Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

وتشكر المؤلفة كريستين بروبست (شركة لومينيكس) على جهودها في تطوير الأشكال السابقة من قالب تحليل البيانات، وكذلك الدكتورة هالي بوغسلي (شركة لومينيكس) والدكتور موريسي (شركة لومينيكس) على استعراض وتحرير المخطوطه.

ويعمل المؤلف من قبل شركة لومينيكس، صانع التصوير متعدد الأطياف ImageStream تدفق مقياس السيتومتر الذي تم استخدامه في هذا العمل.

وفي منشور صدر مؤخرا، أكد فيرما وآخرون على أهمية تطوير نظام يجمع بين ميزة الإنتاجية العالية لقياس التدفق والفوائد التخزينية للبيانات والصور لتحليل الصور35. وMIFC في المختبر MN الفحص الموصوفة في هذه الورقة يلبي هذا الاقتباس ولديه القدرة على التغلب على العديد من التحديات المذكورة أعلاه في المجهرية وتدفق أساليب قياس السيتومترية. ويبين البروتوكول الموصوف هنا أنه يمكن تقييم كل من السمية الخلوية والسمية الجينية باستخدام MIFC. إعداد العينات، تلطيخ الخلوية وجمع البيانات هي مباشرة ولكن هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي ينبغي أن تنفذ دائما. إضافة كلوريد البوتاسيوم (KCl) إلى الخلايا أمر بالغ الأهمية لتضخم الخلايا، وتوليد الفصل بين النوى الرئيسية. وهذا يضمن أن خوارزمية الإخفاء يمكن تحديد كافة النوى الفردية في BNCs وخلايا POLY (خلايا POLY) وهو ضروري للتعداد الخاصة بهم. بالإضافة إلى ذلك، يوفر KCL الفصل بين النوى وMN، وهو أمر ضروري لاخفاء MN دقيقة وتكميم. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام فورالين بعد إضافة KCl يمنع الخلايا من التسل أثناء الطرد المركزي. إضافة Cytochalasin B يسبب خلايا TK6 التي خضعت لأكثر من تقسيم نووي واحد لتكون كبيرة جدا. ونتيجة لذلك، يصبح السيتوبلازم هشًا ويمكن أن يُنفّذ إذا تم تنفيذ الطرد المركزي مباشرة بعد إضافة KCl. وعلاوة على ذلك، من المهم جدا إدخال Hoechst إلى العينة وفقا لعدد من الخلايا في العينة وليس وفقا لتركيز نهائي. على سبيل المثال، التركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل من Hoechst وصمة عار بشكل موحد عينة من 1 × 106 الخلايا ولكن قد لا وصمة عار كافية عينة تحتوي على 5 × 106 الخلايا ويمكن أن يؤدي إلى العديد من الخلايا مع نوى ملطخة بشكل خافت، مما يجعل التحليل من الصعب. من المهم أيضا أن نلاحظ أن Hoechst يمكن استبدالها بصبغة الحمض النووي الأخرى مثل DAPI إذا تم تجهيز MIFC مع الليزر الإثارة 405 نانومتر أو DRAQ5 إذا تم تجهيز MIFC مع 488 نانومتر و / أو 642nm ليزر الإثارة.... إذا تعديل وصمة عار النووية، فمن الأهمية بمكان لtitrate وصمة عار من أجل العثور على التركيز المناسب لقوة الليزر المطلوبة / المطلوبة.
عند جمع البيانات على MIFC من المهم تحديد حدود المنطقة المثلى لميزات RMS التدرج. وقد تتطلب الحدود المعروضة في هذا البروتوكول تعديلاً بسبب بعض الاختلافات الطفيفة بين صكوك اللجنة. إن تطبيق هذه الميزة أثناء جمع البيانات ضروري لضمان التقاط صور عالية التركيز. إذا كانت ملفات البيانات تحتوي على العديد من الصور غير الواضحة أو غير المركزة، فمن المحتمل أن خوارزميات الإخفاء في برنامج التحليل سوف تسلط الضوء بشكل غير صحيح على تلطيخ القطع الأثرية في المناطق غير الواضحة، مما يؤدي إلى عدد كبير من القطع الأثرية الإيجابية الزائفة التي يتم تسجيلها كـ MN. على الرغم من أن تقنيات معالجة الصور الموضحة هنا يمكن أن تكون صعبة، بمجرد تطوير قالب تحليل في برنامج MIFC، تسمح معالجة الدفعات بتحليل ملفات البيانات تلقائيًا، مما يلغي تدخل المستخدم وبالتالي، هداف التحيز. أيضا، إذا تم استخدام خط خلية غير خلايا TK6 لإجراء التصاق، سيكون من الضروري تعديل الأقنعة وحدود المنطقة حيث أن الخصائص المورفولوجية (مثل الحجم) للخلايا سوف تختلف عن خصائص خلايا TK6.
تظهر النتائج المعروضة هنا (الشكل5)زيادات كبيرة إحصائياً في الحث MN عند تعريض خلايا TK6 لجرعات مختلفة من ميتوميسين C وكولشيسين. ولوحظت زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر النـزم النووي مقارنة بضوابط المذيبات لعدة جرعات في كلتا الجماتين الكيميائيتين. وبالإضافة إلى ذلك، لم تسبب أي جرعة من مانيتول سمية خلايا أكثر من 30٪، ولا زيادة كبيرة إحصائيا في تواتر MN بالمقارنة مع ضوابط المذيبات، كما هو متوقع. البروتوكول الموصوف في هذه الورقة باستخدام MIFC لإجراء اختبار MN في المختبر يعطي النتائج المتوقعة من كل من المواد الكيميائية الرقابة الإيجابية والسلبية. من المهم جداً إجراء عدد من التجارب باستخدام كل من ضوابط المذيبات والمواد الكيميائية للرقابة السلبية لتطوير قيم خط الأساس لكل من تواتر MN وكذلك مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (CBPI). وفيما يتعلق بالسمية الجينية، تتحدد الزيادات الهامة إحصائياً في تردد الـ MN من خلال المقارنة مع ترددات الـ MN الأساسية التي يجب أن تكون معروفة بنوع الخلية المستخدمة. وبالإضافة إلى ذلك، تستند جميع حسابات السمية الخلوية إلى CBPI لعينات التحكم، وبالتالي، يجب أن تكون معدلات خط الأساس لخلايا MONO وBNCs وPOLY محددة كمياً في الضوابط.
