées de propriétés fonctionnelles dans un délai de 12 jours. Le but de cette méthode est d’obtenir, dans un court laps de temps et sans la nécessité de purification (par exemple, par FACS), les populations cellulaires hautement enrichi pour les MNs avec l’identité spinale ou crânienne.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). La conversion directe en neurone moteur est obtenue par l’expression ectopique de modules alternatifs de facteurs de transcription, à savoir Ngn2, Isl1 et Lhx3 (NIL) ou Ngn2, Isl1 et Phox2a (NIP). NIL et NIP spécifient, respectivement, l’identité du neurone du moteur rachidien et crânien. Notre protocole commence par la génération de lignes iPSC modifiées dans lesquelles NIL ou NIP sont intégrés de manière stable dans le génome via un vecteur de transposon piggyBac. L’expression des transgènes est ensuite induite par la doxycycline et conduit, en 5 jours, à la conversion des IPSC en progéniteurs mn. La maturation subséquente, pendant 7 jours, conduit à des populations homogènes de MNs spinales ou crânienne. Notre méthode contient plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédents: il est extrêmement rapide et simplifié; il ne nécessite pas d’infection virale ou d’isolement MN supplémentaire; Il permet de générer différentes sous-populations de MN (spinale et crânienne) avec un degré remarquable de maturation, comme en témoigne la capacité de tirer des trains de potentiels d’action. En outre, un grand nombre de neurones moteurs peuvent être obtenus sans purification de populations mixtes. les neurones moteurs spinaux et crânien dérivés de l’iPSC peuvent être utilisés pour la modélisation in vitro de la sclérose latérale amyotrophique et d’autres maladies neurodégénératives du Neuron du moteur. Les populations homogènes de neurons moteurs peuvent représenter une ressource importante pour les dépistages de médicaments spécifiques au type cellulaire.

Une description schématique de la méthode de différenciation est illustrée à la figure 1. Les iPSCs humains (WT I Line3) ont été transfrés avec EPB-BSD-TT-Nil ou EPB-BSD-TT-NIP, générant, sur sélection de blasticidine, des lignées cellulaires stables et inductibles12, ci-après appelées IPSC-Nil et IPSC-NIP, respectivement. Les cellules différenciantes ont été caractérisées pour l’expression du marqueur de pluripotence OCT4 ...

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Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Ce protocole permet une conversion rapide et efficace des cellules souches pluripotentes induites en neurones moteurs avec une identité spinale ou crânienne, par l’expression ectopique des facteurs de transcription des vecteurs inductibles de piggyBac.

