Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
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L'autrice ringrazia Christine Probst (Luminex Corporation) per i suoi sforzi nello sviluppo di forme precedenti del modello di analisi dei dati, nonché la dott.ssa Haley Pugsley (Luminex Corporation) e la dott.ssa Phil Morrissey (Luminex Corporation) per la revisione e la manoscritto.

L'autore è impiegato da Luminex Corporation, il creatore del cytometro di flusso di imaging multispettrale ImageStream che è stato utilizzato in questo lavoro.

In una recente pubblicazione Verma e altri hanno sottolineato l'importanza di sviluppare un sistema che combini il vantaggio ad alta produttività della citometria di flusso con i vantaggi di archiviazione dei dati e delle immagini dell'analisi delle immagini35. Il MIFC in vitro MN assay descritto in questo articolo soddisfa questa citazione e ha il potenziale per superare molte delle sfide di cui sopra nei metodi di microscopia e citometria di flusso. Il protocollo qui descritto dimostra che sia la citotossicità che la genotossicità possono essere valutate utilizzando MIFC. La preparazione dei campioni, la colorazione cellulare e la raccolta dei dati sono semplici, ma ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo che devono sempre essere implementati. L'aggiunta di cloruro di potassio (KCl) alle cellule è fondamentale per gonfiare le cellule, generando la separazione tra i nuclei principali. Ciò garantisce che l'algoritmo di mascheramento possa identificare tutti i singoli nuclei nei BNM e nelle cellule POLY (cellule POLY) che è necessario per la loro enumerazione. Inoltre, KCL fornisce la separazione tra nuclei e MN, che è essenziale per mascheramento e quantificazione MN accurati. Inoltre, l'uso della formalina dopo l'aggiunta di KCl impedisce alle cellule di lising durante la centrifugazione. L'aggiunta di Cytochalasin B fa sì che le cellule TK6 che hanno subito più di una divisione nucleare siano piuttosto grandi. Di conseguenza, il citoplasma diventa fragile e può lisi se la centrifugazione viene eseguita immediatamente dopo l'aggiunta di KCl. Inoltre, è molto importante introdurre Hoechst nel campione in base al numero di cellule nel campione e non in base a una concentrazione finale. Ad esempio, una concentrazione finale di 10 g/mL di Hoechst macchia uniformemente un campione di 1 x 106 cellule, ma potrebbe non macchiare adeguatamente un campione contenente 5 x 106 cellule e può provocare molte cellule con nuclei macchiati devasamente, rendendo difficile l'analisi. È inoltre importante notare che Hoechst può essere sostituito con un altro tintire di DNA come DAPI se il MIFC è dotato del laser di eccitazione 405 nm o DRAQ5 se il MIFC è dotato del 488 nm e/o 642nm excitation laser(s). Se si modifica la macchia nucleare, è fondamentale titrate la macchia al fine di trovare la concentrazione appropriata per la potenza laser richiesta / desiderata.
Quando si raccolgono dati nel MIFC è importante determinare i limiti di area ottimali per le funzionalità RMS di gradiente. I confini presentati in questo protocollo possono richiedere un aggiustamento a causa di alcune lievi variazioni tra gli strumenti MIFC. L'applicazione di questa funzionalità durante la raccolta dei dati è essenziale per garantire l'acquisizione di immagini altamente focalizzate. Se i file di dati contengono molte immagini sfocate o non sfocate, è probabile che gli algoritmi di mascheramento nel software di analisi evidenzieranno erroneamente gli artefatti di colorazione nelle aree sfocate, portando a un numero elevato di falsi artefatti positivi che vengono segnati come MN. Anche se le tecniche di elaborazione delle immagini qui descritte possono essere difficili, una volta che un modello di analisi è stato sviluppato nel software MIFC, l'elaborazione batch consente di analizzare automaticamente i file di dati, eliminando l'intervento dell'utente e quindi il marcatore pregiudizio. Inoltre, se una linea cellulare diversa dalle celle TK6 viene utilizzata per eseguire l'esecuzione dell'esecuzione, sarà necessario modificare le maschere e i limiti delle aree in quanto le proprietà morfologiche (ad esempio, le dimensioni) delle celle saranno diverse da quelle delle cellule TK6.