وقد تم وصف العديد من القيود والمزايا لاستخدام MIFC في سياق الاستفادة من MN في العمل السابق29،32. وتتعلق القيود الرئيسية بانخفاض ترددات الـ MN عند مقارنتها بالفحص المجهري، وهو ما قد ينتج عن انعدام المرونة عند تنفيذ معايير التهديف في برنامج التحليل وكذلك عن العمق المحدود لمجال الـ MIFC. يمكن إنشاء أقنعة محيطة بشكل جيد لتحديد الدقيق للنوى الرئيسية ولكن MN التي يتم لمس (أو قريبة جدا من) النوى الرئيسية قد يتم التقاطها داخل قناع BNC. بالإضافة إلى ذلك، MN صغيرة جداً التي يمكن تسجيلها بسهولة بدلاً من ذلك باستخدام الفحص المجهري ربما غاب بشكل غير صحيح عند استخدام MIFC بسبب الحد الأدنى على معلمة المنطقة من قناع MN لتجنب تسجيل القطع الأثرية الصغيرة. بالإضافة إلى الصعوبات الموجودة في تحليل البيانات المستندة إلى الصور، بسبب تصميمها، تحصل MIFC على صور إسقاط ثنائية الأبعاد للأجسام الخلوية ثلاثية الأبعاد. وهذا يؤدي على الأرجح إلى التقاط بعض MN في عمق مختلف من التركيز أن MN الرئيسيتين اثنين، مما يجعلها تبدو قاتمة جدا وغير قابلة للتآكل باستخدام اخفاء. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يقيم جزء صغير من الحركة الوطنية وراء إحدى النوى الرئيسيتين، مما يجعل من المستحيل تصورها وتسجيلها. ولذلك، وبالنظر إلى هذه الصعوبات، ينبغي توخي الحذر عند تفسير الزيادات الكبيرة في تواتر النيوم بالجرعات المنخفضة.
على الرغم من أوجه القصور هذه، فإن طريقة MIFC الموصوفة هنا تقدم العديد من المزايا على تقنيات أخرى. واقترح Fenech وآخرون المعايير والمبادئ التوجيهية التي ينبغي مراعاتها عند وضع نظم ومنهجيات آلية للاختبارات MN36. وتشمل هذه، على سبيل المثال لا الحصر، التصور المباشر للنوى الرئيسية والسيتوبلازم، وتحديد تواتر MN من جرعات مختلفة من المادة الكيميائية أو العوامل التي يجري اختبارها والقدرة على تكميم المورفولوجيا وتحديد موقف جميع النوى وMN للتأكد من أنها داخل السيتوبلازم. وتبين هذه الورقة أن طريقة MIFC التي تم تطويرها لإجراء الاختبار MN في المختبر يرضي (أو يملك القدرة على الوفاء) هذه المعايير. على وجه التحديد، يمكن التقاط صور للنوى وMN بواسطة الليزر الفلورسنت في حين يمكن الحصول على الصور السيتوبلازمية باستخدام الصمام BF. يمكن تمييز صور الخلايا ذات المورفولوجيا النووية العادية تلقائيًا عن تلك الخلايا ذات المورفولوجيا غير النظامية باستخدام مزيج من الأقنعة والميزات المتقدمة. تظهر النتائج المقدمة للكولشيسين وميتوميسين C (الشكل 5) أنه يمكن تقييم كل من السمية الجينية والسمية الخلوية بجرعات مختلفة بالمقارنة مع ضوابط المذيبات، وأن ترددات MN الهامة إحصائياً تُلاحظ حيث يتم ملاحظة ترددات MN الهامة إحصائياً حيث المتوقع. وعلاوة على ذلك، يوصي المبدأ التوجيهي للاختبار 487 لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي بتسجيل 000 2 من هذه الـ 000 2 من الـ BNCs لكل تركيز اختباري لتقييم وجود السمية الجينية لتحديد السمية الجينية إلى جانب ما لا يقل عن 500 خلية لكل تركيز اختباري لتحديد السمية الخلوية9؛ هذا يمكن أن يستغرق أكثر من 1 ساعة باستخدام المجهرية اليدوية. يظهر البروتوكول والنتائج في هذه الورقة أنه تم التقاط ما متوسطه حوالي 6000 BNCs و 16000 خلية MONO و800 خلية بولي وسجل كل تركيز اختبار في حوالي 20 دقيقة. ويبرز المعدل السريع لاقتناء البيانات والأعداد العالية من الخلايا المرشحة التي سجلت في مثل هذا الوقت القصير ميزة هامة أخرى هي استخدام MIFC لإجراء اختبار MN في المختبر.
وفي حين أن النتائج المعروضة في هذه الورقة مشجعة، فإنها تمثل طريقة مبكرة لإثبات المفهوم. وينبغي أن يعقب هذا العمل تحقيق أكثر شمولاً لمجموعة كيميائية أكبر وأكثر تنوعاً تغطي فئات وآليات متعددة للسمية الجينية والسمية الخلوية مثل تلك التي اقترحها كيركلاند وآخرون37 تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة، وتقع خارج نطاق هذه الورقة ومع ذلك، فإن هذه الدراسات على نطاق أوسع توفر نظرة ثاقبة قيمة في قدرة الطريقة لتحديد موثوق بها العوامل السامة للجينوية ضعيفة. ولم تُصغر المنهجية المعروضة هنا بعد في شكل ميكروويل، مما سيتيح فحصاً أسرع وأكثر كفاءة عبر نطاق جرعة أكبر. وعلى هذا النحو، قد يكون الفحص الذي يستند إلى MIFC في المختبر والموجود هنا مناسباً لدراسات المتابعة المكثفة أو البحث في الممارسات المختبرية الجيدة. ومع ذلك، فإن الطريقة سوف تستمر في الأمثل والتحقق من صحتها، وتمتلك القدرة على السماح لمزيد من المرونة في الكشف عن الأحداث الكيميائية المحددة المتعلقة مورفولوجيا، مثل التعرض aneugen الذي يزيد من نسبة الخلايا مع النوى غير الدائرية التي لا تزال قابلة للتآكل38. وأخيراً، تتيح طريقة MIFC فرصة لإدخال علامات بيولوجية إضافية في اختبار MN (مثل تلطيخ kinetochore) لتوفير رؤية أكثر شمولاً لآلية الحث MN.

