Name: conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Yazarlar, destek ve teknik tavsiyeler için Life nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia Center 'da Imaging tesisine teşekkür etmek istiyor. Biz yararlı tartışma için yaşam nano bilim merkezi üyelerine minnettarız. Bu çalışmanın kısmen AriSLA (pilot Grant 2016 "StressFUS") dan AR için bir hibe tarafından desteklenmektedir.

1. Insan iPSCs 'nin Bakımı
<ol><li>
Matris kaplı plakaların hazırlanması
	<ol>
<li>Çözme bir 5 mL matris şişe (bkz. malzeme tablosu) 4 °c gece. Orijinal matris stokları farklı stok konsantrasyonlarda gelir ve plakaya veri sayfasında belirtilen seyreltme faktörü göre yapılır, bireysel lot için özel. Matrisin erken jelini önlemek için şişe ve tüpler buz soğuk tutmak önemlidir. Buz üzerinde önceden soğutulmuş cryotubes içinde plakaya içine matris dağıtm...

<ol>
	<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons.">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).</li><li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+(iPSCs)+derived+motoneurons.">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models &amp; mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li><li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis.">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li><li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS/dementia.">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li><li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li><li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells.">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li><li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes.">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li><li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS.">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960 (2016).</li><li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration.">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity.">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li><li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector.">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li><li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications.">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li><li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells,+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases.">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li><li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors.">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li><li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons,+Skeletal+Myocytes,+and+Oligodendrocytes.">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li><li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission.">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li></ol>

Bu protokol, insan ıpscs 'yi, kemiğe özel transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifadesi sayesinde Spinal ve kranial motor nöronlara verimli bir şekilde dönüştürmeyi sağlar. Bu transgenler, doksisiklin ile indüklenebilir ve piggyBac transposon tabanlı vektörü sayesinde genomda stabil bir şekilde entegre edilir. Karma bir nüfusa göre, piggyBac vektörünün bir veya birkaç kopyası, tek hücrelerin genomuna rasgele entegre edilecek ve genom bütünlüğü değişimi riskini arttırır. Dahası, iPSC subkl...