I risultati qui presentati (Figura 5) mostrano aumenti statisticamente significativi nell'induzione di MN quando si espongono le cellule TK6 a varie dosi di Mitomycin C e Colchicine. Sono stati osservati aumenti statisticamente significativi della frequenza di MN rispetto ai controlli dei solventi per diverse dosi in entrambe le sostanze chimiche. Inoltre, nessuna dose di Mannitol ha indotto una citotossicità superiore al 30%, né un aumento statisticamente significativo della frequenza di MN rispetto ai controlli dei solventi, come previsto. Il protocollo descritto in questo documento utilizzando MIFC per eseguire il test in vitro MN fornisce i risultati attesi da sostanze chimiche di controllo positive e negative. È molto importante eseguire una serie di esperimenti utilizzando sia i controlli dei solventi che le sostanze chimiche di controllo negativo per sviluppare i valori di base sia della frequenza di MN che dell'indice di proliferazione del blocco di Citocinesi (CBPI). Per la genotossicità, aumenti statisticamente significativi della frequenza MN sono determinati attraverso il confronto con le frequenze MN di base che devono essere ben note per il tipo di cellula utilizzato. Inoltre, tutti i calcoli della citotossicità si basano sulla CBPI dei campioni di controllo e, pertanto, i tassi di base delle cellule MONO, BNC e POLY devono essere ben quantificati nei controlli.
Diverse limitazioni e vantaggi dell'utilizzo di MIFC nel contesto del MN assay sono stati descritti nel lavoro precedente29,32. Le principali limitazioni riguardano frequenze MN più basse rispetto alla microscopia, che probabilmente deriva sia dalla mancanza di flessibilità nell'implementazione dei criteri di punteggio nel software di analisi, sia dalla limitata profondità di campo del MIFC. Le maschere ben sagomate possono essere create per identificare con precisione i nuclei principali, ma MN che stanno toccando (o molto vicino a) i nuclei principali potrebbero essere catturati all'interno della maschera BNC. Inoltre, MN molto piccolo che può essere ottenuto piuttosto facilmente utilizzando la microscopia sono probabilmente erroneamente mancati quando si utilizza MIFC a causa del limite inferiore sul parametro di area della maschera MN per evitare di segnare piccoli artefatti. Oltre alle difficoltà presenti nell'analisi dei dati basata su immagini, grazie al suo design, MIFC ottiene immagini di proiezione bidimensionale di oggetti cellulari tridimensionali. Questo probabilmente fa sì che alcuni MN per essere catturato ad una diversa profondità di messa a fuoco che i due MN principale, facendoli apparire molto fiodo e non-scorable utilizzando mascheramento. Inoltre, una piccola frazione di MN potrebbe risiedere dietro uno dei due nuclei principali, rendendoli impossibili da visualizzare e segnare. Pertanto, considerando queste difficoltà, è necessario prestare attenzione quando si interpretano aumenti significativi della frequenza di MN a basse dosi.
Nonostante queste carenze, il metodo MIFC descritto qui offre diversi vantaggi rispetto ad altre tecniche. Fenech et al. ha proposto criteri e linee guida che dovrebbero essere presi in considerazione quando si sviluppano sistemi e metodologie automatizzate per i test MN36. Questi includono, ma non sono limitati a, la visualizzazione diretta dei principali nuclei e del citoplasma, la determinazione della frequenza di MN da varie dosi della sostanza chimica o dell'agente in fase di test e la capacità di quantificare la morfologia e determinare la posizione di tutti i nuclei e MN per assicurarsi che siano all'interno del citoplasma. Questo documento mostra che il metodo MIFC sviluppato per eseguire il saggio in vitro MN soddisfa (o possiede il potenziale per soddisfare) questi criteri. In particolare, le immagini dei nuclei e MN possono essere catturate dai laser fluorescenti, mentre le immagini citoplasmiche possono essere ottenute utilizzando il LED BF. Le immagini di cellule con morfologia nucleare normale possono essere differenziate automaticamente da quelle cellule con morfologia irregolare utilizzando una combinazione di maschere avanzate e caratteristiche. I risultati presentati per Colchicine e Mitomycin C (Figura 5) mostrano che sia la genotossicità che la citotossicità possono essere valutate a varie dosi rispetto ai controlli dei solventi e che si osservano frequenze di MN statisticamente significative dove Previsto. Inoltre, la linea 487 della Guida al test dell'OCSE raccomanda di segnare 2.000 BNC per concentrazione di test per valutare la presenza di MN per determinare la genotossicità insieme ad almeno 500 cellule per concentrazione di prova per determinare la citotossicità9; questo può richiedere più di 1 h utilizzando la microscopia manuale. Il protocollo e i risultati in questo documento mostrano che una media di circa 6.000 BNC, 16.000 cellule MONO e 800 cellule POLY sono state catturate e valutate per concentrazione di test in circa 20 min. Il rapido tasso di acquisizione dei dati e l'elevato numero di cellule candidate segnate in così poco tempo evidenziano un altro importante vantaggio dell'impiego di MIFC per eseguire il test in vitro MN.