وقد تم تطوير البروتوكولات التي تستخدم كل من الفحص المجهري وقياس التدفق والنسخ الضوئي ويتم التحقق منها وتستخدم بشكل روتيني لأداء اختبار MN في المختبر6و7و8و9و10، 11،12،13،14. يستفيد الفحص المجهري من القدرة على التأكيد بصرياً أن MN مشروعة ولكنها تستغرق وقتاً طويلاً وعرضة للتباين بين الهدافين15. لمعالجة هذا، تم تطوير أساليب الفحص المجهري الآلي لمسح الشرائح والتقاط الصور من النوى وMN16،17،18،19،ولكن لا يمكن تصور السيتوبلازم، مما يجعلها من الصعب تحديد ما إذا كانت MN مرتبطة بالفعل بخلية معينة. وعلاوة على ذلك، تواجه هذه الأساليب صعوبات في تحديد الخلايا المتعددة النوى (POLY) (بما في ذلك الخلايا الثلاثية والرباعية) اللازمة لحساب السمية الخلوية عند استخدام Cyt-B9. طرق قياس التدفق الخلوي التي تم تطويرها لأداء التنظير MN توظيف الفلورة، فضلا عن كثافة التشتت إلى الأمام والجانب لتحديد السكان من كل من النوى وMN التي تم تحريرها من الخلية بعد lysis20،21 ،22. وهذا يسمح بالحصول على البيانات من عدة آلاف من الخلايا في بضع دقائق ويسمح بالتحليل الآلي23؛ ومع ذلك، فإن عدم القدرة على تصور الخلايا يجعل من المستحيل التأكد من أن الأحداث المسجلة حقيقية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التسين في غشاء الخلية يمنع استخدام Cyt-B وكذلك خلق تعليق يحتوي على حطام آخر مثل المجاميع الكروموسومية أو الأجسام المبرمجة وليس هناك طريقة للتمييز بين هذه من MN24.
وفي ضوء هذه القيود، يعتبر قياس تدفق التصوير المتعدد الأطياف (MIFC) نظاماً مثالياً لإجراء الفحص MN لأنه يجمع بين الصور الفلورية عالية الدقة للتنظير المجهري والمتانة الإحصائية وسرعة قياس التدفق الدقيق التقليدي. في MIFC، يتم إدخال جميع الخلايا في نظام fluidics ومن ثم تركز هيدروديناميا في وسط cuvette خلية تدفق. يتم إنجاز الإضاءة المتعامدة لجميع الخلايا من خلال استخدام الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) من الحقل الساطع، وهو ليزر مبعثر جانبي وليزر فلورسنت واحد (على الأقل). يتم التقاط الفوتونات الفلورية من قبل واحد من ثلاثة (20x أو 40x أو 60x) العدسات الموضوعية ذات الفتحة الرقمية العالية ثم تمر من خلال عنصر التحلل الطيفي. ثم يتم تركيز الفوتونات على كاميرا جهاز المقترنة بالشحن (CCD) للحصول على صور عالية الدقة لجميع الخلايا التي تمر عبر خلية التدفق. لتجنب عدم الوضوح أو الشرائط، تعمل اتفاقية مكافحة التصحر في وضع تكامل تأخير الوقت (TDI) الذي يتتبع الكائنات عن طريق نقل محتوى بكسل من صف إلى صف أسفل اتفاقية مكافحة التصحر في تزامن مع سرعة الخلية في التدفق. ثم يتم جمع معلومات البكسل من الصف الأخير من وحدات البكسل. يسمح التصوير TDI جنبا إلى جنب مع التحلل الطيفي ما يصل إلى 12 صورة (2 BF، 10 الفلورسنت) ليتم التقاطها في وقت واحد من جميع الخلايا التي تمر عبر خلية التدفق. يتم تخزين جميع الصور التي تم التقاطها في ملفات بيانات خاصة بالعين، مما يسمح بإجراء التحليل في أي وقت باستخدام برنامج تحليل البيانات MIFC. وأخيرا، تحتفظ ملفات البيانات بالصلة بين الصور الخلوية والنقاط على جميع المؤامرات ثنائية المتغيرات. وهذا يعني أنه يمكن تسليط الضوء على أي نقطة على مؤامرة ثنائية المتغيرات التقليدية وسيتم عرض الصور BF والفلورسنت المقابلةلها 25.
في الآونة الأخيرة، تم تطوير الأساليب القائمة على MIFC لإجراء اختبار MN لكل من قياس الدوسيد الإشعاعي الفرز26،27،28،29،30،31 والوراثية السموم32،33 اختبار. وقد أثبت هذا العمل أن الصور الخلوية للنوى الرئيسية، MN والسيتوبلازم يمكن تصويرها مع الإنتاجية أعلى من غيرها من الطرق26. يمكن تحديد جميع أنواع الخلايا المطلوبة للتحليل، بما في ذلك خلايا MONO، وBNCs (مع وبلا MN)، وخلايا POLY، تلقائيًا في برنامج تحليل البيانات MIFC، ويتم تنفيذ معايير التهديف التي وضعتها Fenech وآخرون من خلال استخدام خوارزميات رياضية مختلفة6،34. وأظهرت نتائج قياس الجرعات الأحيائية أن منحنيات معايرة استجابة الجرعة كانت مماثلة من حيث الحجم لتلك التي تم الحصول عليها من الأساليب الآلية الأخرى في المؤلفات عند التحديد الكمي لمعدل MN لكل BNC29. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال الأخيرة في علم السموم أن الصور من خلايا MONO، BNCs (مع وبدون MN) وخلايا POLY يمكن التقاطها تلقائيا، وتحديدها، وتصنيفها وتعدادها باستخدام MIFC. ومكّن تحليل البروتوكول والبيانات من حساب السمية الخلوية والسمية الجينية بعد تعريض خلاياTK6 لعدة خلايا من الكلاستوجين اتّباب 32 .
يصف البروتوكول المعروض في هذه الورقة طريقة لإجراء الاختبار MN في المختبر باستخدام MIFC. تتطلب تقنية معالجة العينة المستخدمة في هذا العمل أقل من 2 ساعة لمعالجة عينة واحدة وسهلة الأداء نسبياً بالمقارنة مع أساليب أخرى. تحليل البيانات في برنامج تحليل MIFC معقد، ولكن يمكن إجراء إنشاء قالب التحليل في غضون ساعات قليلة بعد الخطوات المبينة في هذه الورقة. وعلاوة على ذلك، بمجرد إنشاء القالب، يمكن تطبيقه تلقائيا على جميع البيانات التي تم جمعها دون أي عمل آخر. ويحدد البروتوكول جميع الخطوات اللازمة لتعريض خلايا TK6 للكلاستوجينات والأنوجينات، ويصف كيفية زراعة الخلايا ومعالجتها ووصمها، ويوضح كيفية الحصول على صور عالية الدقة باستخدام MIFC. وعلاوة على ذلك، توضح هذه الورقة أفضل الممارسات الحالية لتحليل البيانات في برامج MIFC لتحديد وتسجيل خلايا MONO وBNCs وخلايا POLY تلقائياً لأغراض حساب السمية الخلوية والسمية الجينية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