Motor nöron (MN) dejenerasyonu amilotrofik lateral skleroz (ALS) ve spinal kas atrofi (SMA) gibi insan hastalıklarında etken rol oynar. İnsan MN karmaşıklığı özetlemek uygun in vitro hücre modeli sistemleri kurulması yeni terapötik yaklaşımlar gelişimine yönelik önemli bir adımdır. Belirgin plurilineage farklılaşma özellikleri ile donatılmış olan indüklenen pluripotent kök hücreleri (ıpscs), şimdi motor nöron hastalıkları etkilenen hastaların bir dizi türetilmiştir1,2. MN hastalıklarına ilişkili patojen mutasyonları taşıyan ek IPSC hatları, kontrol "sağlıklı" pluripotent kök hücreleri3' ten başlayarak gen düzenleme ile üretilir. Bu çizgiler in vitro hastalık modelleme ve ilaç taraması için yararlı araçları temsil eder, MNs içine IPSC farklılaşma için uygun yöntemler mevcuttur sağlanır. Bu yöntemin gelişiminin arkasındaki mantık, MN hastalıklarıyla ilgilenen bilimsel toplumu, Olgun fonksiyonel MNs 'ye yol veren hızlı ve verimli bir farklılaşma protokolüyle sağlamaktayız. Bu yöntemin ilk avantajı, yürütme zaman dilimi olur. Güç başka bir ilgili noktası herhangi bir arıtma adım eliminasyon gelir. Son olarak, protokol motor nöronların iki farklı nüfus oluşturmak için kullanılabilir.
MNs farklı alt türleri oluşturma olasılığı MN hastalıkları modelleme için özellikle ilgilidir. Tüm MN alt türleri ALS ve SMA 'da eşit derecede savunmasız değildir ve farklı motor ünitelerinde semptomların başlangıcı prognozu büyük ölçüde etkiler. ALS 'de, üst ve alt ekstremitelerde başlayan semptomlarla spinal başlangıçlar yaklaşık 3-5 yıl içinde ölüme yol açar4. Tersine, kraniyal MNS dejenerasyonu ile başlayan bulber başlangıcı, en kötü prognoz vardır. Dahası, RNA-bağlayıcı proteinleri FUS ve TDP-43 mutasyonları olan hastalarda SOD1 mutasyonları5olan bireylere göre, bulber başlangıcı yüzdesi önemli ölçüde daha yüksektir. Alternatif MN farklılaşma protokollerinin neredeyse bütünlüğü, ipscs6,7,8türevlerini ayırt etmek için omurilik karakterini gösteren retinoik asit (ra) aktivitesine dayanır. Bu spesifik MN alt türlerinden9,10koruyucu olabilir içsel faktörler, eğitim olasılığını sınırlar.
Fare embriyonik kök hücrelerinde bir önceki çalışma ile tutarlı11, son zamanlarda ınsan ıpscs ektopik ifade Ngn2, Isl1 ve LHX3 (NIL) BIR spinal MN kimlik indükler göstermiştir, Ngn2 ve Isl1 artı Phox2a (n) kranial MNS12belirtin. Bu nedenle, 12 gün boyunca işlevsel özelliklere sahip insan MNs üretimini sağlayan etkili bir protokol geliştirdik. Bu yöntemin amacı, kısa bir zaman diliminde ve arıtma (örneğin, FACS) gerek kalmadan elde etmektir, hücre nüfusu yüksek spinal veya kranial kimlik ile MNs için zenginleştirilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2004px;" width="2004">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:364px;">5-Bapta</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">A4926-1G</td>
			<td style="width:1289px;">chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML&#160;</td>
			<td>Cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CHAT</td>
			<td>EMD Millipore&#160;</td>
			<td>AB144P</td>
			<td>Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-goat Alexa Fluor 488&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A11055</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Oct4&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>611202</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Phox2b</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
			<td>sc-376997</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-rabbit Alexa Fluor 594&#160;</td>
			<td>Immunological Sciences</td>
			<td>IS-20152-1</td>
			<td>Secondary antibody used for immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-TUJ1&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T2200</td>
			<td>Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-566</td>
			<td>Serum free supplement for neuronal cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bambanker</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>NGE-BB02</td>
			<td>Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Brain-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203350</td>
			<td>Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td>Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clampex 10 software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Matrigel hESC-qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td style="width:1289px;">Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-710-1E</td>
			<td>Freezing medium for human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5146</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI powder</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine&#8211;thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPT</td>
			<td>AdipoGen</td>
			<td>AG-CR1-0016-M005</td>
			<td>Gamma secretase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>Reagent for gentle dissociation of human iPSCs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6421-500ML</td>
			<td>Basal medium for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Doxycycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891-1G&#160;</td>
			<td>Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DS2U&#160;</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>UWWC1-DS2U</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A Total RNA Kit&#160;</td>
			<td>Omega bio-tek</td>
			<td>R6834-02</td>
			<td>Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GDNF</td>
			<td>PreproTech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Glial-Derived Neurotrophic Factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gibco Episomal hiPSC Line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A18945</td>
			<td>Commercial human iPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td>An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td>Kit for gene expression analysis using real-time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5121&#160;</td>
			<td>Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K-Gluconate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-ascorbic acid</td>
			<td>LKT Laboratories</td>
			<td>A7210</td>
			<td>Used in cell culture as an antioxidant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11243217001</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&#160;iX83 FluoView1200</td>
			<td>Confocal microscope for acquisition of immunostaining images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mg-ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Medium&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50001</td>
			<td>Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multiclamp patch-clamp amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>700B</td>
			<td>Membrane currents recording system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na-GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71376</td>
			<td>chemicals for electrophysiological solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon 100 &#956;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK10096</td>
			<td>Cell electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Cell electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NutriStem-XF/FF&#160;</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Human iPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-8</td>
			<td>Used for cell fixation in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Promotes attachment and growth of neural cells in vitro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU5402</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0443-5MG</td>
			<td>Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol,&#160;t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Upright microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51VI</td>
			<td>Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632&#160; (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-333-M005&#160;</td>
			<td>Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;-Slide 8 Well&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>Support for high&#8211;end microscopic analysis of fixed cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

conversion of human induced pluripotent stem cells (ipscs) into functional spinal and cranial motor neurons using piggybac vectors

