Name: in vivo inhibition of microrna to decrease tumor growth in mice
Uploaded: 2019-08-23T13:00:00
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Agradecemos a Raquel arocha Riesco por sua assistência com o tratamento e cuidado de camundongos. Agradecemos ao Dr. J. Blanco (Instituto Catalonian de química antecipada-CSIC) e ao Dr. e. mato (Institut de Reserca de l' Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Espanha) por gifting as células CMV-Firefly Luc-IRES-EGFP e Cal62-Luc, respectivamente.

A experimentação animal foi realizada em conformidade com o direito da Comunidade Europeia (86/609/CEE) e a lei espanhola (1201/2005), com aprovação do Comité de ética do Consejo superior de Investigaciones científicas (CSIC, Espanha).
1. inoculação do flanco de células e tratamento antagomiR intratumoral
<ol><li>Preparação de células
	<ol>
<li>Engenheiro de uma linha de células de câncer de tireóide humano Cal62 (KrasG12R e p53A161D mut...

<ol>
	<li>Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+Thyroid+Cancer+Incidence+and+Mortality+in+the+United+States.">Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).</li><li>Landa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+transcriptomic+hallmarks+of+poorly+differentiated+and+anaplastic+thyroid+cancers.">Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).</li><li>Gregory, R. I., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+and+cancer.">MicroRNA biogenesis and cancer.</a> Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).</li><li>Lin, S., Gregory, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+biogenesis+pathways+in+cancer.">MicroRNA biogenesis pathways in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).</li><li>Hammond, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+Deregulation+in+Anaplastic+Thyroid+Cancer+Biology.">MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology.</a> International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).</li><li>Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+Tumours:+Advances+in+the+molecular+pathogenesis+of+thyroid+cancer:+lessons+from+the+cancer+genome.">Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome.</a> European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).</li><li>Riesco-Eizaguirre, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-146b-3p/PAX8/NIS+Regulatory+Circuit+Modulates+the+Differentiation+Phenotype+and+Function+of+Thyroid+Cells+during+Carcinogenesis.">The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis.</a> Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).</li><li>Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-146b-5p+upregulates+migration+and+invasion+of+different+Papillary+Thyroid+Carcinoma+cells.">MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 16, 108 (2016).</li><li>Lee, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-222+and+microRNA-146b+are+tissue+and+circulating+biomarkers+of+recurrent+papillary+thyroid+cancer.">MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer.</a> Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-146b-5p+promotes+metastasis+and+induces+epithelial-mesenchymal+transition+in+thyroid+cancer+by+targeting+ZNRF3.+Cellular+Physiology+and+Biochemistry.">MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry.</a> International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).</li><li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-146b+promotes+PI3K/AKT+pathway+hyperactivation+and+thyroid+cancer+progression+by+targeting+PTEN.">MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN.</a> Oncogene. , (2018).</li><li>Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+microRNA+processing+by+DICER1+downregulation+endows+thyroid+cancer+with+increased+aggressiveness.">Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness.</a> Oncogene. , (2019).</li><li>Xing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+and+mechanisms+of+thyroid+cancer.">Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer.</a> Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).</li></ol>

Este artigo descreve um método para estudar a função in vivo de um miRNA a fim compreender melhor seu papel na iniciação e na progressão do tumor, e em seu potencial como um alvo terapêutico no cancro de tiróide. Os modelos do xenograft do tumor descritos aqui são baseados no uso das pilhas que podem ser controladas por seu sinal do bioluminescência, permitindo a medida do crescimento do tumor in vivo a influência de um tratamento. Além disso, descrevemos o uso de um tratamento baseado em miRNA para o câncer...