غالباً ما يستخدم الفحص في المختبر للنواة الدقيقة (MN) لتقييم السمية الخلوية والسمية الجينية ولكن تسجيل الفحص عن طريق الفحص المجهري اليدوي هو أمر شاق ويدخل عدم اليقين في النتائج بسبب التباين بين الهدافين. ولمعالجة ذلك، تم إدخال الفحص المجهري الآلي لمسح الشرائح وكذلك أساليب قياس التدفق التقليدي في محاولة لإزالة تحيز الهداف وتحسين الإنتاجية. ومع ذلك، هذه الأساليب لها قيودها المتأصلة الخاصة مثل عدم القدرة على تصور السيتوبلازم من الخلية وعدم التحقق من MN البصرية أو تخزين البيانات الصورة مع قياس التدفق الخلوي. وللتصوير المتعدد الأطياف (MIFC) القدرة على التغلب على هذه القيود. تجمع MIFC بين الصور الفلورية عالية الدقة للتنظير المجهري والمتانة الإحصائية وسرعة قياس التدفق التقليدي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تخزين جميع الصور التي تم جمعها في ملفات خاصة بالجرعة. تصف هذه الورقة البروتوكول الذي تم تطويره لتنفيذ إصدار مؤتمت بالكامل من اختبار MN على MIFC. تم توسيع خلايا TK6 اللمفاوية البشرية باستخدام محلول نقص التوتر (75 مل ككل)، ثابتة مع 4٪ فورمالين والمحتوى النووي كان ملطخا Hoechst 33342. تم تشغيل جميع العينات في تعليق على MIFC، مما يسمح بالحصول على صور عالية الدقة لجميع الأحداث الرئيسية المطلوبة للفحص (على سبيل المثال الخلايا binucleated مع وبدون MN وكذلك الخلايا mononucleated وpolynucleated). وقد تم تلقائياً تحديد الصور وتصنيفها وتعدادها في برنامج تحليل البيانات التابع لـ MIFC، مما يسمح بتسجيل السمية الخلوية والسمية الجينية آلياً. وتبين النتائج أن استخدام MIFC لإجراء اختبار MN في المختبر يسمح بالكشف عن زيادات كبيرة إحصائيا في تردد MN في عدة مستويات مختلفة من السمية الخلوية بالمقارنة مع ضوابط المذيبات بعد التعرض لخلايا TK6 إلى ميتوميسين C وكولشيسين، وأنه لا تلاحظ زيادات كبيرة في تردد MN بعد التعرض لمانيتول.