Mentre i risultati presentati in questo documento sono incoraggianti, sono rappresentativi di un metodo di prova precoce del concetto. Questo lavoro dovrebbe essere seguito da un'indagine più approfondita di un insieme chimico più ampio e diversificato che copre più classi e meccanismi di genotossicità e citotossicità come quelli suggeriti da Kirkland et al.37 Condurre tali studi sono tuttavia, questi studi su larga scala forniranno preziose informazioni sulla capacità del metodo di identificare in modo affidabile agenti debolmente mutotossici. La metodologia qui presentata non è ancora stata miniaturizzata in un formato di microwell, il che consentirebbe uno screening più rapido ed efficiente su una gamma di dosi più ampia. Come tale, nella sua forma attuale, il saggio in vitro MN basato su MIFC qui presentato può essere più adatto per studi di follow-up ad alta intensità di lavoro o la ricerca su buone pratiche di laboratorio. Tuttavia, il metodo continuerà ad essere ottimizzato e convalidato, e possiede il potenziale per consentire una maggiore flessibilità nel rilevamento di eventi chimici specifici legati alla morfologia, come l'esposizione all'aneugeno che aumenta la proporzione di cellule con nuclei non circolari che sono ancora commisti biliabili38. Infine, il metodo MIFC offre l'opportunità di introdurre ulteriori biomarcatori nel test MN (ad esempio colorazione del cinetochore) per fornire una visione più completa del meccanismo di induzione di MN.

L'analisi in vitro micronucleoleus (MN) è un test comunemente usato per valutare la citotossicità e la genotossicità come strumento di screening in diversi campi di studio come lo sviluppo chimico e farmaceutico, nonché il biomonitoraggio umano tra gli individui esposti a vari fattori ambientali, professionali o di stile di vita1,2,3. MN è costituito da frammenti di cromosomi o cromosomi interi generati durante la divisione cellulare che non sono incorporati in uno dei due nuclei principali della figlia. Dopo la telofase, questo materiale cromosomico si forma in un corpo individuale arrotondato all'interno del citoplasma separato da uno dei nuclei principali2. Pertanto, MN sono rappresentativi del danno al DNA e sono stati utilizzati per molti anni come endpoint nei test di genotossicità4. Il metodo più appropriato per misurare la MN è il saggio citochinesi-blocco micronucleo (CBMN). Utilizzando il saggio CBMN, la frequenza di MN nelle cellule binucleate (BNC) può essere valutata incorporando la CitochalasinA B (Cyt-B) nel campione. Cyt-B consente la divisione nucleare ma previene la divisione cellulare e quindi, limita il punteggio di MN ai BNC che si sono divisi solo una volta5.
I protocolli che utilizzano microscopia e citometria di flusso sono stati sviluppati e convalidati e sono regolarmente utilizzati per eseguire l'analisi in vitro MN6,7,8,9,10, 11,12,13,14. La microscopia trae vantaggio dall'essere in grado di confermare visivamente che le MN sono legittime, ma richiede molto tempo e è soggetta a variabilità tra i marcatori15. Per risolvere questo problema, sono stati sviluppati metodi automatizzati di microscopia per scansionare diapositive e catturare immagini di nuclei e MN16,17,18,19, ma il citoplasma non può essere visualizzato, rendendolo difficile determinare se un MN è effettivamente associato a una cella specifica. Inoltre, questi metodi hanno difficoltà nell'identificare le cellule polinucleate (POLY) (comprese le cellule tri e quadranucle) che sono necessarie per il calcolo della citotossicità quando si utilizza Cyt-B9. Metodi di citometria di flusso sviluppati per eseguire il saggio MN impiegano fluorescenza così come intensità di dispersione in avanti e laterale per identificare le popolazioni dei nuclei e MN che sono stati liberati dalla cellula dopo lisi20,21 ,22. Questo permette di acquisire i dati da diverse migliaia di celle in pochi minuti e permette l'analisi automatizzata23; tuttavia, l'incapacità di visualizzare le cellule rende impossibile confermare che gli eventi segnati sono autentici. Inoltre, il lising della membrana cellulare inibisce l'uso di Cyt-B, nonché la creazione di una sospensione che contiene altri detriti come aggregati cromosomici o corpi apoptotici e non c'è modo di differenziarli da MN24.
