Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare l'imaging Facility presso Center for Life Nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, per il supporto e la consulenza tecnica. Siamo grati ai membri del centro per la vita Nano Science per una discussione utile. Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione di AriSLA (Pilot Grant 2016 "StressFUS") all'AR.

1. manutenzione degli IPSC umani
<ol><li>
Preparazione di piastre rivestite in matrice
	<ol>
<li>Scongelare un flaconcino da 5 mL di matrice (vedere tabella dei materiali) a 4 ° c durante la notte. Le scorte di matrici originali sono disponibili in diverse concentrazioni di scorte e le aliquote sono effettuate in base al fattore di diluizione indicato sulla scheda tecnica, specifica per il lotto individuale. È importante tenere il flaconcino e i tubi ghiacciati per evitare la gelific...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

Questo protocollo consente di convertire efficacemente gli IPSC umani in neuroni motori spinali e cranici grazie all'espressione ectopica di fattori di trascrizione specifici per lignaggio. Questi transgeni sono inducibili dalla doxiciclina e stabilmente integrati nel genoma grazie a un vettore basato su trasposti piggyBac. In una popolazione mista, una o più copie del vettore piggyBac saranno integrate in modo casuale nel genoma delle singole cellule, aumentando il rischio di alterazioni dell'integrità del genoma. Ino...

La degenerazione del motoneurico (MN) svolge un ruolo causale nelle malattie umane come la sclerosi laterale amiotrofico (ALS) e l'atrofia muscolare spinale (SMA). La creazione di sistemi di modelli cellulari idonei in vitro che ricapitolano la complessità del MN umano è un passo importante verso lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs), che sono dotate di notevoli proprietà di differenziazione plurilineage, sono state ora derivate da un numero di pazienti affetti da malattie motoneuriche1,2. Ulteriori linee iPSC che trasportano mutazioni patogene associate a malattie MN sono state generate dall'editing genico, partendo dal controllo delle cellule staminali pluripotenti "sane"3. Queste linee rappresentano strumenti utili per la modellazione delle malattie in vitro e lo screening dei farmaci, purché siano disponibili metodi appropriati per la differenziazione iPSC in MNs. La logica alla base dello sviluppo di questo metodo è quella di fornire alla comunità scientifica interessata alle malattie MN un protocollo di differenziazione veloce ed efficiente che dà origine a MNs funzionali maturi. Il primo vantaggio di questo metodo è il suo lasso di tempo di esecuzione. Un altro punto di forza rilevante deriva dall'eliminazione di qualsiasi fase di purificazione. Infine, il protocollo può essere utilizzato per generare due distinte popolazioni di motoneuroni.
La possibilità di generare diversi sottotipi di MNs è particolarmente rilevante per la modellazione delle malattie MN. Non tutti i sottotipi MN sono ugualmente vulnerabili in ALS e SMA e l'insorgenza dei sintomi in diverse unità motoria influisce notevolmente sulla prognosi. Nella SLA, l'esordio spinale con sintomi che iniziano negli arti superiori e inferiori conduce alla morte in circa 3-5 anni4. Al contrario, l'insorgenza di bulbare, a cominciare dalla degenerazione di MNs craniali, ha una prognosi peggiore. Inoltre, la percentuale di insorgenza di bulbare è significativamente più alta nei pazienti con mutazioni nelle proteine leganti l'RNA FUS e TDP-43 rispetto agli individui con mutazioni SOD15. Quasi la totalità dei protocolli alternativi di differenziazione MN si basa sull'attività dell'acido retinoico (RA), che conferisce un carattere spinale per differenziare iPSCs6,7,8. Ciò limita la possibilità di studiare fattori intrinseci, che potrebbero essere protettivi in specifici sottotipi di MN9,10.
Coerentemente con un precedente lavoro in cellule staminali embrionali di topo11, abbiamo recentemente dimostrato che nell'espressione ectopica iPSCs umana di Ngn2, Isl1 e LHX3 (Nil) induce un'identità spinale MN, mentre Ngn2 e Isl1 più PHOX2A (NIP) specificano MNS craniali12. Abbiamo quindi sviluppato un protocollo efficiente, che porta alla produzione di MNs umani dotati di proprietà funzionali in un turnaround di 12 giorni. Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere, in un breve lasso di tempo e senza la necessità di purificazione (ad esempio, da FACS), popolazioni di cellule altamente arricchite per gli MNs con identità spinale o craniale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

