Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

המחברים רוצים להודות למתקן ההדמיה במרכז לחיים ננו מדע, המכון הפוליטכני איטלקית די Tecnologia, לתמיכה וייעוץ טכני. אנו אסירי תודה לחברי המרכז לחיים ננו מדע לדיון מועיל. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי מענק AriSLA (מענק הטייס 2016 "StressFUS") כדי AR.

1. תחזוקת הiPSCs האנושית
<ol><li>
הכנת צלחות מצופות מטריקס
	<ol>
<li>הפשרת בקבוקון אחד של 5 מ ל (ראה טבלת חומרים) ב -4 ° c בלילה. מניות המטריצה המקוריות מגיעות לריכוזים שונים של מניות, ובהתאם לפקטור הדילול המצוין בגליון הנתונים, ספציפי למגרש הבודדים. חשוב לשמור על המבחנה וצינורות קרח ק...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

פרוטוקול זה מאפשר להמיר ביעילות את iPSCs אנושי לתוך מנוע השדרה ואת הגולגולת נוירונים בזכות הביטוי החוץ רחמי של השושלת הספציפיים שעתוק גורמים. הטרנסגנים האלה הם inducible על ידי דוקסיציקלין ו משולבים באופן מובן בגנום הודות לטרנספבאק המבוסס על מוקטור. באוכלוסיה מעורבת, עותק אחד או כמה של וקטור הש?...

מוטוריים תא העצב (MN) ניוון משחק תפקיד סיבתי במחלות האדם כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ו ניוון שרירים השדרה (SMA). הקמת מערכות מודל לבניית תאים מחוץ לתחום, המתאימות למורכבות של האדם האנושי, היא צעד חשוב לקראת התפתחות גישות טיפוליות חדשות. המושרה בתאי גזע פלוריפוטנטי (iPSCs), אשר ניחן בתכונות בידול השושלת המדהימה pluripotent כבר נגזר ממספר מטופלים המושפעים על ידי מחלות תא מנוע1,2. קווי iPSC נוספים הנושאים מוטציות פתוגניים הקשורים מחלות MN נוצרו על ידי עריכת גנים, החל לשלוט "בריא" תאים גזע pluripotent3. קווים אלה מייצגים כלים שימושיים למידול מחלות חוץ גופית והקרנת סמים, בתנאי שהשיטות המתאימות לבידול iPSC לתוך MNs זמינים. הרציונל מאחורי הפיתוח של שיטה זו הוא לספק את הקהילה המדעית המעוניינים מחלות MN עם פרוטוקול בידול מהיר ויעיל ומעורר MNs פונקציונלי בוגרת. היתרון הראשון של שיטה זו הוא מסגרת ההוצאה להורג. עוד נקודה רלוונטית של חוזק באה מחיסול כל צעד טיהור. לבסוף, את הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי ליצור שתי אוכלוסיות נפרדות של נוירונים מוטוריים.
האפשרות של יצירת תת סוגים שונים של MNs רלוונטי במיוחד עבור דוגמנות של מחלות MN. לא כל תת-הסוגים של MN פגיעים באותה מידה ב-ALS ו-SMA, והתחלתה של סימפטומים ביחידות מוטוריות שונות משפיעים מאוד על הפרוגנוזה. ב ALS, התפרצות השדרה עם סימפטומים החל בגפיים העליונים והתחתונים מוביל למוות בערך 3-5 שנים4. לעומת זאת, התפרצות בולבר, החל מניוון של MNs הגולגולת, יש פרוגנוזה הגרוע ביותר. יתר על כן, אחוז התפרצות בולבר הוא גבוה באופן משמעותי בחולים עם מוטציות ב-RNA-כריכת חלבונים פוס ו TDP-43 מאשר אנשים עם מוטציות SOD15. כמעט מכלול הפרוטוקולים החלופיים MN בידול מסתמך על הפעילות של חומצה retinoic (RA), אשר מעניקה אופי השדרה כדי להבדיל iPSCs6,7,8. זה מגביל את האפשרות של ללמוד גורמים פנימיים, אשר יכול להיות מגונן על מסוימים מסוימים MN9,10.
בקנה אחד עם עבודה קודמת בתאי גזע מעובריים של העכבר11, הצגנו לאחרונה כי בביטוי האנושי iPSCs רחמי של Ngn2, Isl1 ו LHX3 (אפס) מעורר זהות בעמוד השדרה, בעוד Ngn2 ו Isl1 פלוס PHOX2A (ניפ) לציין הגולגולת MNs12. יש לנו ולכן פיתח פרוטוקול יעיל, המוביל לייצור של MNs האדם ניחן בתכונות פונקציונלי ב 12 יום הסבב. מטרת שיטה זו היא להשיג, במסגרת זמן קצר, ללא צורך לטיהור (למשל, על ידי FACS), אוכלוסיות תאים מועשר מאוד עבור MNs עם זהות השדרה או הגולגולת.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