Alla luce di queste limitazioni, la citometria MIFC (Multispectral Imaging Flow) è un sistema ideale per eseguire il saggio MN in quanto combina le immagini fluorescenti ad alta risoluzione della microscopia con la robustezza statistica e la velocità della citometria di flusso convenzionale. In MIFC, tutte le cellule vengono introdotte in un sistema fluidico e quindi idrodinamicamente focalizzate al centro di una cuvette di celle di flusso. L'illuminazione ortogonale di tutte le cellule avviene attraverso l'uso di un diodo a emissione luminosa (LED) a campo luminoso (BF), un laser a dispersione laterale e (almeno) un laser fluorescente. I fotoni fluorescenti vengono catturati da uno dei tre obiettivi obiettivo ad alta apertura 20x, 40x o 60x e quindi passano attraverso un elemento di decomposizione spettrale. I fotoni vengono quindi concentrati su una fotocamera a dispositivo accoppiato a carica (CCD) per ottenere immagini ad alta risoluzione di tutte le celle che passano attraverso la cella di flusso. Per evitare sfocature o striature, il CCD opera in modalità DiC (Time Delay Integration) che tiene traccia degli oggetti trasferendo il contenuto dei pixel da una riga all'altra del CCD in sincronia con la velocità della cella in flusso. Le informazioni sui pixel vengono quindi raccolte dall'ultima riga di pixel. L'imaging TDI combinato con la decomposizione spettrale consente di acquisire simultaneamente fino a 12 immagini (2 BF, 10 fluorescenti) da tutte le cellule che passano attraverso la cella di flusso. Tutte le immagini acquisite vengono memorizzate in file di dati specifici del campione, consentendo l'analisi da eseguire in qualsiasi momento utilizzando il software di analisi dei dati MIFC. Infine, i file di dati mantengono il collegamento tra immagini cellulari e punti su tutti i grafici bivariati. Ciò significa che qualsiasi punto su una trama bivariata tradizionale può essere evidenziato e le corrispondenti immagini BF e fluorescenti verranno visualizzate25.
Recentemente, sono stati sviluppati metodi basati su MIFC per eseguire il test MN sia per la biodosimetria di radiazione triage26,27,28,29,30,31 e genetica tossicologia32,33 test. Questo lavoro ha dimostrato che le immagini cellulari dei nuclei principali, MN e il citoplasma possono essere immagine con una maggiore produttività rispetto ad altri metodi26. Tutti i tipi di cellule necessari per l'analisi, incluse le celle MONO, i BNC (con e senza MN) e le celle POLY, possono essere identificati automaticamente nel software di analisi dei dati MIFC e l'implementazione dei criteri di punteggio sviluppati da Fenech et al. l'uso di vari algoritmi matematici6,34. I risultati della biodosimetria hanno mostrato che le curve di calibrazione della risposta alla dose erano simili in grandezza a quelle ottenute da altri metodi automatizzati nella letteratura quando si quantifica il tasso di MN per BNC29. Inoltre, recenti lavori in tossicologia hanno dimostrato che le immagini di cellule MONO, BNC (con e senza MN) e cellule POLY possono essere automaticamente catturate, identificate, classificate ed enumerate utilizzando MIFC. Il protocollo e l'analisi dei dati hanno permesso il calcolo della citotossicità e genotossicità dopo aver esposto le cellule TK6 a diversi clastogeni e aneugeni32.
Il protocollo presentato in questo documento descrive un metodo per eseguire il saggio in vitro MN utilizzando MIFC. La tecnica di elaborazione del campione utilizzata in questo lavoro richiede meno di 2 h per elaborare un singolo campione ed è relativamente facile da eseguire rispetto ad altri metodi. L'analisi dei dati nel software di analisi MIFC è complicata, ma la creazione del modello di analisi può essere eseguita in poche ore seguendo i passaggi descritti in questo documento. Inoltre, una volta che il modello è stato creato, può essere applicato automaticamente a tutti i dati raccolti senza ulteriori lavori. Il protocollo descrive tutti i passaggi necessari per esporre le cellule TK6 a clastogeni e aneugeni, descrive come coltura, elaborare e macchiare le cellule e dimostra come acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando MIFC. Inoltre, questo documento illustra le attuali best practice per l'analisi dei dati nel software MIFC per identificare e assegnare automaticamente un punteggio alle cellule MONO, ai BNC e POLY allo scopo di calcolare sia la citotossicità che la genotossicità.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

L'analisi in vitro micronucleo (MN) è spesso usata per valutare la citotossicità e la genotossicità, ma segnare l'analisi tramite microscopia manuale è laborioso e introduce incertezza nei risultati a causa della variabilità tra i marcatori. Per ovviare a questo problema, sono state introdotte la microscopia automatica a scansione delle diapositive e i metodi di citometria di flusso convenzionali nel tentativo di rimuovere la distorsione del marcatore e migliorare la produttività. Tuttavia, questi metodi hanno le loro limitazioni intrinseche come l'incapacità di visualizzare il citoplasma della cellula e la mancanza di verifica MN visiva o archiviazione dei dati immagine con citometria di flusso. La citometria MIFC (Multispectral Imaging Flow) ha il potenziale per superare queste limitazioni. MIFC combina le immagini fluorescenti ad alta risoluzione della microscopia con la robustezza statistica e la velocità della citometria di flusso convenzionale. Inoltre, tutte le immagini raccolte possono essere memorizzate in file specifici della dose. Questo documento descrive il protocollo sviluppato per eseguire una versione completamente automatizzata del test MN su MIFC. Le cellule linfoblastoidi umane TK6 sono state ingrandite utilizzando una soluzione ipotonica (75 mM KCl), fissata con il 4% di formalina e il contenuto nucleare è stato macchiato con Hoechst 33342. Tutti i campioni sono stati eseguiti in sospensione sul MIFC, consentendo l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione di tutti gli eventi chiave necessari per il saggio (ad esempio cellule binucleate con e senza MN, nonché cellule mononucleate e polucleate). Le immagini sono state automaticamente identificate, categorizzate ed enumerate nel software di analisi dei dati MIFC, consentendo il punteggio automatizzato sia della citotossicità che della genotossicità. I risultati dimostrano che l'utilizzo di MIFC per eseguire il test in vitro MN consente di rilevare aumenti statisticamente significativi della frequenza di MN a diversi livelli di citotossicità rispetto ai controlli dei solventi a seguito dell'esposizione delle cellule TK6 Mitomicina C e Colchicina, e che non si osservano aumenti significativi della frequenza di MN in seguito all'esposizione a Mannitol.

