En automatiseret metode til udførelse af in vitro-Mikronukleusanalysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri

Billedet stream-baserede mikrokerneanalyse kan overvinde flere begrænsninger af metoder såsom automatiseret mikroskopi og konventionelle flow cytometri, herunder lav gennemløb og manglende visuel bekræftelse af begivenheder. Den største fordel ved denne teknik er, at alle nødvendige hændelser til bestemmelse af genotoksicitet og cytotoksicitet automatisk kan afbildes, identificeres og scorede uden behov for at skabe mikroskopdias. Ved celleeksponering for clastogens og/eller aneugens tilsættes en millimeter af kemikaliet af interesse til syv til otte gange 10 til den femtedel af forsøgscellerne i ni milliliter af det relevante cellekulturmedium i en T25-kolbe og en milliliter vand til kontrolkulturerne.

Kolber 37 grader Celsius og 5 % kuldioxid inkluderes i tre timer, før cellerne overføres til et 15 milliliter polypropylenrør pr. kolbe. Cellerne opsamles ved centrifugering, og pellets opvarmes igen i 10 milliliter frisk kulturmedium pr. rør til såning i nye T25-kuldekolber. Derefter tilsættes 150 mikroliter af bestandens koncentration af cytochalasin B til hver kolbe for at opnå en endelig koncentration på tre mikrogram pr. milliliter.

Kolberene returneres til vækstmaskinen i en restitutionstid på 1,5 til to fordoblingstider, som anbefalet af retningslinjerne for Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling. Ved tilbagebetalingsperiodens afslutning overføres kulturerne til individuelle 15 milliliter polypropylenrør til centrifugering og opsaltning af pellets i fem milliliter kaliumchlorid på 75 millimolar kaliumchlorid. Bland forsigtigt ved inversion tre gange og inkubere prøverne ved fire grader Celsius i syv minutter.

Ved slutningen af inkubationen tilsættes to milliliter på fire procent formalin til hver prøve og blandes forsigtigt med tre inversioner. Prøverne tilbagelevers til fire grader Celsius i 10 minutter, før cellerne indsamles ved centrifugering. resuspend pellets i 100 mikroliter af friske fire procent formalin i 20 minutter.

Ved inkubationens afslutning vaskes de faste celler i fem milliliter vaskepude pr. rør ved centrifugering, og pellets skal opslæeres i 100 mikroliter vaskepude pr. rør. Dernæst overføres prøverne til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør til at regne med et hæmocytometer. Der tilsættes fem mikroliter på 100 mikrogram pr. milliliter Hoechst 33342 pr. 1,0 x 10 til de seks celler pr. milliliter og 10 mikroliter på 500 mikrogram pr. milliliter RNase pr. 100 mikroliter prøve pr. rør.

Efter en 30 minutters inkubation ved 37 grader Celsius og fem procent kuldioxid, centrifuge prøverne i en mikrocentrifuge og fjerne alle, men 30 mikroliters supernatant fra hvert rør. Derefter omhyggeligt resuspend prøverne, passe på ikke at fremkalde boble dannelse. Hvis der vises bobler ved resuspension, skal du forsigtigt svippe på røret for at fjerne dem.

For at køre prøverne ved multispektrale billeddannelse flow cytometri, først tænde 405 nanometer laser og indstille laser magt til 10 milliwatt. Deaktiver alle de andre lasere, herunder side scatter laser, og sæt brightfield til kanaler en og ni. Bekræft, at forstørrelsesskyderen er indstillet til 60x, at højfølsomhedstilstanden er valgt, og at kun kanaler 1, syv og ni vises i billedgalleriet.

Klik på punktplott, og marker hele populationen og arealet M01 på X-aksen. Vælg højde-bredde-forhold M01 på Y-aksen, og klik på firkantet område for at tegne et område omkring de enkelte celler. Navnd denne region enkelte celler og højreklik på plottet for at vælge regioner.

Fremhæv området med enkelte celler, og skift X-koordinaterne til 100 og 900, og Y-koordinaterne til 0,75 og én. Angiv anskaffelsesparametrene, og angiv filnavnet og destinationsmappen. Skift derefter antallet af hændelser til 20.000, vælg den DNA-positive population, og kør den første prøve.

Hvis du vil åbne en datafil i IDEAS, skal du klikke på Start analyse for at starte guiden Åbn fil og gennemse for at vælge den ønskede rå billedfil. Klik derefter på Næste, og søg efter en binukleeret celle i billedgalleriet. Hvis du vil oprette en maske, skal du klikke for at markere billedet af interesse og åbne analysefanen.

Klik på Masker, Ny og Funktion for at vælge LevelSet. Vælg M07 og Mellemniveaumaske under Mask, og angiv skalaen til konturdetaljer til tre. Klik derefter på OK to gange.

Hvis du vil have øje på binukleerede cellefunktioner, skal du åbne fanen Analyse og vælge Funktioner og Ny. Vælg Antal staffage antal for funktionstypen. I forbindelse med Maske skal du vælge den endelige binukleerede maske og indstille forbindelsesfunktionen til fire, derefter ændre navnet til Spottælt BNC og klikke på OK og lukke for at beregne funktionsværdierne.