Descriviamo qui un metodo per ottenere funzionali neuroni motori spinale e craniale da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC). La conversione diretta in motore neurone è ottenuta per espressione ectopica di moduli alternativi di fattori di trascrizione, vale a dire Ngn2, Isl1 e Lhx3 (NIL) o Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). NIL e NIP specificano, rispettivamente, l'identità del motore neuronale spinale e craniale. Il nostro protocollo inizia con la generazione di linee iPSC modificate in cui NIL o NIP sono stabilmente integrati nel genoma tramite un vettore di trasposizione piggyBac. L'espressione dei transgeni viene quindi indotta dalla doxiciclina e conduce, in 5 giorni, alla conversione degli iPSCs in progenitori MN. La successiva maturazione, per 7 giorni, conduce a popolazioni omogenee di MNs spinale o craniale. Il nostro metodo contiene diversi vantaggi rispetto ai protocolli precedenti: è estremamente rapido e semplificato; non richiede infezione virale o ulteriore isolamento MN; permette di generare diverse sottopopolazioni MN (spinali e craniche) con un notevole grado di maturazione, come dimostrato dalla capacità di sparare i treni dei potenziali d'azione. Inoltre, un gran numero di motoneuroni può essere ottenuto senza purificazione da popolazioni miste. i neuroni del motore spinale e craniale derivati da iPSC possono essere utilizzati per la modellazione in vitro della sclerosi laterale amiotrofico e di altre malattie neurodegenerative del Neuron motorio. Le popolazioni di neuroni omogenei del motore potrebbero rappresentare una risorsa importante per proiezioni di farmaci specifici per tipo di cellula.

Una descrizione schematica del metodo di differenziazione è illustrata nella Figura 1. Gli iPSCs umani (WT I linea3) sono stati trasfusati con EPB-BSD-TT-Nil o EPB-BSD-TT-NIP, generando, dopo la selezione di blasticidina, linee cellulari stabili e inducibili12, di seguito denominate IPSC-nil e IPSC-NIP, rispettivamente. Differenziando le cellule sono state caratterizzate per l'espressione del marcatore pluripotenza Oct4 e il marcatore Pan-neur...

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Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Questo protocollo consente la conversione rapida ed efficiente delle cellule staminali pluripotenti indotte in neuroni motori con un'identità spinale o cranica, mediante l'espressione ectopica dei fattori di trascrizione dai vettori inducibili piggyBac.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