Il metodo di analisi descritto in questo documento consente l'identificazione e il punteggio automatici delle BNC, con e senza MN, per calcolare la genotossicità. Inoltre, le cellule MONO e POLY vengono identificate e valutate automaticamente per calcolare la citotossicità. I criteri di punteggio pubblicati6,34 che devono essere aderiti quando si segnano questi eventi vengono implementati nel software di analisi dei dati MIFC. I risultati qui presentati indicano che aumenti statisticamente significativi della frequenza di MN con crescente citotossicità possono essere rilevati dopo l'esposizione delle cellule TK6 del linfoblastoide umano a sostanze chimiche che inducono MN ben note (Mitomycin C e Colchicina). Risultati analoghi per le sostanze chimiche aggiuntive testate sono stati dimostrati in una pubblicazione separata32. Inoltre, i risultati dell'uso di Mannitol mostrano che le sostanze chimiche che non inducono MN possono anche essere identificate correttamente utilizzando il metodo MIFC qui descritto. I parametri descritti nel protocollo per creare tutte le maschere, le funzioni e i limiti delle regioni dovranno probabilmente essere regolati se vengono utilizzati diversi tipi di cellule (ad esempio celle di Cesster cinese) per eseguire l'analisi.
La figura 3 mostra quattro pannelli selezionati per identificare i BNC (Figura3A-3D). Di seguito è mostrato un istogramma che consente la selezione di celle con due nuclei (Figura 3A) e grafici bivariati che consentono la selezione di BNC con circolarità simile (Figura 3B), aree e intensità simili (Figura 3C ) e BnMc che hanno nuclei ben separati e non sovrapposti (Figura 3D) come da parte del punteggio critieria6,34. Figura 3 E mostra le immagini BF e Hoechst, nonché le maschere BNC e MN che indicano che i BNC con MN singolo o multiplo possono essere identificati ed enumerati. Ciò consente di calcolare la genotossicità determinando il tasso di Micronucleoned BNC nella popolazione finale del BNC. Figura 4 mostra l'applicazione della funzione Spot Count utilizzando la maschera POLY per identificare le celle MONO, TRI e QUAD. Il numero di celle TRI e QUAD può quindi essere sommato per ottenere il numero finale di celle POLY (Tabella1). Ciò consente di calcolare la citotossicità utilizzando la formula mostrata nel protocollo. Pertanto, ogni punto di dose nell'esperimento può essere valutato da entrambi i parametri di genotossicità e citotossicità.