Klik på histogram for et staffageantal, der er binuklet cellehygram, og vælg ikke-apoptopisk som overordnet population. For X-aksefunktionen skal du vælge Antal BNC og klikke på OK og lineært område og derefter tegne et område på tværs af Bim 2 og navngive dette område 2N. Hvis du vil oprette en mikrokernemaske, skal du vælge en binukleeret celle, der indeholder en mikrokerne fra billedgalleriet, og åbne masker under fanen Analyse.

Hvis du vil oprette en staffageidentifikationsmaske, skal du klikke på Ny og Funktion og vælge Staffage. Bekræft, at knappen Lys lys er valgt, og vælg M07 under maske. Indstil spot til cellebaggrundsforhold og minimumradius til to, og angiv den maksimale radius til seks.

Klik på OK og OK for at føje masken til listen til venstre, og klik derefter på Ny for at oprette en anden maske. Klik på Spot M07 Channel syv Bright to seks to maske og klik på pil ned for at tilføje den til masken definition og klik på Og og ikke operatører. Klik på pil ned for at føje udvidet områdemaske til maskedefinitionen.

Hvis du vil oprette en polykernet populationsmaske, skal du klikke på Analyse, Masker, Ny og Funktion. Vælg Område under Funktion. Under Maske skal du vælge Vandskelt dilatsæt M07 Channel07, Middle, three, two, og indstille billedet til at blive vist til Kanal 07.

Angiv minimum- og maksimumområdeværdierne til henholdsvis 135 og 5000, og angiv minimum- og maksimumstørrelsesforholdsværdierne til henholdsvis 0,4 og én. Klik på OK, og rediger teksten i navnefeltet for at læse POLY-maske, og klik derefter på OK og Luk. Hvis du vil oprette en brugerdefineret visning, skal du klikke på knappen Egenskaber for Billedgalleri, åbne fanen Kompositter og klikke på Ny.

Angiv Kanal 01 til Kanal 07 under Navn. Klik på Tilføj billede, og vælg Kanal 01 under Billede, og angiv procenten til 100. Klik på Tilføj billede igen, og vælg Kanal 07 under billedet, og angiv procenten til 100.

Klik på fanen Vis, klik på Ny, og angiv BNC- og MN-masker under Navn. Klik derefter på Tilføj kolonne, og vælg Kanal 01 under Billedtype, og vælg Ingen under Maske. Klik på Tilføj kolonne, og vælg Kanal 07 under Billedtype, og vælg Ingen under Maske.

Klik på Tilføj kolonne, klik på knappen Sammensat alternativ, og klik derefter på Okay for at fuldføre den brugerdefinerede visning. Klik på rullemenuen Vis, og klik på visningen BNC- og MN-masker. Klik på knappen Vis skjul masker.

Hvis du vil optælle vigtige hændelser, skal du åbne fanen Rapporter og klikke på Definer statistikrapport og derefter klikke på Tilføj kolonner i det nye vindue. Hvis du vil tilføje statistikken over binukleerede celletal, skal du vælge Tæl under Statistik og vælge BNC-populationen under Markeret population og derefter klikke på Tilføj statistik for at føje statistikken til listen og gemme skabelonen. Når alle statistikker er føjet til listen, skal du klikke på Luk og derefter klikke på OK og derefter gemme dataanalyseskabelonen.

Hvis du vil batchbearbejde forsøgsfilerne, skal du klikke på Batchdatafiler i menuen Funktioner og klikke på Tilføj batch i det nye vindue. Klik på Tilføj filer for at vælge de eksperimentfiler, der skal føjes til batchen, og klik på knappen Åbn mappe under indstillingen Vælg en skabelon eller dataanalysefil. Gå til den skabelon, der lige er blevet gemt, og åbn den.

Klik på OK for at lukke det aktuelle vindue. Klik derefter på Send batches for at starte batchbehandlingen af alle filer. Her vises fire udvalgte paneler til identifikation af binukleerede celler.

Disse bivariat plots og histogrammer gør det muligt at vælge binukleerede celler samt identifikation af de celler, der har to kerner med samme cirkularitet, områder og intensiteter, og som er godt adskilt fra hinanden. Disse Brightfield og Hoechst billeder, samt binucleated celle og mikrokerne masker, lette identifikation og optælling af binukleerede celler og mikrokerner. Anvendelse af spottæltningsfunktionen bruger den polynukleerede maske til at identificere mononukleare, trinuclear og quadranuclear celler.

Antallet af tri- og quadranuclear celler kan derefter lægges sammen for at opnå det endelige antal polynucleerede celler, der kræves til beregning af cytotoksicitet. Her vises repræsentative genotoksicitets- og cytotoksicitetsværdier for endogen colchicin, clastogen mitomycin C og en negativ kontrol, mannitol, for at påvise protokollens gyldighed. Mærkning af celler med en passende koncentration af DNA-plet er afgørende for at sikre høj kvalitet billedoptagelse, så alle vigtige begivenheder, der let kan identificeres og scores.

Disse teknikker gælder også for mikrokerneanalysen for strålingsbiodosimetri, som giver mulighed for dosisvurdering hos personer, der kan have været udsat for stråling.