Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Die Autoren danken der Imaging Facility at Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, für die Unterstützung und technische Beratung. Wir danken den Mitgliedern des Center for Life Nano Science für die hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Stipendium von AriSLA (Pilotstipendium 2016 "StressFUS") an AR unterstützt.

1. Wartung menschlicher iPSCs
<ol><li>
Zubereitung von matrix-beschichteten Platten
	<ol>
<li>Tauen Sie eine 5 mL Ampull-Ampull-Matrix (siehe Materialtabelle) über Nacht bei 4 ° C auf. Die ursprünglichen Matrixbestände kommen in unterschiedlichen Lagerkonzentrationen und Aliquots werden nach dem auf dem Datenblatt angegebenen Verdünnungsfaktor hergestellt, der für das einzelne Los spezifisch ist. Es ist wichtig, die Ampullen und Rohre eiskalt zu halten, um ein vorzeitiges Gelalte...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

Dieses Protokoll ermöglicht es, menschliche iPSCs dank der ektopischen Expression von linearpezifischen Transkriptionsfaktoren effizient in Wirbelsäulen-und Schädelmotorneuronen umzuwandeln. Diese Transgene sind durch Doxycyclin induzierbar und dank eines Transpokortvektors auf Sparkug stabil in das Genom integriert. In einer gemischten Population wird ein oder mehrere Exemplare des Huckepitschwein-Vektors nach dem Zufallsprinzip in das Genom einzelner Zellen integriert, was das Risiko von Veränderungen der Genominte...

Motor-Neuron (MN) Degeneration spielt eine ursächliche Rolle bei menschlichen Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) und der Wirbelsäulenmuskulären Atrophie (SMA). Die Etablierung geeigneter In-vitro-Zellmodellsysteme, die die Komplexität des menschlichen MN rekapitulieren, ist ein wichtiger Schritt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze. Ausgeführte pluripotente Stammzellen (iPSCs), die mit bemerkenswerten Plurilinage-Differenzierungseigenschaften ausgestattet sind, stammen inzwischen von einer Reihe von Patienten, die von motorischen Neuronenkrankheiten 1,2betroffen sind. Zusätzliche iPSC-Linien, die pathogene Mutationen im Zusammenhang mit MN-Erkrankungen tragen, wurden durch die Genbearbeitung erzeugt, angefangen von der Kontrolle "gesunder" pluripotenter Stammzellen 3. Diese Linien stellen nützliche Werkzeuge für die Modellierung von In-vitro-Krankheiten und das Arzneimittelscreening dar, vorausgesetzt, dass geeignete Methoden für die iPSC-Figierung in MNs zur Verfügung stehen. Die Begründung für die Entwicklung dieser Methode besteht darin, der an PN-Krankheiten interessierten wissenschaftlichen Gemeinschaft ein schnelles und effizientes Differenzierungsprotokoll zu bieten, das zu reifen funktionellen MNs führt. Der erste Vorteil dieser Methode ist der Zeitrahmen der Ausführung. Ein weiterer relevanter Punkt der Stärke ist die Beseitigung eines Reinigungsschrittes. Schließlich kann das Protokoll verwendet werden, um zwei verschiedene Populationen von motorischen Neuronen zu erzeugen.
Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von MNs zu erzeugen, ist besonders für die Modellierung von MN-Erkrankungen relevant. Nicht alle MN-Subtypen sind in ALS und SMA gleich anfällig und das Auftreten von Symptomen in verschiedenen Motoreinheiten beeinflusst die Prognose stark. Bei ALS führt der Wirbelsäuleneintritt mit Symptomen, die in der oberen und unteren Gliedmaßen beginnen, in etwa 3-5 Jahren 4 zum Tod. Umgekehrt hat der Bulbar-Auftakt, beginnend mit der Degeneration der Schädelmähne, eine schlechteste Prognose. Darüber hinaus ist der Anteil des Bulbar-Ansatzes bei Patienten mit Mutationen in den RNA-bindenden Proteinen FUS und TDP-43 signifikanthöherals bei Personen mit SOD1-Mutationen 5. Fast die Gesamtheit alternativer MN-Differenzierungsprotokolle beruht auf der Aktivität der Retinosäure (RA), die der Differenzierung von iPSCs6,7,8einenWirbelsäulencharakter verleiht. Dies schränkt die Möglichkeit ein, intrinsische Faktorenzuuntersuchen, die in bestimmten PN-Subtypen 9,10Schutz bieten könnten.
Im Einklang mit einer früheren Arbeit in der Maus embryonalen Stammzellen11, Wir haben vor kurzem gezeigt, dass in menschlichen iPSCs ectopischen Ausdruck von Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) induziert eine Wirbelsäulen-MN-Identität, während Ngn2 und Isl1 plus Phox2a (NIP) angeben,kranial MNs 12. Deshalb haben wir ein effizientes Protokoll entwickelt, das zur Produktion von menschlichen MNs führt, die in einem 12-tägigen Turnaround mit funktionalen Eigenschaften ausgestattet sind. Ziel dieser Methode ist es, in kurzer Zeit und ohne Reinigungsbedarf (z.B. durch FACS) Zellpopulationen zu erhalten, die für MNs mit Wirbelsäulen-oder Schädelidentität hoch angereichert sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