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

La possibilité de générer différents sous-types de neurones moteurs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies modernes des motoneurones telles que la sclérose latérale amyotrophique. Cette méthode permet l’acquisition de populations cellulaires très rigides pour les motoneurones ayant une identité spinale ou crânienne dans un court laps de temps et sans l’étape de purification. La génération de neurones moteurs humains à partir de cellules souches pluripotentes induites ou iPSC dans des conditions de culture simplifiées peut faciliter le dépistage des médicaments pour les maladies des motoneurones.L’expression inductible du facteur de transcription de programmation peut être utilisée pour générer d’autres types de cellules telles que les cellules neuronales, squelettiques et gliales à partir d’un référentiel iPSC. Pour la génération de lignées NIL et NIP iPSC, rincez la culture humaine de l’iPSC avec du PBS sans calcium et magnésium avant de traiter les cellules avec un réapprovisionnement en dissociation cellulaire pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour dissocier doucement manuellement les cellules trois à quatre fois.Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et porter le volume final jusqu’à 10 millilitres avec du PBS frais sans calcium et magnésium pour compter. Recueillir une fois 10 à la sixième cellule par centrifugation et résuspendre la pastille dans 100 microlitres de R tampon du kit d’électroporation. Ajouter 4,5 microgrammes d’ADN plasmatique vecteur transposable et 0,5 microgramme de l’ADN plasmatique transposase piggyBac pour la transfection.Transfect avec le système d’électroporation cellulaire selon les instructions du fabricant avec les paramètres indiqués. Ensuite, ensemencer les cellules dans le milieu iPSC humain complété par 10 inhibiteurs micromolaires ROCK Y-27632 dans un plat enduit de matrice de six millimètres. Deux jours après la transfection, ajouter 5 microgrammes par millilitre de blasticidine au milieu de culture en gardant les cellules dans l’antibiotique pendant au moins sept à dix jours pour contre-seler les cellules qui n’ont pas intégré les transgènes.À la fin de l’incubation, maintenir les cellules habilement transfectées comme une population mixte composée de cellules avec différents nombres de transgènes et de différents sites d’intégration ou isoler des clones simples. Préparer un plat supplémentaire pour permettre l’expression efficace des transgènes sur un microgramme par millilitre d’induction de doxycycline à évaluer par RT-PCR avec des amorces transgéniques spécifiques pour la neurogénine-2 comme décrit précédemment. À ce stade, les stocks des nouvelles lignées NIL et NIP iPSC devraient également être congelés dans un milieu de congélation pour les iPSC humains.Pour la différenciation des neurones moteurs, dissocier les cultures cellulaires stably transfected avec le réagent de dissociation comme démontré pour permettre aux cellules d’être rassemblées dans un tube de 15 millilitres contenant cinq volumes de DMEM/F12 moyen. Après centrifugation, résuspendez les cellules dans le milieu humain d’iPSC complété avec l’inhibiteur micromolar de ROCHE pour compter. Ensemencer les cellules sur des plats enduits de matrice à 6,25 fois 10 les quatrièmes cellules par centimètre de densité carrée.Pour les deux prochains jours, remplacer les supernatants par un milieu de différenciation frais complété par de la doxycycline. Le deuxième jour, changez le milieu au milieu b27 neurobasal complété avec l’inhibiteur gamma de sécréase, l’inhibiteur vasculaire de récepteur de facteur de croissance endothélial, et la doxycyline. Le cinquième jour, dissocier les cellules comme démontré et résuspendre les cellules détachées en quatre millilitres de DMEM/F12 moyen pour le comptage.Le pipetage est important pour une dissociation complète des cellules. Congeler un aliquot des progéniteurs de neurones moteurs dans le milieu de congélation cellulaire selon les instructions du fabricant et de recueillir le reste des cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille dans le milieu neuronal complété par 10 inhibiteurs micromolaires rock.Ensemencer les cellules sur des supports en microslide recouverts de laminine polyornithine avec des glissements de couverture polymère à une fois 10 à la cinquième cellule par centimètre de densité carrée. Le sixième jour, remplacez soigneusement le milieu par un milieu neuronal frais sans inhibiteur de la culture jusqu’à l’analyse en aval sans détacher les cellules de la surface de soutien. Une expression uniforme du facteur de transcription octamer-liant de marqueur de pluripotence quatre ou OTC4 peut être observée dans les cultures cellulaires différeciantes le jour zéro en l’absence de la positivité tuJ1 de neurone de marqueur neuronal pan-spécifique trois.Le troisième jour, une forte diminution du nombre de cellules OCT4 positives est évidente. Cela est reflété par l’expression de TUJ1 dans un sous-ensemble d’iPSCs différeciants. Au cinquième jour, aucune expression d’OCT4 n’est observée dans la population qui montre une expression cohérente de TUJ1 et une morphologie neuronale acquise.L’analyse d’immunostaining sept jours après replacage des cellules progénitrices de neurone moteur indique une expression uniforme de TUJ1 et du marqueur mature de neurone moteur choline acétyltransferase. Les neurones dérivés de nil d’iPSC affichent avec succès des courants de sodium voltage-dependent et des courants de potassium voltage-dependent. 80% des neurones moteurs dérivés de nil iPSC serrés dans la modalité actuelle de pince sont capables de déclencher des trains de pointe lorsqu’ils sont injectés avec une impulsion actuelle de plus de 60 picoamps ou plus.Le courant minimum requis pour obtenir des tirs répétitifs dans plus de 50% des cellules enregistrées est plus 40 picoamps avec un seuil de pointe d’environ moins 38 millivolts et une fréquence moyenne de tir à plus 40 picoamps d’environ huit hertz, ce qui suggère que les neurones moteurs rachidiens dérivés de l’iPSC NIL présentent des propriétés fonctionnelles typiques des neurones matures. Les neurones moteurs rachidiens et crâniens peuvent être dérivés d’iPSCs ou d’iPSC contrôlés porteurs de mutations pathologiques et que ces cellules peuvent être utilisées comme modèles de thèse ou pour le dépistage des médicaments. Notre méthode peut être utilisée pour aider à comprendre pourquoi différentes unités de neurones moteurs sont affectées différemment par la SLA.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recherche

Neurosciences

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

La spécification des neurones glutamatergiques télencéphaliques de cellules souches pluripotentes humaines

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Évaluation fonctionnelle et morphologique de membrane innervation par phrénique motoneurones

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

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PROCEDE de blessure extensibles haute vitesse de l’homme induite par des neurones de dérivés de cellules souches pluripotentes dans un Format 96 puits

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Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

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