La possibilità di generare diversi sottotipi di motoneuroni è particolarmente rilevante per modellare le moderne malattie dei motoneuroni come la sclerosi laterale amiotrofica. Questo metodo consente l'acquisizione di popolazioni cellulari altamente rigide per i motoneuroni con un'identità spinale o cranale in un breve lasso di tempo e senza la fase di purificazione. La generazione di motoneuroni umani da cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC in condizioni di coltura semplificate può facilitare lo screening farmacologico per le malattie dei motoneuroni.L'espressione induttibile del fattore di trascrizione di programmazione può essere utilizzata per generare altri tipi di cellule come neuronali, muscolo scheletrico e cellule gliali da un repository iPSC. Per la generazione di linee NIL e NIP iPSC, sciacquare la coltura iPSC umana con PBS privo di calcio e magnesio prima di trattare le cellule con reagente di dissociazione cellulare per cinque-10 minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule hanno iniziato a staccarsi dal contenitore di coltura, utilizzare una pipetta P1000 per dissociare delicatamente manualmente le cellule da tre a quattro volte.Trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri e portare il volume finale fino a 10 millilitri con PBS fresco senza calcio e magnesio per il conteggio. Raccogliere una per 10 alla sesta cella mediante centrifugazione e rimescolare il pellet in 100 microlitri del tampone R dal kit di elettroporazione. Aggiungere 4,5 microgrammi di DNA plasmatico vettoriale trasponibile e 0,5 microgrammi del DNA plasmatico transposasi piggyBac per la trasfezione.Trasfetto con il sistema di elettroporazione cellulare secondo le istruzioni del produttore con i parametri indicati. Quindi, seminare le cellule in mezzo iPSC umano integrato con 10 inibitori ROCK micromolari Y-27632 in un piatto rivestito a matrice di sei millimetri. Due giorni dopo la trasfezione, aggiungere 5 microgrammi per millilitro di blastidina al terreno di coltura mantenendo le cellule nell'antibiotico per almeno sette-10 giorni per controselezionare le cellule che non hanno integrato i transgeni.Alla fine dell'incubazione, mantenere le cellule macchiate stabilmente come una popolazione mista composta da cellule con un numero diverso di transgeni e diversi siti di integrazione o isolare singoli cloni. Preparare un piatto aggiuntivo per consentire l'espressione efficace dei transgeni su un microgrammo per millilitro di induzione di doxiciclina da valutare da RT-PCR con primer transgeni specifici per la neurogenina-2 come descritto in precedenza. In questa fase, anche le scorte delle nuove linee NIL e NIP iPSC dovrebbero essere congelate nel mezzo di congelamento per gli iPSC umani.Per la differenziazione dei motoneuroni, dissociare le colture cellulari trasfette stabilmente con reagente di dissociazione come dimostrato per consentire la raccolta delle cellule in un tubo da 15 millilitri contenente cinque volumi di mezzo DMEM/F12. Dopo la centrifugazione, rimescolare le cellule nel mezzo iPSC umano integrato con inibitore ROCK micromolare per il conteggio. Semina le cellule su piatti rivestiti a matrice a una densità quadrata di 6,25 per 10 le quattro cellule per centimetro.Per i prossimi due giorni, sostituire i supernaganti con un nuovo mezzo di differenziazione integrato con doxiciclina. Il secondo giorno, cambiare il mezzo medio-neurobasale B27 integrato con inibitore della gamma secretasi, inibitore del recettore del fattore di crescita endoteliale vascolare e doxiciclina. Il quinto giorno, dissociare le cellule come dimostrato e rimospendare le cellule staccate in quattro millilitri di mezzo DMEM / F12 per il conteggio.La pipettazione è importante per una completa dissociazione delle cellule. Congelare un'aliquota dei progenitori del motoneurone nel mezzo di congelamento cellulare secondo le istruzioni del produttore e raccogliere il resto delle cellule mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in mezzo neuronale integrato con 10 inibitori rock micromolari.Seminare le cellule su supporti in microslide rivestiti di poliornitina rivestita di laminina con coperchio polimerico scivola a una densità quadrata di una volta 10 alla quinta colonna per centimetro. Il sesto giorno, sostituire con cura il mezzo con un mezzo neuronale fresco senza inibitore per la coltura fino all'analisi a valle senza staccare le cellule dalla superficie di supporto. Un'espressione uniforme del fattore di trascrizione legante l'ottamero marcatore pluripotente quattro o OTC4 può essere osservata nelle colture cellulari differenzianti il giorno zero in assenza di positività tuJ1 di classe tre beta-tubulina specifica del marcatore pan neuronale.Il terzo giorno, è evidente una forte diminuzione del numero di cellule positive dell'OCT4. Ciò è rispecchiato dall'espressione di TUJ1 in un sottoinsieme di iPSC differenzianti. Al quinto giorno, non si osserva alcuna espressione di OCT4 nella popolazione che mostra un'espressione coerente del TUJ1 e una morfologia neuronale acquisita.L'analisi immunosottenimento sette giorni dopo la ripiattazione delle cellule progenitrici del motoneurone rivela un'espressione uniforme di TUJ1 e del marcatore del motoneurone maturo colina acetiltransferasi. I neuroni derivati dal NIL iPSC visualizzano con successo correnti di sodio dipendenti dalla tensione e correnti di potassio dipendenti dalla tensione. L'80% dei motoneuroni derivati dall'IPSC NIL fissati nella modalità di bloccaggio corrente sono in grado di innescare treni a spillo quando vengono iniettati con un impulso di corrente di più 60 picoamps o più.La corrente minima richiesta per provocare la cottura ripetitiva in oltre il 50% delle cellule registrate è più 40 picoamp con una soglia di picco di circa meno 38 millivolt e una frequenza media di cottura a più 40 picoambi di circa otto hertz, suggerendo che i motoneuroni spinali derivati dall'IPSC NIL mostrano proprietà funzionali tipiche dei neuroni maturi. I motoneuroni spinali e cranici possono essere derivati da iPSC controllati o iPSC che trasportano mutazioni patologiche e che queste cellule possono essere utilizzate come modelli di tesi o per lo screening farmacologico. Il nostro metodo può essere utilizzato per aiutare a capire perché diverse unità di motoneuroni sono influenzate in modo differenziato dalla SSL.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Ricerca

Neuroscienze

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