O câncer de tireóide é uma malignidade endócrina com uma incidência crescente, embora, em termos gerais, tenha um bom desfecho1. No entanto, alguns pacientes desenvolvem formas agressivas da doença que são intratáveis e as bases moleculares são pouco compreendidas2.
miRNAs são 22-nucleotídeo-longo não-codificando RNAs que regulam a expressão de gene em muitos tecidos, tipicamente pela ligação do par-base à 3 ' região untranslational (3 ' UTR) do mensageiro do alvo RNAs (mRNAs), provocando a degradação do mRNA ou a repressão translacional 3. º , 4. There está aumentando a evidência que demonstra que a desregulamentação da expressão de microRNA é uma indicação do cancro, porque estas moléculas modulam a sinalização proliferativa, a migração, a invasão e a metástase, e podem fornecer a resistência ao apoptose 5,6. Nos últimos anos, muitos estudos identificaram miRNAs como potenciais biomarcadores para diagnóstico de câncer e prognóstico, bem como alvos terapêuticos7, proporcionando uma nova dimensão à avaliação e tratamento do câncer.
miRNAs tomaram o estágio Center na Oncologia molecular humana como os excitadores chaves de neoplasma humanos8,9,10,11,12datiróide. Entre os miRNAs acima-regulados, miR-146B é altamente overexpressado em tumores Papillary do carcinoma do tiróide (PTC) e foi mostrado para aumentar significativamente a proliferação de pilha, e para ser associado com a agressividade e o prognóstico sombrio6, 12 anos de , 13 anos de , 14 anos de , 15. Além disso, miR-146B regula vários genes da tireóide envolvidos na diferenciação12, e também importantes genes supressores de tumor, como PTEN16 e DICER117. Apesar de sua importância na biologia do câncer, a terapia oncológica baseada em miRNA ainda está em seus estágios iniciais, e muito poucos estudos abordaram o câncer de tireóide-o mais frequente dos tumores endócrinos18. Aqui nós descrevemos um protocolo usando dois modelos diferentes do rato com os tumores humano-derivados, em que a administração de um miRNA-inibidor sintético (antagomiR) que inibe especificamente um miRNA celular pode obstruir o crescimento do tumor. Nós usamos primeiramente um modelo comum do xenograft, e a administração local do intratumorais de um antagomir diminuiu o crescimento do tumor medido como uma redução no bioluminescência16do tumor. Porque o estabelecimento de modelos robustos do rato que imita a progressão humana do tumor é essencial desenvolver aproximações terapêuticas originais, a implantação transplantação orthotopic do de tumores humanos preliminares é uma plataforma mais valiosa para a validação clínica de drogas novas do que modelos de implante subcutâneo. Assim, a fim de melhor avaliar o potencial terapêutico do antagomiR, utilizou-se um modelo de camundongo ortotópico com parto sistêmico na corrente sanguínea, obtendo os mesmos resultados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4464088</td>
			<td>In Vivo Ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DICER antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab14601</td>
			<td>IHQ: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>IVF3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System</td>
			<td>Caliper Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4464077</td>
			<td>In Vivo Ready</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92552</td>
			<td>WB: 1/2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTEN antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-7974</td>
			<td>WB: 1/1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Diluted in PBS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo inhibition of microrna to decrease tumor growth in mice

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica através de sua capacidade de destabilizar o mRNA e inibir a tradução de mRNAs alvo. Um número cada vez maior de estudos identificou miRNAs como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico do câncer, e também como alvos terapêuticos, acrescentando uma dimensão extra à avaliação e tratamento do câncer. No contexto do cancro de tiróide, os resultados do tumorigênese não somente das mutações em genes importantes, mas igualmente da superexpressão de muitos miRNAs. Assim, o papel do miRNAs no controle da expressão gênica da tireoide está evoluindo como um importante mecanismo de câncer. Nisto, nós apresentamos um protocolo para examinar os efeitos da entrega do Mirna-inibidor como uma modalidade terapêutica no cancro de tiróide usando o xenograft humano do tumor e os modelos transplantação orthotopic do do rato. Após a engenharia de células tumorais estáveis da tireóide expressando GFP e luciferase, as células são injetadas em camundongos nus para desenvolver tumores, que podem ser seguidos por bioluminescência. A inibição in vivo de um miRNA pode reduzir o crescimento do tumor e upregulate alvos do gene de miRNA. Este método pode ser utilizado para avaliar a importância de um determinado miRNA in vivo, além de identificar novos alvos terapêuticos.

Nós usamos dois modelos diferentes dos ratos para determinar se a neutralização de um miRNA poderia suprimir o crescimento do tumor. Conformemente, as pilhas humanas do tiróide Cal62-Luc do tumor foram injetadas por via subcutânea nos flancos de ratos nus para gerar um modelo do xenograph. Após duas semanas, os tumores foram estabelecidos e poderiam ser medidos com calipers. Nesse momento, os camundongos foram injetados intratumoralmente com o inibidor do miR-146B, ou um controle adequado, e o volume tumoral foi se...

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In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice

In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

Este protocolo descreve o xenograft e os modelos transplantação orthotopic do do rato do tumorigênese humano do tiróide como uma plataforma para testar tratamentos microRNA-baseados do inibidor. Esta abordagem é ideal para estudar a função de RNAs não codificantes e seu potencial como novos alvos terapêuticos.

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression through their ability to destabilize mRNA and inhibit translation of target mRNAs. An ...