وتتيح طريقة التحليل المبينة في هذه الورقة تحديد وتسجيل الشركات الوطنية للبيانات تلقائياً، مع السمية الجينية أو بدونها، لحساب السمية الجينية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا تحديد خلايا MONO وPOLY تلقائيا وسجل لحساب السمية الخلوية. يتم تنفيذ معايير تسجيل النقاط المنشورة6و34 التي يجب الالتزام بها عند تسجيل هذه الأحداث في برنامج تحليل البيانات MIFC. وتشير النتائج المعروضة هنا إلى أنه يمكن الكشف عن زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر السمية الشمالية مع زيادة السمية الخلوية بعد تعرض خلايا TK6 اللمفاوية البشرية للمواد الكيميائية المعروفة التي تحفز MN (ميتوميسين C وكولشيسين). وقد ثبت نتائج مماثلة للمواد الكيميائية الإضافية التي تم اختبارها في منشور منفصل32. وبالإضافة إلى ذلك، تبين النتائج الناجمة عن استخدام مانيتول أنه يمكن أيضاً تحديد المواد الكيميائية غير المحفزة للMN بشكل صحيح باستخدام طريقة MIFC المبينة هنا. المعلمات الموضحة في البروتوكول لإنشاء كافة الأقنعة والميزات وحدود المنطقة من المرجح أن يكون لديك تعديل إذا تم استخدام أنواع الخلايا المختلفة (مثل خلايا الهامستر الصينية) لإجراء التقييم.
ويبين الشكل 3 أربعة أفرقة مختارة لتحديد المراكز الوطنية للإنشاء والقدرات (الشكل3ألف-3D). يظهر هنا رسم بياني يتيح اختيار الخلايا ذات النوى اثنين (الشكل3A)والمؤامرات ثنائية المتغيرات التي تمكن من اختيار BNCs مع التعميم مماثلة (الشكل3B)، والمناطق المماثلة والكثافات (الشكل3C ) وBNCs التي لديها جيدة منفصلة، والنوى غير متداخلة (الشكل3D) وفقا لcritieria التهديف6،34. الشكل 3 E يظهر BF وHoechst الصور وكذلك أقنعة BNC وMN تشير إلى أنه يمكن تحديد BNCs مع MN واحدة أو متعددة وتعدادها. وهذا يسمح بحساب السمية الجينية عن طريق تحديد معدل الـ BNCs الميكرونوي في عدد السكان النهائي من BNC. يظهر الشكل 4 تطبيق ميزة "عدد موضعي" باستخدام قناع POLY لتعريف الخلايا أحادية وثلاثية ورباعية. ويمكن بعد ذلك جمع عدد الخلايا الثلاثية ورباعية للحصولعلى العدد النهائي من خلايا POLY (الجدول 1). وهذا يمكّن من حساب السمية الخلوية باستخدام الصيغة الموضحة في البروتوكول. ولذلك، يمكن تقييم كل نقطة جرعة في التجربة من خلال كل من السمية الجينية ومعلمات السمية الخلوية.
ويبين الشكل 5 السمية الجينية وقيم السمية الخلوية للأنوجين كولشيسين، وميتوميسين C كلستوجين وللسيطرة السلبية، مانيتول. بالنسبة للكولشيسين (الشكل5ألف)فإن جرعات 0.02 إلى 0.05 ميكروغرام/مل تنتج زيادات كبيرة إحصائياً في تردد MN، تتراوح بين 1.28% إلى 2.44% على التوالي على التحكم في المذيبات (الجدول1). وفي حالة ميتوميسين جيم(الشكل 5باء)أنتجت الجرعتان العلويتان 0.4 و0.5 ميكروغرام/مل ترددات MN هامة إحصائياً بالمقارنة مع ضوابط المذيبات. وكانت ترددات الـ MN هذه 0.93 في المائة عند 0.4 ميكروغرام/مل و1.02في المائة عند 0.5 ميكروغرام/مل (الجدول 2). وأخيراً، بالنسبة لمانيتول (الشكل5جيم)،لا توجد جرعات تم اختبارها تؤدي إلى سمية مسيوية تزيد على 30 في المائة، كما أنها لم تنتج زيادات كبيرة في تواتر السمية المتعددة الجنسيات مقارنة بضوابط المذيبات، كما هو متوقع (الجدول3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> الشكل 1 إعدادات أداة MIFC. لقطة شاشة من إعدادات MIFC كما هو موضح في القسم الخطوة 7 من البروتوكول. (أ) وضع قوة الليزر 405 نانومتر إلى 10 مواطوات. (ب) وضع قنوات BF 1 و 9. (C) اختيار عدسة التكبير 60x الهدف. (D) تحديد أبطأ سرعة تدفق الذي يولد الصور مع أعلى دقة. (هـ)تحديد عدد الأحداث التي سيتم جمعها إلى 20,000. (F) النقر فوق الزر تحميل