Wir beschreiben hier eine Methode, um funktionelle Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen aus vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erhalten. Die direkte Umwandlung in Motorneuron erfolgt durch die ektopische Expression alternativer Module von Transkriptionsfaktoren, nämlich Ngn2, Isl1 und Lhx3 (NIL) oder Ngn2, Isl1 und Phox2a (NIP). NIL und NIP geben jeweils die Identität des Wirbelsäulen-und Schädelmotors Neuron an. Unser Protokoll beginnt mit der Generierung von modifizierten iPSC-Leitungen, bei denen NIL oder NIP über einen PiggyBac-Transpospo-Vektor stabil in das Genom integriert sind. Die Expression der Transgene wird dann durch Doxycyclin induziert und führt in 5 Tagen zur Umwandlung von iPSCs in MN-Vorläufer. Die anschließende Reifung führt zu einer homogenen Population von Wirbelsäulen-oder Schädelmlassen. Unsere Methode hat gegenüber früheren Protokollen mehrere Vorteile: Sie ist extrem schnell und vereinfacht; Es erfordert keine Virusinfektion oder eine weitere MN-Isolierung; Es ermöglicht die Erzeugung von verschiedenen MN-Subpopulationen (Wirbelsäule und Schädelung) mit einem bemerkenswerten Reifungsgrad, wie die Fähigkeit zeigt, Züge von Aktionspotenzialen zu befeuern. Darüber hinaus kann eine große Anzahl von motorischen Neuronen ohne Reinigung von gemischten Populationen gewonnen werden. Die iPSC-abgeleiteten Wirbelsäulen-und Schädelmotor-Neuronen können für die In-vitro-Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose und anderer neurodegenerativer Erkrankungen des motorischen Neurons eingesetzt werden. Homogene motorische Neuronenpopulationen könnten eine wichtige Ressource für zelltypspezifische Arzneimittel-Screenings darstellen.

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode ist in Abbildung1 dargestellt. Die menschlichen iPSCs (WTIline 3) wurden mit epB-Bsd-TT-NIL oder epB-Bsd-TT-NIP transferiert, wodurch bei der Blasticidin-Auswahl stabile und induzierbare Zelllinien12erzeugt wurden, im Folgenden iPSC-NIL und iPSC-NIP genannt. Für die Expression des Pluripotenzmarkers OCT4 und des panneuronalen Markers TUJ1 wurden unterschiedliche Zellen charakterisiert....