Figura 5 Mostra i valori di genotossicità e citotossicità per l'aneugen Colchicine, il clastogen Mitomycin C e per un controllo negativo, Mannitol. Per la Colchiina (Figura 5A) le dosi da 0,02 a 0,05 g/mL hanno prodotto aumenti statisticamente significativi della frequenza DiN, che vanno rispettivamente dall'1,28% al 2,44% rispetto al controllo del solvente (Tabella 1). Nel caso di Mitomycin C (Figura 5B) le due dosi massime di 0,4 e 0,5 g/mL hanno prodotto frequenze MN statisticamente significative rispetto ai controlli del solvente. Queste frequenze di MN erano dello 0,93% a 0,4 g/mL e dell'1,02% a 0,5 g/mL (tabella 2). Infine, per Mannitol (Figura 5C), nessuna dose testata inducono una citotossicità superiore al 30%, né produceva aumenti significativi della frequenza di MN rispetto ai controlli dei solventi, come previsto (Tabella 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> Figura 1 : impostazioni dello strumento MIFC. Schermata delle impostazioni MIFC come descritto nella sezione 7 del protocollo. (A) Impostare la potenza laser da 405 nm a 10 mW. (B) Impostazione dei canali BF 1 e 9. (C) Selezione dell'obiettivo di ingrandimento 60x. (D) Selezionare la velocità di flusso più lenta che genera immagini con la risoluzione più alta. (E) Specificare il numero di eventi da raccogliere a 20.000. (F) Fare clic sul pulsante Carica per avviare il processo di caricamento del campione. (G) Fare clic sul pulsante Acquisisci per iniziare ad acquisire immagini. (H) Fare clic sul pulsante Indietro per restituire qualsiasi campione inutilizzato. (I) Grafico a dispersione di BF Aspect Ratio rispetto all'area BF per la selezione di singole celle. (J) Scatterplot di Hoechst Gradient RMS contro BF Gradient RMS per la selezione delle celle a fuoco. (K) Istogramma dell'intensità di Hoechst per la selezione delle cellule positive del DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> Figura 2 : Strategia di gating software di analisi. Uno screenshot della strategia di gating descritta nella sezione 9 del protocollo. Le regioni sono mostrate in ordine sequenziale per l'identificazione delle cellule federate (scatola rossa), dei micronuclei (scatola gialla) e delle cellule monoe polucleate (scatola blu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> Figura 3 : Identificazione e punteggio dei BNC con e senza MN. (A) Selezione di cellule che hanno due nuclei distinti. (B) Identificazione delle cellule federate (BNC) che hanno due nuclei altamente circolari attraverso l'uso della funzione Intensità proporzioni. (C) Selezione dei BNC con nuclei con aree e intensità simili. Ciò si ottiene calcolando il rapporto tra l'area di entrambi i nuclei e il rapporto tra il rapporto di aspetto di entrambi i nuclei. (D) Uso delle funzioni Proporzioni forma e Rapporto di aspetto per identificare i BNC con due nuclei ben separati. (E) La funzione Spot Count che utilizza la maschera micronucleo (MN) dimostra che i BNC con MN singolo o multiplo possono essere identificati ed enumerati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> Figura 4 : Identificazione e punteggio delle celle MONO e POLY. Uso della funzione di conteggio spot per identificare ed enumerare le celle mono, tri e quadraricane. La maschera componente 1 consente l'identificazione delle celle mononucleate (immagine superiore). Le maschere componenti da 1 a 3 consentono l'identificazione delle celle trinucleate (immagine media). Le maschere componenti da 1 a 4 consentono l'identificazione delle celle quadracle (immagine inferiore). Questa cifra è stata modificata da Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> Figura 5 : Quantificazione della citotossicità. Citotossicità quantificata utilizzando l'indice di proliferazione del blocco di citocinesi (cerchi neri) e genotossicità quantificata utilizzando la percentuale di MN (barre chiare) in seguito a un'esposizione di 3 h e 24 h di recupero per (A) Colchicina, (B) Mitomycin C e ( C) Mannitol. Gli aumenti statisticamente significativi della frequenza di MN rispetto ai controlli sono indicati da stelle (test chi quadrato;s< 0,05,s< 0,01 USD,p < 0,001 USD< 0,001). Tutte le quantità sono la media di due repliche ad ogni punto di dose. Questa cifra è stata modificata da Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> Tabella 1: I parametri necessari per calcolare la citotossicità (il numero di cellule mono, biepolle e polincleate) e la genotossicità (il numero e la percentuale di cellule binucleate micronucleate) per la colichina. Tutte le quantità calcolate sono la media di due repliche ad ogni punto di dose.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> Tabella 2: Tegli parametri necessari per calcolare la citotossicità (il numero di cellule mono-, bi- e polinucleate) e la genotossicità (il numero e la percentuale di cellule binucleated micronucleate) per Mitomycin C. Tutte le quantità calcolate sono la media di due repliche ad ogni punto di dose.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> Tabella 3: I parametri necessari per calcolare la citotossicità (il numero di cellule mono, bi e polnucleate) e la genotossicità (il numero e la percentuale di cellule binucleate micronucleate) per Mannitol. Tutte le quantità calcolate sono la media di due repliche ad ogni punto di dose.