אנו מתארים כאן שיטה להשגת נוירונים פונקציונלי והגולגולת מנוע הגולגולתית האדם בתאי גזע pluriפוטנטי (iPSCs). המרה ישירה לתוך תא מנוע מושגת על ידי ביטוי חוץ רחמי של מודולים חלופיים של גורמים שעתוק, כלומר Ngn2, Isl1 ו Lhx3 (אפס) או Ngn2, Isl1 ו Phox2a (ניפ). אפס ו ניפ לציין, בהתאמה, מנוע השדרה ואת הגולגולת זהות תא העצב. הפרוטוקול שלנו מתחיל עם הדור של הקווים iPSC שונה שבו אפס או ניפ משולבים באופן מובן בגנום באמצעות מעבר טרנספסון וקטור. ביטוי של הטרנסגנים נגרמת לאחר מכן על ידי דוקסיציקלין ומוביל, בתוך 5 ימים, כדי ההמרה של iPSCs לתוך MN ושלתי. ההבשלה הבאים, עבור 7 ימים, מוביל אוכלוסיות הומוגנית של MNs השדרה או הגולגולת. השיטה שלנו מחזיקה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים קודמים: הוא מהיר מאוד ופשוט יותר; היא אינה דורשת זיהום נגיפי או בידוד MN נוסף; היא מאפשרת יצירת משנה שונים MN (השדרה הגולגולת) עם תואר מדהים של התבגרות, כפי שניתן להדגים על ידי היכולת אש רכבות של פוטנציאל פעולה. יתר על כן, מספר גדול של נוירונים מוטוריים ניתן להשיג ללא טיהור מאוכלוסיות מעורבות. מנוע השדרה הנגזר של iPSC, הגולגולת והגולגולתית ניתן להשתמש בדוגמנות מבחנה של טרשת Amyotrophic לרוחב ומחלות ניווניות אחרות של תא העצב המנוע. אוכלוסיות מוטוריות הומוגניות עשויות לייצג משאב חשוב עבור סוג תא הקרנות סמים ספציפיות.

תיאור סכמטי של שיטת הבידול מוצג באיור 1. האדם iPSCs (WT I קו3) היו מזוהמים עם Epb-BSD-TT-אפס או Epb-BSD-TT-ניפ, הפקת, על בחירת בלטות, יציבה ושורות תא inducible12, להלן המכונה ipsc-אפס ו ipsc-ניפ, בהתאמה. תאים ההבחנה התאפיין בביטוי של סמן הפלאואון OCT4 ו-TUJ1 סמן הפאן-עצבי. ניתוח חיס...

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

פרוטוקול זה מאפשר המרה מהירה ויעילה של תאי גזע pluriפוטנטי לתוך נוירונים מוטוריים עם זהות בעמוד השדרה או הגולגולת, על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק מתוך וקטורים inducible,.