لبدء عملية تحميل العينة. (G) النقر فوق الزر اكتساب لبدء الحصول على الصور. (H) النقر فوق الزر إرجاع لإرجاع أي عينة غير مستخدمة. (I) scatterplot من نسبة العرض إلى الارتفاع BF مقابل منطقة BF لاختيار الخلايا المفردة. (ي) مبعثر من Hoechst التدرج RMS مقابل BF التدرج RMS لاختيار الخلايا المركزة. (K) الرسم البياني من كثافة Hoechst لاختيار الخلايا الإيجابية الحمض النووي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> الشكل 2 تحليل استراتيجية التجمع البرمجيات. لقطة شاشة لاستراتيجية التغرير الموصوفة في القسم 9 من البروتوكول. وتظهر المناطق بترتيب تسلسلي لتحديد الخلايا البينوكلية (المربع الأحمر)، وmicronuclei (المربع الأصفر)، والخلايا الأحادية والمتعددة النوى (المربع الأزرق). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> الشكل 3 تحديد وتسجيل الشركات الوطنية مع أو بدون MN. (أ) اختيار الخلايا التي تحتوي على اثنين من النوى متميزة. (ب) تحديد الخلايا البينوكلية (BNCs) التي تحتوي على اثنين من النوى الدائرية للغاية من خلال استخدام ميزة كثافة نسبة العرض إلى الارتفاع. (ج) اختيار BNCs التي لديها نوى مع مناطق مماثلة وكثافة. ويتم ذلك عن طريق حساب نسبة مساحة كل من النوى ونسبة نسبة العرض إلى الارتفاع لكل من النوى. (D) استخدام ميزات نسبة الشكل ونسبة العرض إلى الارتفاع لتحديد BNCs التي تحتوي على اثنين من النوى المنفصلة بشكل جيد. (E) ميزة "عدد النقاط" باستخدام قناع النواة الدقيقة (MN) مما يدل على أنه يمكن تعريف BNCs مع MN واحد أو متعدد وتعدادها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> الشكل 4 تحديد وتسجيل خلايا مونو وبولي. استخدام ميزة العد الموضعي لتحديد وتعداد الخلايا الأحادية والثلاثية وquadranucleated. قناع المكون 1 يسمح بتحديد الخلايا mononucleated (الصورة العليا). أقنعة المكون 1 إلى 3 يسمح بتحديد الخلايا trinucleated (الصورة الوسطى). أقنعة المكون 1 إلى 4 يسمح بتحديد الخلايا quadranucleated (الصورة السفلية). تم تعديل هذا الرقم من رودريغز 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> الشكل 5 التحديد الكمي للسمية الخلوية. السمية السيتومية كميا باستخدام مؤشر انتشار كتلة السيتوكينيسيس (الدوائر السوداء) والسمية الجينية كميا باستخدام النسبة المئوية من MN (قضبان واضحة) بعد التعرض 3 ح و 24 ح الانتعاش ل (أ) كولشيسين ، (ب) ميتوميسين C و ( ج)مانيتول. وتشير النجوم إلى زيادات كبيرة إحصائياً في تواتر النطاقات المتعددة الجنسيات مقارنة بالضوابط (اختبار تشي تربيع؛ *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). جميع الكميات هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة. تم تعديل هذا الرقم من رودريغز 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> الجدول 1: المعلمات المطلوبة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية الدقيقة) للكولشيسين. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> الجدول 2: Tانه المعلمات اللازمة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية micronuated) للميتوميسين C. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> الجدول 3: البارامترات المطلوبة لحساب السمية الخلوية (عدد الخلايا الأحادية وثنائية ومتعددة النوى) والسمية الجينية (عدد ونسبة الخلايا البينوكلية الدقيقة) للمانيتول. جميع الكميات المحسوبة هي متوسط اثنين من تكرار في كل نقطة جرعة.
الملحق 1: البروتوكول الكامل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الملحق 2: قائمة القناع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

