Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

著者は、サポートと技術的なアドバイスのための生命ナノサイエンス、Istituto イタリアディ Tecnologia のためのセンターでイメージング施設に感謝したいと思います。私たちは、有益な議論のための生命ナノ科学センターのメンバーに感謝しています。この作業は、AriSLA (パイロットグラント 2016 "StressFUS") から AR への助成金によって部分的にサポートされました。

1. 人間の iPSCs の維持
<ol><li>
マトリックスコーティングプレートの調製
	<ol>
<li>4° c のマトリクス (材料の表を参照) の1つの 5 mL バイアルを一晩解凍します。元のマトリックス株は異なるストック濃度で来て、アリコートは個々のロットに特異的なデータシートに示された希釈倍率に従って作られる。マトリックスの早期ゲル化を防ぐためにバイアルとチューブの氷?...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

このプロトコルは、系統特異的転写因子の異所性発現のおかげで、ヒト iPSCs を脊髄および頭蓋運動ニューロンに効率的に変換することを可能にする。これらのトランスジーンはドキシサイクリンによって誘導され、piggyBac のトランスポゾンベースのベクターのおかげでゲノムに安定的に組み込まれる。混合集団では、piggyBac ベクターの1つまたは複数のコピーが個々の細胞のゲノムにランダ?...

運動ニューロン (MN) 変性は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) や脊髄筋萎縮 (SMA) などのヒト疾患において原因となる役割を果たしている。ヒト MN の複雑性を不在するインビトロ細胞モデルシステムを確立することは、新しい治療アプローチの開発に向けた重要なステップである。顕著な plurilineage 分化特性を授けられている誘導多能性幹細胞 (iPSCs) は、現在、運動ニューロン疾患1,2によって影響を受ける多くの患者に由来している。MN 疾患に関連した病原性変異を運ぶ付加的な iPSC 線は、遺伝子編集によって生成されており、制御「健常な」多能性幹細胞3から始まる。これらの線は、インビトロ疾患モデリングおよび薬物スクリーニングのための有用なツールを表し、MNs への iPSC 分化のための適切な方法が利用可能であることを提供する。この方法の開発の背後にある理論的根拠は、成熟した機能 MNs を生み出す高速かつ効率的な分化プロトコルで MN 疾患に興味を持って科学的なコミュニティを提供することです。この方法の最初の利点は、実行の時間枠です。強度の別の関連するポイントは、任意の精製工程の排除から来ています。最後に、プロトコルは、運動ニューロンの2つの異なる集団を生成するために使用することができます。
MNs の異なるサブタイプを生成する可能性は、特に MN 疾患のモデル化に関連している。すべての MN 亜型は、ALS および SMA において同様に脆弱であり、異なる運動単位での症状の発症は、予後に大きく影響する。ALS において、上肢および下肢において始まる症状を伴う脊髄発症は、約3-5 年で死に至る4.逆に、球性発症は、頭蓋 MNs の変性から始まり、最悪の予後を有する。さらに、球性発症の割合は、SOD1 変異5を有する個体に比べて RNA 結合タンパク質 FUS および TDP-43 の突然変異を有する患者において有意に高い。代替 MN 分化プロトコールのほぼ全体は、レチノイン酸 (RA) の活性に依存しており、iPSCs6、7、8の鑑別に脊髄特性を付与する。これは、特定の MN 亜型9,10で保護することができる内因性因子を研究する可能性を制限します。
マウス胚性幹細胞11における以前の作業と一致して、我々は最近、ヒトの iPSCs 異所の Ngn2、Isl1 および LHX3 (NIL) が脊髄 MN 同一性を誘導するのに、Ngn2 および Isl1 プラス PHOX2A(ニップ) を頭蓋 MNs を指定することを示した。従って私達はそれ故に12日の転換の機能特性と恵まれた人間の MNs の生産に導く有効な議定書を開発した。この方法の目的は、短時間で、精製を必要とせずに (例えば、FACS によって) 得ることであり、細胞集団は脊髄または頭蓋の同一性を有する MNs に対して高度に濃縮された。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

ここではヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) から機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンを得る方法について述べる。運動ニューロンへの直接変換は、転写因子、すなわち Ngn2、Isl1 および Lhx3 (NIL) または Ngn2、Isl1 および Phox2a (ニップ) の代替モジュールの異所性発現によって得られる。NIL およびニップは、それぞれ、脊髄および頭蓋運動ニューロン同一性を指定する。私たちのプロトコルは、piggyBac トランスポゾンベクターを介して、NIL またはニップがゲノム内に安定して統合される修飾 iPSC 線の生成から始まる。トランスジーンの発現は、その後、ドキシサイクリンおよびリードによって誘発され、5日で、iPSCs の MN 前駆細胞への転化に移行する。その後の成熟は、7日間、脊椎または頭蓋の MNs の均質な集団をもたらす。私たちの方法は、以前のプロトコルよりもいくつかの利点を保持します: それは非常に迅速かつ単純化されます。これは、ウイルス感染またはさらに MN 分離を必要としません;これは、アクション電位の列車を発射する能力によって示されるように、成熟の顕著な程度で異なる MN 亜集団 (脊髄および頭蓋) を生成することができます。さらに、混合集団から精製することなく多数の運動ニューロンを得ることができる。iPSC 由来の脊髄および頭蓋運動ニューロンは、筋萎縮性側索硬化症および運動ニューロンの他の神経変性疾患のインビトロモデリングに使用することができる。同種運動ニューロン集団は、細胞型特異的薬物スクリーニングのための重要な資源を表すかもしれない。

この分化方法の概略説明を図 1に示す。ヒト iPSCs (WT I ライン3) は、EpB-BSD-TT-NIL または EpB-BSD-TT-ニップを用いてトランスフェクトし、ブラスチシジン選択に際して、安定かつ誘導的な細胞株12を、それぞれ iPSC-NIL および iPSC-ニップと称する。分化細胞は、多能性マーカー OCT4 と汎神経マーカー TUJ1 の発現について特徴付けられた。免疫?...

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

このプロトコルは、誘導性 piggyBac ベクターからの転写因子を異所的に発現することによって、脊髄または頭蓋の同一性を有する運動ニューロンへの誘発多能性幹細胞の迅速かつ効率的な変換を可能にする。