Supplemento 1: Protocollo completo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Supplemento 2: Elenco maschere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

L'analisi in vitro micronucleo è un metodo consolidato per valutare la genotossicità e la citotossicità, ma segnare l'analisi utilizzando la microscopia manuale è laborioso e soffre di soggettività e variabilità inter-marcatore. Questo documento descrive il protocollo sviluppato per eseguire una versione completamente automatizzata dell'analisi utilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Il test del micronucleo basato sul flusso di immagini può superare diverse limitazioni di metodi come la microscopia automatizzata e la citometria a flusso convenzionale, tra cui bassa produttività e mancanza di conferma visiva degli eventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che tutti gli eventi necessari per determinare la genotossicità e la citotossicità possono essere automaticamente identificati, identificati e valutati senza la necessità di creare diapositive al microscopio. Per l'esposizione cellulare a clastogeni e/o aneugeni, aggiungere un millimetro della sostanza chimica di interesse a sette-otto volte 10 al quinto delle cellule sperimentali in nove millilitri del mezzo di coltura cellulare appropriato in un pallone T25 e un millilitro di acqua alle colture di controllo.Incubare i contenitori a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tre ore prima di trasferire le cellule in un tubo di polipropilene da 15 millilitri per pallone. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimorsi il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura fresco per tubo per la semina in nuovi contenitori di coltura T25. Aggiungere quindi 150 microlitri della concentrazione di calcio della citocalcasina B in ogni pallone per ottenere una concentrazione finale di tre microgrammi per millilitro.Restituire i contenitori all'incubatore per un tempo di recupero pari a 1,5-due volte di raddoppio, come raccomandato dalle linee guida dell'Organizzazione per la cooperazione economica e lo sviluppo. Al termine del periodo di recupero, trasferire le colture in singoli tubi di polipropilene da 15 millilitri per la centrifugazione e rimpignare il pellet in cinque millilitri di cloruro di potassio da 75 millimolare. Mescolare delicatamente per inversione tre volte e incubare i campioni a quattro gradi Celsius per sette minuti.Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di formalina al quattro per cento a ciascun campione e mescolare delicatamente con tre inversioni. Riportare i campioni a quattro gradi Celsius per 10 minuti prima di raccogliere le cellule per centrifugazione. rimosogliere i pellet in 100 microlitri di formalina fresca al quattro per cento per 20 minuti.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule fisse in cinque millilitri di tampone di lavaggio per tubo mediante centrifugazione e rimorsire il pellet in 100 microlitri di tampone di lavaggio per tubo. Successivamente, trasferire i campioni su singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per contare su un emocitometro. Aggiungere cinque microlitri da 100 microgrammi per millilitro Hoechst 33342 per 1,0 x 10 alle sei celle per millilitro e 10 microlitri di 500 microgrammi per millilitro RNasi per 100 microlitri di campione per tubo.Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e il cinque per cento di anidride carbonica, centrifugare i campioni in un microcentrifugo e rimuovere tutti i microlitri di supernatante tranne 30 da ogni tubo. Quindi rimorsi accuratamente i campioni, facendo attenzione a non indurre la formazione di bolle. Se le bolle appaiono al momento della sospensione, scorrere delicatamente il tubo per rimuoverle.Per eseguire i campioni mediante citometria a flusso di imaging multispettrale, accendere prima il laser da 405 nanometri e impostare la potenza del laser su 10 milliwatt. Disabilita tutti gli altri laser, incluso il laser a dispersione laterale, e imposta il campo luminoso sui canali uno e nove. Verificare che il dispositivo di scorrimento dell'ingrandimento sia impostato su 60x, che la modalità ad alta sensibilità sia selezionata e che nella raccolta immagini siano visualizzati solo uno, sette e nove canali.Fate clic su traccia a dispersione (Scatter Plot) e selezionate tutta la popolazione e l'area M01 sull'asse X. Selezionate le proporzioni M01 sull'asse Y e fate clic su area quadrata per disegnare un'area attorno alle singole celle. Assegnare a questa regione il nome di singole celle e fare clic con il pulsante destro del mouse sul plottaggio per selezionare le aree.Evidenziare la regione delle singole celle e modificare le coordinate X in 100 e 900 e le coordinate Y in 0,75 e una. Impostare i parametri di acquisizione e specificare il nome del file e la cartella di destinazione. Quindi cambia il numero di eventi in 20.000, seleziona la popolazione positiva al DNA ed esegui il primo campione.Per aprire un file di dati in IDEE, fare clic su Avvia analisi per avviare l'Apertura guidata file e selezionare il file di immagine non