Burada insan indüklenen pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel omurilik ve kraniyal motor nöronları elde etmek için bir yöntem tarif (ıpscs). Motor nöron içine doğrudan dönüşüm transkripsiyon faktörleri alternatif modüller ektopik ifade ile elde edilir, yani Ngn2, Isl1 ve Lhx3 (NIL) veya Ngn2, Isl1 ve Phox2a (NSIP). NIL ve NıP sırasıyla spinal ve kraniyal motor nöron kimliğini belirtir. Protokollerimiz, NIP 'nin bir piggybac transpozon vektörü ile genomda stabil entegre edildiği değiştirilmiş IPSC hatları ile başlar. Transgenlerin ifadesi daha sonra doksisiklin ve yol açar, 5 gün içinde, ıpscs MN progenitors dönüşümüne. Sonraki olgunlaşma, 7 gün boyunca, spinal veya kranial MNs homojen nüfusa yol açar. Bizim yöntemi önceki protokoller üzerinde çeşitli avantajları tutar: son derece hızlı ve Basitleştirilmiş; viral enfeksiyon veya daha fazla MN yalıtım gerektirmez; farklı MN alt kitleleri (omurilik ve kranial) olgunlaşma dikkat çekici bir derece ile Üreten sağlar, eylem potansiyelleri trenler yangın yeteneği tarafından gösterilmiştir. Dahası, çok sayıda motor nöronları karışık nüfus arıtmadan elde edilebilir. IPSC-türev spinal ve kraniyal motor nöronlar Amilotrofik lateral skleroz ve motor nöron diğer nörodejeneratif hastalıkların in vitro modelleme için kullanılabilir. Homojen motor nöron nüfus hücre tipi spesifik ilaç gösterimleri için önemli bir kaynak temsil edebilir.

Şekil 1' de farklılaşma yönteminin şematik bir açıklaması gösterilir. İnsan ipscs (WT I Line3) EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP ile transfekte edildi, oluşturulan, Blasticidin seçimi üzerine, istikrarlı ve indüklenebilir hücre hatları12, bundan sonra IPSC-NIL ve IPSC-NIP olarak anılacaktır, sırasıyla. Farklılaşan hücreler pluripotency Marker OCT4 ve Pan-neuronal Marker TUJ1 ifadesi için karakterize edildi. İmmünosti...

Watch this Scientific Journal Video about Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors at JoVE.com