Realizamos a primeira terapia, baseada em um inibidor de microRNA em um modelo de câncer de tireoide. Essas terapias em desenvolvimento mostram-se promissoras para o tratamento desta doença. Esse tipo de modelo ortotópico, utilizando uma rota sistêmica de entrega de tratamento, facilita a validação de um novo sistema de microRNA.Embora usemos um modelo ortotópico para implantar células cancerígenas da tireoide humana em tireoides de camundongos, esses modelos podem ser todos sistêmicos para outros tipos de câncer. Demonstrando o procedimento com Julia Ramirez-Moya e Adrian Acuna será Raquel Arocha Riesco. Ela é técnica do nosso instituto.Depois de estabelecer uma linha de células cancerígenas humanas CAL-62 incompletas, suspenda uma alíquota de 1 vezes 10 para a 6ª célula em 50 microliters de PBS a 4 graus celsius, e misture as células com um volume igual de matriz de membrana de porão. Carregue as células em uma seringa de 1 mililitro, equipada com uma agulha de meia polegada de 27 gage, e injete subcutâneamente 100 microliters da amostra no flanco esquerdo de um rato nu de válvula imunodeficente C de 6 semanas. Duas semanas após a injeção, adicione a solução de antagomiR ou tampão de tratamento controlado a 160 microliters de temperatura ambiente in vivo entregador em um tubo de 1 ponto 5 mililitro.E imediatamente vórtice a solução por 10 segundos para garantir a complexidade da mistura. Incubar a solução de tratamento por 30 minutos a 50 graus celsius, seguida de uma breve centrifugação em uma micro centrífuga. Em seguida, diluir o complexo de tratamento sedimentado seis vezes com PBS fresco e mistura completa.E injetar todo o volume de 200 microliteres do tratamento diretamente no tumor. Injete 50 microlitres de uma solução de substrato D-Luciferin de 40 miligramas por litro subcutânea 2 vezes por semana, em cada animal experimental. Certificando-se de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo após a anestesia isoflurane.Coloque o animal na câmara de um sistema de imagem de bioluminescência in vivo, e imagem o sinal de bioluminescência com o software de imagem in vivo de acordo com os protocolos padrão. Então analise o crescimento do tumor. Comparando ambos os tratamentos e determinando as diferenças de significância e crescimento utilizando um teste T.Para a inoculação de células tumorais ortotópicas da tireoide suspender uma alíquota de células CAL-62 em 5 microliters de PBS, e injetar subcutâneamente 100 microliters de analgésicos e 100 microliters de antibiótico em um rato nu válvula C de 7 semanas de idade. Após confirmar a falta de resposta ao dedo do dedo, coloque o animal sob um microscópio dissecando e desinfete o pescoço do animal com iodopovidona. Em seguida, faça uma incisão de aproximadamente 2 centímetros na pele, e desloque as glândulas salivares para expor o pescoço.Use fórceps de dissecção, e/ou tesoura, para dissecar os músculos da correia para expor a glândula traqueia e tireoide, e use uma seringa de 10 microliteres, para injetar o volume de 5 microliteres de células tumorais no lobule da tireoide direita, localizado ao lado da cartilagem cricóida. Quando todas as células forem entregues, reposicione as glândulas salivares e use suturas trançadas, revestidas e não absorvíveis para fechar a incisão. Em seguida, aplique iodopovidone na área da ferida e coloque o rato em uma manta termica com monitoramento até a recuperação completa.duas a três semanas após a injeção de células intratireóides, prepare a solução de tratamento como demonstrado, e entregue a solução por via intravenosa por injeção retro-orbital do seio venoso do animal portador de tumor da tireoide anesthetizado. Neste experimento representativo, o crescimento de tumores injetados intratumorally sem inibidor de microRNA 146B, foi significativamente suprimido em relação ao controle negativo. Níveis de expressão intratumoral de alguns marcadores de proliferação também foram observados em níveis baixos, em tumores tratados com antagomir, em comparação com tumores de controle.Além disso, a recuperação dos alvos do micro-RNA pode ser estudada através da análise do RNA extraído do tumor, ou proteína. Revelando coletivamente que a inibição in vivo de micro RNAs individuais é eficaz e pode ser explorada terapeuticamente para tratamentos de câncer de tireoide. A análise histológica dos tumores da tireoide estabelecidos em camundongos, como demonstrado, permite a coloração para as células epiteliais ao redor do tumor, revelando a arquitetura folículo da tireoide do tecido tumoral.Notavelmente, a injeção intravenosa do inibidor de microRNA 146B em camundongos, com um tumor estabelecido, resulta em uma diminuição significativa no volume do tumor em comparação com os animais tratados com controle. Além disso, a expressão do recém-descrito microRNA 146B alvo DICER1 no tumor primário, aumenta após o tratamento anti-micro-RNA 146B, ressaltando ainda mais o potencial da inibição da expressão indogenous micro-RNA e, portanto, a restauração de seus genes-alvo como uma terapia no câncer de tireoide. Essa técnica, e os resultados subsequentes da lipina, abrem a possibilidade de explorar novas terapias baseadas em RNAs não curantes para o tratamento do câncer de tireoide.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

In Vivo Model for Testing Effect of Hypoxia on Tumor Metastasis

No modelo in vivo para o ensaio do efeito de hipoxia em metástase tumoral

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic ...

Pesquisa do câncer

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Utilizing High Resolution Ultrasound to Monitor Tumor Onset and Growth in Genetically Engineered Pancreatic Cancer Models

Utilizando o ultra-som de alta resolução para o aparecimento de Tumor de Monitor e crescimento em modelos de câncer pancreático geneticamente modificados

The LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) mouse model represents an established and frequently used transgenic model to evaluate novel ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

Transferência de neutrophils tumor-associados manipulados em ratos do tumor-rolamento para estudar seu potencial angiogênico em vivo

The contribution of neutrophils to the regulation of tumorigenesis is getting increased attention. These cells are heterogeneous, and depending on the ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Um Modelo de Camundongo para Investigar o Papel de Fibroblastos Associados ao Câncer no Crescimento Tumoral

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...