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Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und effiziente Umwandlung von induzierten pluripotenten Stammzellen in motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen-oder Schädelidentität, indem es die Transkriptionsfaktoren von induzierbaren PiggyBac-Vektoren ausführt.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Die Möglichkeit, verschiedene Subtypen von motorischen Neuronen zu erzeugen, ist besonders relevant für die Modellierung moderner motorischer Neuronenerkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Zellpopulationen, die für motorische Neuronen mit einer Wirbelsäulen- oder Schädelidentität in kurzer Zeit und ohne Reinigungsschritt hochsteif sind. Die Erzeugung menschlicher motorischer Neuronen aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSC unter vereinfachter Kulturbedingung kann das Arzneimittelscreening auf motorische Neuronenerkrankungen erleichtern.Die induzierbare Expression des Programmiertranskriptionsfaktors kann verwendet werden, um weitere Zelltypen wie Neuronal, Skelettmuskel und Gliazellen aus einem iPSC-Repository zu generieren. Für die Nil- und NIP iPSC-Liniengenerierung spülen Sie die humane iPSC-Kultur mit calcium- und magnesiumfreiem PBS ab, bevor Sie die Zellen fünf bis zehn Minuten bei 37 Grad Celsius mit Zelldissoziationsreagenz behandeln. Wenn sich die Zellen vom Kulturcontainer zu lösen begonnen haben, verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die Zellen drei- bis viermal manuell zu trennen.Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und bringen Sie das Endvolumen bis zu 10 Milliliter mit frischem PBS ohne Kalzium und Magnesium zum Zählen. Sammeln Sie ein mal 10 bis die sechsten Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Puffer R aus dem Elektroporationskit wieder auf. Fügen Sie 4,5 Mikrogramm transponierbare Vektorplasma-DNA und 0,5 Mikrogramm der piggyBac-Transposase-Plasma-DNA für die Transfektion hinzu.Transfekt mit dem Zellelektroporationssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den angegebenen Parametern. Dann säen Sie die Zellen im humanen iPSC-Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Hemmer Y-27632 in einer sechs Millimeter Matrix-beschichteten Schale ergänzt. Zwei Tage nach der Transfektion, fügen Sie 5 Mikrogramm pro Milliliter pro Milliliter Blasticidin auf das Kulturmedium halten die Zellen im Antibiotikum für mindestens sieben bis zehn Tage, um die Zellen, die nicht integriert haben die Transgene gegenzuwählen.Am Ende der Inkubation die stabil transfizierten Zellen als gemischte Population, die aus Zellen mit unterschiedlicher Anzahl von Transgenen und verschiedenen Integrationsstellen besteht, zu erhalten oder einzelne Klone zu isolieren. Bereiten Sie eine zusätzliche Schale vor, damit die effektive Expression der Transgene auf ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin-Induktion von RT-PCR mit transgenspezifischen Primern für Neurogenin-2, wie zuvor beschrieben, bewertet werden kann. In diesem Stadium sollten die Bestände der neuartigen NIL- und NIP-iPSC-Linien auch im Gefriermedium für humane iPSCs eingefroren werden.Zur motorischen Neurondifferenzierung dissoziieren Sie die stabil transfizierten Zellkulturen mit Dissoziationsreagenz, wie gezeigt, um die Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr mit fünf Bänden DMEM/F12-Medium summieren zu können. Nach der Zentrifugation, resuspendieren Sie die Zellen im menschlichen iPSC Medium mit mikromolaren ROCK-Hemmer zum Zählen ergänzt. Säen Sie die Zellen auf Matrix-beschichteten Schalen mit einer 6,25 mal 10 die vierte Zelle pro Zentimeter quadratische Dichte.Für die nächsten zwei Tage die Überräube durch frisches Differenzierungsmedium ersetzen, das durch Doxycyclin ergänzt wird. Am zweiten Tag, ändern Sie das medium zu neurobasalen B27 Medium mit Gamma-Sekretase-Hemmer ergänzt, vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Hemmer, und Doxycylin. Am fünften Tag die Zellen wie gezeigt zu dissoziieren und die abgetrennten Zellen in vier MilliliterDM/F12-Medium zum Zählen wieder aufzusetzen.Pipettieren ist wichtig für eine vollständige Dissoziation der Zellen. Einfrieren eines Aliquotders der motorischen Neuronenvorläufer im Zellgefriermedium gemäß den Anweisungen des Herstellers und sammeln Sie den Rest der Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet im neuronalen Medium mit 10 mikromolaren ROCK-Hemmern auf.Samen die Zellen auf Polyornithin Laminin-beschichteten Mikroslide-Stützen mit Polymerabdeckung rutscht mit einem mal 10 bis die fünfte Zelle pro Zentimeter quadratische Dichte. Ersetzen Sie das Medium am sechsten Tag sorgfältig durch ein frisches neuronales Medium ohne Kulturinhibitor bis zur nachgeschalteten Analyse, ohne die Zellen von der Stützfläche zu lösen. Eine einheitliche Expression des Pluripotenzmarkers Octamer-bindender Transkriptionsfaktor vier oder OTC4 kann bei der Differenzierung von Zellkulturen am Tag Null beobachtet werden, wenn es keine panneuronale Marker-Neuron-spezifische Klasse drei Beta-Tubulin TUJ1-Positivität gibt.Am dritten Tag ist ein starker Rückgang der Anzahl der OCT4-positiven Zellen zu beobachten. Dies spiegelt sich in der Ausprägung von TUJ1 in einer Teilmenge differenzierender iPSCs wider. Am fünften Tag wird in der Population kein Ausdruck von OCT4 beobachtet, der eine konsistente Expression von TUJ1 und eine erworbene neuronale Morphologie zeigt.Immunostaining Analyse sieben Tage nach der Replatierung der motorischen Neuron Vorläuferzellen zeigt eine einheitliche Expression von TUJ1 und der reifen motorischen Neuronmarker Cholin Acetyltransferase. iPSC NIL-abgeleitete Neuronen zeigen erfolgreich spannungsabhängige Natriumströme und spannungsabhängige Kaliumströme an. 80% der iPSC NIL-abgeleiteten Motorneuronen, die in der aktuellen Klemmmodalität eingeklemmt sind, sind in der Lage, Spike-Züge auszulösen, wenn sie mit einem Stromimpuls von plus 60 Picoamps oder mehr injiziert werden.Der Minimale Strom, der erforderlich ist, um in mehr als 50% der aufgezeichneten Zellen ein repetitives Abfeuern auszulösen, beträgt plus 40 Picoamps mit einer Spitzenschwelle von etwa minus 38 Millivolt und einer durchschnittlichen Feuerfrequenz von plus 40 Picoamps von etwa acht Hertz, was darauf hindeutet, dass iPSC NIL-abgeleitete spinale Motorneuronen funktionelle Eigenschaften aufweisen, die typisch für reife Neuronen sind. Spinale und schädelmotorische Neuronen können aus kontrollierten iPSCs oder iPSCs abgeleitet werden, die pathologische Mutationen tragen und dass diese Zellen als Thesenmodelle oder für das Drogenscreening verwendet werden können. Unsere Methode kann verwendet werden, um zu verstehen, warum verschiedene motorische Neuroneneinheiten differential von ALS beeinflusst werden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-Umprogrammierung der Perizyten-abgeleiteten Zellen des erwachsenen menschlichen Gehirn in Neuronen induziert

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Methode für High-Speed Strecke Verletzungen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Neuronen in einem 96-Well-Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...