الفحص في المختبر النواة الدقيقة هو وسيلة راسخة لتقييم السمية الجينية والسمية الخلوية ولكن تسجيل الفحص باستخدام الفحص المجهري اليدوي هو شاقة ويعاني من الذاتية وتقلب الهدافين. تصف هذه الورقة البروتوكول الذي تم تطويره لتنفيذ نسخة مؤتمتة بالكامل من الفحص باستخدام قياس تدفق التصوير متعدد الأطياف.

طريقة آلية لإجراء فحص النواة الدقيقة في المختبر باستخدام قياس تدفق تدفق التصوير متعدد الأطياف

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

يمكن لمقايسة النواة الدقيقة القائمة على تيار الصورة التغلب على العديد من القيود على أساليب مثل المجهر الآلي والتنظير التقليدي للتدفق ، بما في ذلك انخفاض الإنتاجية وعدم وجود تأكيد بصري للأحداث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن جميع الأحداث المطلوبة لتحديد السمية الجينية والسمية الخلوية يمكن تصويرها تلقائيًا وتحديدها وحصدها دون الحاجة إلى إنشاء شرائح مجهرية. بالنسبة لتعرض الخلايا لل clastogens و / أو aneugens ، أضف ملليمترًا واحدًا من المادة الكيميائية ذات الأهمية إلى سبع إلى ثماني مرات 10 إلى خامس الخلايا التجريبية في تسع ملليلترات من وسط ثقافة الخلية المناسبة في قارورة T25 ومليلتر واحد من الماء إلى ثقافات التحكم.احتضان القارورة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات قبل نقل الخلايا إلى واحد 15 ملليلتر البولي بروبلين أنبوب لكل قارورة. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 10 ملليلتر من الثقافة الطازجة المتوسطة لكل أنبوب للتبذر في قوارير ثقافة T25 جديدة. ثم إضافة 150 ميكرولترات من تركيز الأسهم من السيتشوالاسين B إلى كل قارورة لتحقيق تركيز نهائي من ثلاثة ميكروغرام لكل ملليلتر.1 - إعادة القارورة إلى الحاضنة لفترة انتعاش تعادل 1.5 إلى وقتين مضاعفين، على النحو الذي أوصت به المبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي. في نهاية فترة النقاهة، نقل الثقافات إلى أنابيب البولي بروبلين 15 ملليلتر الفردية للطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في خمسة ملليلتر من 75 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم. اخلط بلطف عن طريق الانعكاس ثلاث مرات وحضن العينات بأربع درجات مئوية لمدة سبع دقائق.في نهاية الحضانة، إضافة ملليلترين من أربعة في المئة formalin لكل عينة ومزيج بلطف مع ثلاثة انقلابات. إعادة العينات إلى أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق قبل جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. resuspend الكريات في 100 ميكرولترات من 4 في المئة formalin الطازجة لمدة 20 دقيقة.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا الثابتة في خمسة ملليلتر من العازلة غسل لكل أنبوب عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت الكريات في 100 ميكرولترات من غسيل العازلة لكل أنبوب. بعد ذلك، نقل العينات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية للعد على مقياس الهيموسيت. إضافة خمسة ميكرولترات من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر Hoechst 33342 لكل 1.0 × 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر و 10 ميكرولترات من 500 ميكروغرام لكل ملليلتر RNase لكل 100 ميكرولترات من عينة لكل أنبوب.بعد 30 دقيقة حضانة في 37 درجة مئوية وخمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون، وأجهزة الطرد المركزي العينات في الطرد المجهري وإزالة جميع ما عدا 30 ميكرولترات من المغرور من كل أنبوب. ثم إعادة تعليق العينات بعناية ، مع الحرص على عدم الحث على تشكيل فقاعة. إذا فقاعات لا تظهر عند إعادةpension، نفض الغبار بلطف الأنبوب لإزالتها.لتشغيل العينات بواسطة التصوير متعدد الأطياف تدفق عملية استئصال الدراجات، أولاً بدوره على الليزر 405 نانومتر وتعيين قوة الليزر إلى 10 ملليوات. تعطيل جميع أشعة الليزر الأخرى، بما في ذلك الجانب ليزر مبعثر، وتعيين brightfield إلى القنوات الأولى والتاسعة. تأكد من أن شريط تمرير التكبير تم تعيينه إلى 60x، وأنه تم تحديد وضع الحساسية العالية، وأن القنوات واحد و7 و 9 فقط تظهر في معرض الصور.انقر فوق رسم مبعثر وحدد كل السكان والمنطقة M01 على محور س. حدد نسبة العرض إلى الارتفاع M01 على محور Y وانقر فوق منطقة مربعة لرسم منطقة حول الخلايا المفردة. اسم هذه المنطقة خلايا واحدة وانقر بزر الماوس الأيمن على مؤامرة لتحديد المناطق.قم بتمييز منطقة الخلايا المفردة ثم تغيير إحداثيات X إلى 100 و 900 و إحداثيات ص إلى 0.75 و إحداثيات واحدة. تعيين المعلمات الامتلاك وتحديد اسم الملف والمجلد الوجهة. ثم قم بتغيير عدد الأحداث إلى 20,000، حدد السكان إيجابية الحمض النووي، وتشغيل العينة الأولى.لفتح ملف بيانات في IDEAS، انقر فوق بدء التحليل لبدء تشغيل معالج الملفات المفتوحة، واستعرض لتحديد ملف الصورة الأولية المطلوب. ثم انقر فوق التالي وتصفح لخلية binucleated في معرض الصور. لإنشاء قناع، انقر لتحديد الصورة ذات الاهتمام ثم افتح علامة التبويب التحليل.انقر فوق أقنعة وجديدة و دالة لتحديد LevelSet. ضمن قناع، حدد M07 وقناع المستوى الأوسط وقم بتعيين مقياس تفاصيل الكنتوري إلى ثلاثة. ثم انقر فوق موافق مرتين.لنقطة تركيز ميزات عدد الخلايا الثنائية، افتح علامة التبويب تحليل وحدد الميزات و الجديدة. بالنسبة لنوع الميزة، حدد عدد النقاط الموضعية. بالنسبة إلى Mask، حدد القناع النهائي، وقم بتعيين التصل إلى أربعة، ثم قم بتغيير الاسم إلى Spot Count BNC ثم انقر فوق موافق ثم إغلاق لحساب قيم المعالم.