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

運動ニューロンの異なるサブタイプを生成する可能性は、筋萎縮性側索硬化症などの現代の運動ニューロン疾患のモデル化に特に関連しています。この方法により、短時間で精製工程を行わずに、脊髄または頭蓋の同一性を持つ運動ニューロンに対して非常に硬直性の細胞集団を取得することができます。簡便培養条件下で誘導多能性幹細胞またはiPSCからヒト運動ニューロンを生成することは、運動ニューロン疾患の薬物スクリーニングを容易にし得る。プログラミング転写因子の誘導発現は、iPSCリポジトリから神経細胞、骨格筋、グリア細胞などの別の細胞タイプを生成するために使用することができる。NILおよびNIP iPSCライン生成では、ヒトiPSC培養をカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSでリンスしてから、細胞解離試薬で細胞を摂氏37度で5~10分間処理します。細胞が培養容器から脱離し始めた場合、P1000ピペットを使用して細胞を3~4回軽く手動で解離します。細胞を15ミリリットルのチューブに移し、カルシウムとマグネシウムを数えずに新鮮なPBSで最終体積を最大10ミリリットルにします。遠心分離によって6番目の細胞に10回回収し、エレクトロポレーションキットから100マイクロリットルのバッファーRでペレットを再懸濁します。トランスポーザブルベクタープラズマDNA4.5マイクログラムと、トランスフェクション用ピギーババトランスポザーゼ血漿DNA 0.5マイクログラムを加えます。示されたパラメータを使用してメーカーの指示に従ってセルエレクトロポレーションシステムでトランスフェクト。次に、6ミリメートルマトリックスコーティング皿に10マイクロモルROCK阻害剤Y-27632を添加したヒトiPSC培地に細胞を播種します。トランスフェクションの2日後、抗生物質中の細胞を少なくとも7〜10日間保持する培養培地に、1ミリリットル当たり5マイクログラムのブラシシジンを加え、トランス遺伝子を統合していない細胞を対抗する。インキュベーションの終了時に、異なる数の遺伝子および異なる統合部位を有する細胞で構成される混合集団として安定したトランスフェクトされた細胞を維持するか、単一クローンを単一のクローンに分離する。先に述べたように、ニューロゲニン-2のトランスジーン特異的プライマーを用いたRT-PCRによって評価されるドキシサイクリン誘導の1ミリリットル当たり1マイクログラムのトランス遺伝子の効果的な発現を可能にするために、追加の皿を準備する。この段階では、新しいNILとNIP iPSCラインの在庫も、ヒトiPSC用の凍結培地で凍結する必要があります。運動ニューロン分化のために、DMEM/F12培地の5つの容積を含む15ミリリットル管に細胞を集めることができるように実証されるように解離試薬と安定的にトランスフェクトされた細胞培養物を解離する。遠心分離後、ヒトiPSC培地中の細胞を、カウント用のマイクロモルROCK阻害剤を補充した。マトリックスコーティングされた皿の上に細胞を6.25倍の10倍の4番目の細胞/センチメートル平方密度で播種します。次の2日間は、上清をドキシサイクリンを補充した新鮮な分化培地に置き換えます。2日目に、ガンマ分泌酵素阻害剤、血管内皮成長因子受容体阻害剤、及びドキシシリンを添加した神経基底B27培地に培地を変更する。5日目に、示されているように細胞を解離し、DMEM/F12培地の4ミリリットルで取り離された細胞をカウントします。ピペッティングは、細胞の完全な解離のために重要です。メーカーの指示に従って細胞凍結培地中の運動ニューロン前駆物質のアリコートを凍結し、遠心分離によって残りの細胞を収集する。10マイクロモルROCK阻害剤を添加した神経培地中のペレットを再懸濁する。ポリオルニチンラミニンコーティングされたマイクロスライドに細胞をシードし、ポリマーカバースリップを10倍から5分の5の細胞/センチメートル平方密度でカバーします。6日目には、細胞を支持表面から切り離すことなく下流分析まで培養のための阻害剤を含まない新鮮な神経培地に慎重に交換する。多能性マーカーオクタマー結合転写因子4またはOTC4の均一な発現は、汎ニューロンマーカーニューロン特異的クラス3βチューブリンTUJ1陽性がない場合にゼロ日目に分化細胞培養で観察することができる。3日目には、OCT4陽性細胞の数が強く減少することが明らかである。これは、区別する iPSC のサブセット内の TUJ1 の表現によってミラーリングされます。5日目には、TUJ1と後天的な神経形態の一貫した発現を示す集団ではOCT4の発現は認められていない。運動ニューロン前駆細胞の再めっき後7日後の免疫染色分析は、TUJ1と成熟した運動ニューロンマーカーコリンアセチルトランスファーーゼの均一な発現を明らかにする。iPSC NIL由来のニューロンは、電圧依存性ナトリウム電流と電圧依存性カリウム電流の表示に成功しました。現在のクランプモダリティでクランプされたiPSC NIL由来の運動ニューロンの80%は、プラス60ピコアンプ以上の電流パルスを注入するとスパイクトレインをトリガーすることができます。記録された細胞の50%以上で繰り返し発火するために必要な最小電流は、約マイナス38ミリボルトのスパイク閾値と約8ヘルツの40ピコアンプでの平均発火頻度を有する40ピコアンプをプラスし、iPSC NIL由来脊髄運動ニューロンが成熟ニューロンの典型的な機能的特性を示すことを示唆している。脊髄および頭蓋運動ニューロンは、病理学的突然変異を運ぶ制御されたiPSCまたはiPSCから導き出され、これらの細胞は、研究モデルまたは薬物スクリーニングのために使用することができる。この方法は、異なる運動ニューロンユニットがALSによって差し合いの影響を受ける理由を理解するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

人間の高速ストレッチ損傷法による 96 ウェル形式で多能性幹細胞由来神経細胞

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...