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

האפשרות לייצר תת-סוגים שונים של נוירונים מוטוריים רלוונטית במיוחד למודל של מחלות נוירונים מוטוריים מודרניים כגון טרשת נפוצה צידית אמיוטרופית. שיטה זו מאפשרת רכישה של אוכלוסיות תאים נוקשות מאוד עבור נוירונים מוטוריים עם זהות עמוד השדרה או הגולגולת בתוך פרק זמן קצר וללא שלב הטיהור. הדור של נוירונים מוטוריים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה או iPSC במצב תרבות פשוטה עשוי להקל על הקרנת סמים למחלות נוירון מוטורי.הביטוי הבלתי ניתן לעיכול של גורם שעתוק תכנות יכול לשמש ליצירת סוגי תאים אחרים כגון נוירונים, שרירי השלד ותאי גליה ממחזר iPSC. עבור NIL ו NIP iPSC קו הדור, לשטוף את התרבות האנושית iPSC עם PBS ללא סידן ומגנזיום לפני טיפול בתאים עם דיסוציאציה התא reagent במשך חמש עד 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים החלו להתנתק מהמיכל התרבותי, השתמש בפיפט P1000 כדי לנתק בעדינות את התאים שלוש עד ארבע פעמים.מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר ומביאים את הנפח הסופי עד 10 מיליליטר עם PBS טרי ללא סידן ומגנזיום לספירה. לאסוף פעם אחת 10 לתאים השישיים על ידי צנטריפוגה ו resuspend גלולה ב 100 microliters של מאגר R מתוך ערכת אלקטרופורציה. הוסף 4.5 מיקרוגרם של דנ"א פלזמה וקטורי transposable ו 0.5 מיקרוגרם של DNA פלזמה transposase piggyBac עבור transfection.לשנות עם מערכת אלקטרופוזיה התא בהתאם להוראות היצרן עם הפרמטרים שצוינו. לאחר מכן, זרע את התאים במדיום iPSC אנושי בתוספת 10 מעכבי רוק micromolar Y-27632 בצלחת מצופה מטריצה שישה מילימטר. יומיים לאחר ההשתנות, מוסיפים 5 מיקרוגרם למיליליטר של blasticidin למדיום התרבות שמירה על התאים באנטיביוטיקה לפחות שבעה עד 10 ימים כדי לבחור את התאים שלא שילבו את הטרנסג'נים.בסוף הדגירה, לשמור על התאים המרובים היטב כאוכלוסייה מעורבת המורכבת מתאים עם מספר שונה של טרנסג'נים ואתרי אינטגרציה שונים או לבודד שיבוטים בודדים. הכן מנה נוספת כדי לאפשר את הביטוי היעיל של המשדרים על מיקרוגרם אחד למיליליטר של אינדוקציה דוקסיציקלין להיות מוערך על ידי RT-PCR עם פריימרים ספציפיים לטרנסג'ין עבור neurogenin-2 כפי שתואר קודם לכן. בשלב זה, מניות של קווי NIL ו- NIP iPSC הרומן צריך גם להיות קפוא בינוני הקפאה עבור iPSCs אנושי.עבור בידול נוירון מוטורי, נתק את תרבות התאים המותנות היטב עם ניתוב מחדש כפי שהוכח כדי לאפשר לתאים להיאסף בצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה כרכים של מדיום DMEM/F12. לאחר צנטריפוגה, resuspend התאים במדיום iPSC אנושי בתוספת מעכבי רוק micromolar לספירה. זרע את התאים על כלים מצופים מטריצה ב 6.25 פעמים 10 התאים הרביעיים צפיפות בריבוע סנטימטר.