بالنسبة إلى مدرج تكراري لعد الخلايا الموضعية، انقر فوق مدرج التكراري وحدد غير apoptopic كسكان أصليين. بالنسبة إلى ميزة المحور X، حدد عدد Spot Count BNC وانقر فوق OK ومنطقة خطية، ثم ارسم منطقة عبر Bim Two ثم قم بتسمية هذه المنطقة 2N. لإنشاء قناع نية صغيرة، حدد خلية تحلل تحتوي على نية صغيرة من معرض الصور، ثم افتح أقنعة في علامة التبويب تحليل.لإنشاء قناع تعريف موضعي واحد، انقر فوق جديد و دالة، ثم حدد Spot. تأكد من تحديد زر الاختيار الساطع، وحدد M07 تحت القناع. تعيين نسبة خلفية Spot إلى الخلية والحد الأدنى نصف القطر إلى اثنين وتعيين نصف القطر الأقصى إلى ستة.انقر فوق موافق و موافق لإضافة القناع إلى القائمة على اليسار، ثم انقر فوق جديد لإنشاء قناع آخر. انقر فوق قناة M07 سبوت السابعة اثنين مشرق اثنين قناع اثنين وانقر فوق السهم لأسفل لإضافته إلى تعريف القناع وانقر على المشغلين و وون لا. انقر فوق السهم لأسفل لإضافة قناع نطاق متوسع إلى تعريف القناع.لإنشاء قناع اضمام متعدد النواة، انقر فوق تحليل وأقنعة وجديدة و دالة. ضمن الدالة، حدد النطاق. ضمن قناع، حدد تمدد مستجمعات المياه تعيين M07 Channel07، الأوسط، ثلاثة، اثنين، وقم بتعيين الصورة لعرضها على القناة 07.تعيين قيم المساحة الدنيا والقصوى إلى 135 و5000 على التوالي، وتعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى لنسبة العرض إلى الارتفاع إلى 0.4 و واحد، على التوالي. انقر فوق موافق وفي حقل الاسم، قم بتغيير النص لقراءة قناع بولي، ثم انقر فوق موافق و إغلاق. لإنشاء طريقة عرض مخصصة، انقر فوق الزر خصائص معرض الصور، وافتح علامة التبويب "مركبات"، ثم انقر فوق جديد.تحت الاسم، أدخل القناة 01 إلى القناة 07. انقر فوق إضافة صورة، وتحت صورة، حدد القناة 01 وقم بتعيين النسبة المئوية إلى 100. انقر فوق إضافة صورة مرة أخرى، وتحت الصورة، حدد القناة 07 وقم بتعيين النسبة المئوية إلى 100.انقر فوق علامة التبويب عرض، انقر فوق جديد، وتحت الاسم، أدخل أقنعة BNC و MN. ثم انقر فوق إضافة عمود، وتحت نوع الصورة، حدد القناة 01 وتحت قناع، حدد بلا. انقر فوق إضافة عمود، وتحت نوع الصورة، حدد القناة 07، وتحت قناع، حدد بلا.انقر فوق إضافة عمود، وانقر فوق زر الاختيار المركب، ثم انقر فوق "موافق" لإكمال العرض المخصص. انقر فوق القائمة المنسدلة عرض ثم انقر فوق طريقة العرض أقنعة BNC و MN. انقر فوق الزر إظهار إخفاء الأقنعة.تعداد الأحداث الرئيسية، افتح علامة التبويب تقارير، ثم انقر فوق تعريف تقرير الإحصائيات، ثم في النافذة الجديدة، انقر فوق إضافة أعمدة. لإضافة إحصائية عدد الخلايا الثنائية، ضمن إحصائيات، حدد عدد، وتحت مجموعة مختارة، حدد مجموعة BNC، ثم انقر فوق إضافة إحصائيات لإضافة الإحصائية إلى القائمة وحفظ القالب. بمجرد إضافة كافة الإحصائيات إلى القائمة، انقر فوق إغلاق، ثم انقر فوق موافق، ثم احفظ قالب تحليل البيانات.لدفعة معالجة الملفات التجريبية، ضمن القائمة أدوات، انقر فوق ملفات البيانات الدفعية وانقر فوق إضافة دفعة في النافذة الجديدة. انقر فوق إضافة ملفات لتحديد ملفات التجربة لإضافته إلى المجموعة، ثم انقر فوق الزر فتح مجلد ضمن الخيار تحديد قالب أو ملف تحليل بيانات. استعرض للوصول إلى القالب الذي تم حفظه للتو ثم افتحه.انقر فوق موافق لإغلاق الإطار الحالي. ثم انقر فوق إرسال دفعات لبدء معالجة المجموعة من كافة الملفات. هنا، يتم عرض أربع لوحات مختارة لتحديد الخلايا الثنائية.هذه المؤامرات ثنائي المتغيرات والمداد البيانية تمكين اختيار الخلايا الثنائية وكذلك تحديد تلك الخلايا التي لديها نويتين مع دائرية مماثلة، والمناطق، وكثافات التي يتم فصلها جيدا عن بعضها البعض. هذه الصور برايتفيلد وهويشت، فضلا عن الخلية binucleated وأقنعة النيات الدقيقة، وتسهيل تحديد وتعداد الخلايا binucleated والميكرنوكلي. يستخدم تطبيق ميزة العد الموضعي قناع متعدد النوى لتحديد أحادية النوى وثلاثين نواً وخلايا رباعية.ويمكن بعد ذلك جمع عدد الخلايا الثلاثية والخلايا الرباعية للحصول على العدد النهائي للخلايا متعددة النوى اللازمة لحساب السمية الخلوية. هنا، يتم عرض التمثيل الجيني وقيم السمية الخلوية للكولتشيسين الذاتية، والميتوميسين clastogen C، والتحكم السلبي، مانيتول، لإثبات صحة البروتوكول. إن وضع علامات على الخلايا بتركيز مناسب من وصمة الحمض النووي أمر بالغ الأهمية لضمان التقاط صور عالية الجودة ، مما يسمح بتحديد جميع الأحداث الرئيسية بسهولة وحصدها.وهذه التقنيات تنطبق أيضا على مقايسة النواية الدقيقة في القياس البيولوجي للجرعات الإشعاعية، مما يسمح بتقدير الجرعة لدى الأفراد الذين ربما تعرضوا للإشعاع.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

توطين والكمي النسبية من أنابيب الكربون النانوية في الخلايا مع متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الأنزيمية الفحص لقياس النسخ تثبيط من قبل الغاليوم (III) وH<sub&gt; 3</sub&gt; 5،10،15-تريس (pentafluorophenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

تحليل التعبير الجيني غشائي الخلايا المعرضة للإجهاد باستخدام عدة تدفق مواز-لوحة الدوائر للقص

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

الكشف عن سرطان المبيض باستخدام الضوئية تدفق الصوتية الخلوية

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

القياس الكمي المتزامن لـ Kynurenines المختارة التي تم تحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة- القياس الطيفي الكتلي في المتوسط الذي تم جمعه من ثقافات الخلايا السرطانية

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...