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Motor nöronların farklı alt tipleri üretme olasılığı özellikle amotrofik lateral skleroz gibi modern motor nöron hastalıklarının modelilmesi için önemlidir. Bu yöntem, kısa bir zaman diliminde ve arınma adımı olmadan spinal veya kranial kimliği olan motor nöronlar için son derece katı olan hücre popülasyonlarının edinimisağlar. Basitleştirilmiş kültür durumu altında indüklenen pluripotent kök hücrelerden veya iPSC insan motor nöronların üretimi motor nöron hastalıkları için ilaç tarama kolaylaştırabilir.Programlama transkripsiyon faktörü indüklenebilir ifade nöronal gibi başka bir hücre tipleri oluşturmak için kullanılabilir, iskelet kası, ve bir iPSC deposundan glial hücreler. NIL ve NIP iPSC hat üretimi için, 37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika hücre bölünmesi reaktifi ile hücreleri tedavi etmeden önce kalsiyum ve magnezyumiçermeyen PBS ile insan iPSC kültürünü durulayın. Hücreler kültür kabından çıkmaya başladığında, hücreleri elle üç ila dört kez ayırmak için p1000 pipetkullanın.Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve son hacmi 10 mililitreye kadar getirin ve taze PBS'yi kalsiyum ve magnezyum olmadan sayın. Santrifüj ile altıncı hücrelere bir kez 10 toplayın ve elektroporasyon kitinden 100 mikrolitre tampon R'de peleti yeniden askıya alın. Transpoze edilebilir vektör plazma DNA 4,5 mikrogram ve transfeksiyon için piggyBac transposase plazma DNA 0,5 mikrogram ekleyin.Transfect ile hücre elektroporasyon sistemi üreticinin talimatlarına göre belirtilen parametreleri. Daha sonra, insan iPSC orta hücreleri tohum altı milimetre matris kaplı çanak 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiştir. Transfeksiyondan iki gün sonra, transgenleri entegre etmemiş hücreleri seçmek için en az 7 ila 10 gün boyunca hücreleri antibiyotikte tutmak için kültür ortamına mililitre blastisdin başına 5 mikrogram ekleyin.Kuluçka sonunda, farklı sayıda transgen ve farklı entegrasyon alanlarına sahip hücrelerden oluşan karışık bir popülasyon olarak transfected hücreleri korumak veya tek klonları izole. Daha önce açıklandığı gibi nörojenin-2 için transgen-spesifik astarlar ile RT-PCR tarafından değerlendirilecek doksisiklin indüksiyon mililitre başına bir mikrogram üzerinde transgenlerin etkili ifade sağlamak için ek bir yemek hazırlayın. Bu aşamada, roman NIL ve NIP iPSC hatları stokları da insan iPSCs için dondurucu ortamda dondurulmuş olmalıdır.Motor nöron farklılaşması için, hücrelerin beş cilt DMEM/F12 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplanmasına izin vermek için gösterildiği gibi, stably transfected hücre kültürlerini ayrıştırın. Santrifüjden sonra, mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen insan iPSC ortamda hücreleri resuspend sayma için. Hücreleri matris kaplı tabaklarda 6,25 kat 10 santimetre karelik bir yoğunlukta tohumlayın.Önümüzdeki iki gün için, taze diferansiyasyon orta doksisiklin ile takviye supernatants değiştirin. Gün iki, gama sekretaz inhibitörü ile desteklenen nörobazal B27 orta orta değiştirmek, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör inhibitörü, ve doksisiklin. Beşinci gün, gösterildiği gibi hücreleri ayırın ve sayım için DMEM/F12 orta dört mililitre müstakil hücreleri yeniden askıya.Pipetleme hücrelerin tam bir dissociation için önemlidir. Üreticinin talimatlarına göre hücre dondurma ortamda motor nöron progenitors bir aliquot dondurma ve santrifüj ile hücrelerin geri kalanını toplamak. Nöronal ortamda pelet resuspend 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile takviye.Poliornitlamin kaplı mikroslide üzerindeki hücreleri, santimetre kare yoğunluğunda bir defadan 10'a kadar polimer kapak lı destekler. Altıncı gün, dikkatle destek yüzeyinden hücreleri ayırmadan aşağı analiz kadar kültür için inhibitör olmadan taze nöronal orta ile orta değiştirin. Pluripotency marker octamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü dört veya OTC4 tek tip bir ekspresyon pan nöronal marker nöron özgü sınıf üç beta-tubulin TUJ1 pozitifliği yokluğunda gün sıfır hücre kültürleri ayırt gözlenebilir.Üçüncü gün, OCT4-pozitif hücrelerin sayısında güçlü bir azalma belirgindir. Bu, TUJ1'in iPSC'leri ayırt eden bir alt kümesindeki ifadesiyle yansıtılır. Beşinci gün, TUJ1 tutarlı bir ifade ve edinsel nöronal morfoloji gösteren popülasyonda OCT4 hiçbir ifade gözlenmez.Immünoboyama analizi motor nöron progenitor hücrelerinin rekaplama yedi gün sonrası TUJ1 ve olgun motor nöron marker kolin asetiltransferaz tek tip bir ekspresyonu ortaya koymaktadır. iPSC NIL türetilmiş nöronlar voltaj bağımlı sodyum akımlarını ve voltaj bağımlı potasyum akımlarını başarıyla görüntüler. Mevcut kelepçe yönteminde kenetlenmiş iPSC NIL türetilmiş motor nöronların %80'i, artı 60 pikoamp veya daha fazla akım darbesi enjekte edildiğinde sivri trenleri tetikleyebilir.Kaydedilen hücrelerin %50'sinden fazlasında tekrarlayan ateşleme sağlamak için gereken minimum akım artı 40 pikoam, yaklaşık eksi 38 milivolt luk bir başak eşiği ve yaklaşık sekiz hertz'in 40 pikoamp'ında ortalama ateşleme sıklığına sahiptir ve bu da iPSC NIL kaynaklı spinal motor nöronların olgun nöronların tipik fonksiyonel özelliklerini sergilediğini düşündürmektedir. Spinal ve kranial motor nöronlar patolojik mutasyonlar taşıyan kontrollü iPSC'lerden veya iPSC'lerden elde edilebilir ve bu hücreler tez modeli olarak veya ilaç taraması için kullanılabilir. Yöntemimiz, farklı motor nöron ünitelerinin ALS'den neden farklı olarak etkilendiğini anlamamıza yardımcı olmak için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlarda bir 96-şey Format yöntemi için yüksek hızlı streç yaralanma insan indüklenen

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...