ביומיים הבאים, החליפו את העל-טבעיים במדיום ההידול הטרי בתוספת דוקסיציקלין. ביום השני, לשנות את המדיום כדי neurobasal B27 בינוני בתוספת מעכב גמא secretase, מעכב קולטן גורם גדילה אנדותל כלי הדם, דוקסיצילין. ביום החמישי, נתק את התאים כפי שהוכח ולחץ מחדש על התאים המנותקים בארבעה מיליליטר של מדיום DMEM/F12 לספירה.Pipetting חשוב עבור דיסוציאציה מלאה של התאים. להקפיא aliquot של הנוירון המוטורי progenitors במדיום הקפאת תאים על פי הוראות היצרן ולאסוף את שאר התאים על ידי צנטריפוגה. תן מחדש את גלולה במדיום עצבי בתוספת 10 מעכבי רוק micromolar.זרע את התאים על microslide מצופה למינין פוליאורניתין תומך עם מחליק כיסוי פולימר באחת פעמים 10 לתאים החמישיים לצפיפות בריבוע סנטימטר. ביום השישי, בזהירות להחליף את המדיום עם מדיום עצבי טרי ללא מעכב לתרבות עד ניתוח במורד הזרם מבלי לנתק את התאים מפני השטח תמיכה. ביטוי אחיד של סמן pluripotency אוקטמר מחייב גורם שעתוק ארבע או OTC4 ניתן לראות בהבחנת תרבויות התא ביום אפס בהיעדר סמן עצבי פאן נוירון ספציפי מחלקה שלוש חיוביות בטא-tubulin TUJ1.ביום השלישי ניכרת ירידה חזקה במספר התאים החיוביים OCT4. זה משתקף על ידי הביטוי של TUJ1 בקבוצה משנה של iPSCs מנוידים. ביום החמישי, אין ביטוי של OCT4 נצפתה באוכלוסייה אשר מראה ביטוי עקבי של TUJ1 ומורפולוגיה עצבית נרכשת.ניתוח immunostaining שבעה ימים לאחר replating של תאי הנוירון המוטורי מגלה ביטוי אחיד של TUJ1 ואת סמן נוירון מוטורי בוגרת כולין אצטילטרנספראז. נוירונים שמקורם ב- IPSC NIL מציגים בהצלחה זרמי נתרן תלויי מתח וזרמים תלויי מתח של אשלגן. 80% מהנוירונים המוטוריים שמקורם ב-iPSC NIL מהודקים במודאליות המהדקת הנוכחית מסוגלים להפעיל רכבות ספייק כאשר מוזרק להם פולס נוכחי של פלוס 60 פיקואמפים או יותר.הזרם המינימלי הנדרש כדי להפיק ירי חוזר ביותר מ -50% מהתאים המוקלטים הוא בתוספת 40 פיקואמפים עם סף ספייק של מינוס 38 מילי-וולט ותדירות ירי ממוצעת של פלוס 40 פיקואמפ של כשמונה הרץ, מה שמרמז על כך שתאי עצב מוטוריים בעמוד השדרה שמקורם ב- IPSC NIL מציגים תכונות תפקודיות אופייניות לנוירונים בוגרים. נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה ובגולגולת יכולים להיגזר מ- iPSCs מבוקרים או iPSCs הנושאים מוטציות פתולוגיות ושתאים אלה יכולים לשמש מודלים של תזה או להקרנת סמים. השיטה שלנו יכולה לשמש כדי לעזור להבין מדוע יחידות נוירון מוטוריים שונים מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי ALS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

שושלת תכנות מחדש של תאי שמקורם בpericyte של המוח האנושי למבוגרים לנוירונים מושרה

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

בימוי דופאמין Neuron בידול מתאי גזע pluripotent האדם

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

הערכה תפקודית ומורפולוגי של סרעפת עצבוב על ידי סרעפת מנוע נוירונים

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

דור פשוטה של תרבות תשואה גבוהה של נוירונים המושרה מ Fibroblasts עור מבוגר

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

שיטת עבור מהירות גבוהה מתיחה פציעתו של האדם המושרה נוירונים נגזר תאי גזע Pluripotent בתבנית 96-ובכן

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...