elaborati desiderato. Quindi fare clic su Avanti e cercare una cella binucleata nella raccolta immagini. Per creare una maschera, fare clic per selezionare l'immagine di interesse e aprire la scheda analisi.Fate clic su Maschere (Masks), Nuovo (New) e Funzione (Function) per selezionare LevelSet. In Maschera (Mask), selezionate Maschera m07 e Maschera di livello medio (Middle Level Mask) e impostate la scala dei dettagli del contorno su tre. Quindi fare clic due volte su OK.Per individuare le feature di cella binucleate a conteggio, aprite la scheda Analisi (Analysis) e selezionate Feature (Features) e Nuovo (New). Per il tipo di feature, selezionate Conteggio spot (Spot Count). Per Maschera, selezionate la maschera binucleata finale e impostate la connettività su quattro, quindi modificate il nome in BNC conteggio spot (Spot Count BNC) e fate clic su OK e avvicinate (Close) per calcolare i valori della feature.Per un istogramma di cella binucleato con conteggio spot, fare clic sull'istogramma e selezionare non apoptopico come popolazione padre. Per la feature asse X, selezionate BNC conteggio punti (Spot Count BNC) e fate clic su OK e su area lineare, quindi disegnate una regione tra Bim Two e denominate questa regione 2N. Per creare una maschera micronucleo, selezionate una cella binucleata contenente un micronucleo dalla raccolta immagini e aprite le maschere nella scheda Analisi.Per crearne una maschera di identificazione spot, fare clic su Nuovo e funzione e selezionare Spot. Verificare che il pulsante di opzione Luminoso sia selezionato e selezionare M07 sotto maschera. Impostate il rapporto di sfondo spot-cella e il raggio minimo su due e impostate il raggio massimo su sei.Fare clic su OK e SU OK per aggiungere la maschera all'elenco a sinistra e quindi su Nuovo per creare un'altra maschera. Fate clic sulla maschera Spot M07 Channel seven Bright two six two e fate clic sulla freccia in giù per aggiungerla alla definizione della maschera e fate clic su Operatori And e Not. Fare clic sulla freccia in giù per aggiungere la maschera dell'intervallo dilatato alla definizione della maschera.Per creare una maschera di popolazione polinucleata, fate clic su Analisi (Analysis), Maschere (Masks), Nuovo (New) e Funzione (Function). In Funzione selezionare Intervallo. In Maschera (Mask), selezionate Dilata spartiacque (Watershed Dilate Set M07 Channel07), Centrale (Middle), tre, due (Three, Two) e impostate l'immagine in modo che sia visualizzata sul canale 07.Impostate i valori di area minima e massima rispettivamente su 135 e 5000 e impostate i valori delle proporzioni minime e massime rispettivamente su 0,4 e uno. Fare clic su OK e nel campo nome modificare il testo in maschera POLY, quindi fare clic su OK e chiudi. Per creare una visualizzazione personalizzata, fare clic sul pulsante Proprietà raccolta immagini, aprire la scheda Compositi e fare clic su Nuovo.In Nome immettere Canale 01 fino al Canale 07. Fare clic su Aggiungi immagine e in Immagine selezionare Canale 01 e impostare la percentuale su 100. Fare di nuovo clic su Aggiungi immagine e in immagine selezionare Canale 07 e impostare la percentuale su 100.Fare clic sulla scheda Visualizza, su Nuovo e in Nome immettere maschere BNC e MN. Quindi fare clic su Aggiungi colonna e in Tipo immagine selezionare Canale 01 e in Maschera selezionare Nessuno. Fare clic su Aggiungi colonna e in Tipo immagine selezionare Canale 07 e in Maschera selezionare Nessuno.Fare clic su Aggiungi colonna, sul pulsante di opzione Composito e quindi su Ok per completare la visualizzazione personalizzata. Fate clic sul menu a discesa Visualizza (View) e fate clic sulla vista maschere BNC e MN . Fare clic sul pulsante Mostra nascondi maschere.Per enumerare gli eventi chiave, aprire la scheda Report e fare clic su Definisci report statistiche, quindi nella nuova finestra fare clic su Aggiungi colonne. Per aggiungere la statistica del conteggio delle celle binucleate, in Statistiche selezionare Conteggio e in Popolazione selezionata selezionare la popolazione BNC, quindi fare clic su Aggiungi statistiche per aggiungere la statistica all'elenco e salvare il modello. Dopo aver aggiunto tutte le statistiche all'elenco, fare clic su Chiudi, quindi su OK e quindi salvare il modello di analisi dei dati.Per elaborare in batch i file sperimentali, scegliere File di dati batch dal menu Strumenti e fare clic su Aggiungi batch nella nuova finestra. Fate clic su Aggiungi file (Add Files) per selezionare i file di esperimento da aggiungere al batch e fate clic sul pulsante Apri cartella (Open Folder) nell'opzione Seleziona un modello o un file di analisi dei dati. Passare al modello appena salvato e aprirlo.Fare clic su OK per chiudere la finestra corrente. Quindi fare clic su Invia batch per avviare l'elaborazione batch di tutti i file. Qui vengono visualizzati quattro pannelli selezionati per identificare le celle binucleate.Questi grafici e istogrammi bivariati consentono la selezione di cellule binucleate e l'identificazione di quelle cellule che hanno due nuclei con circolarità, aree e intensità simili e che sono ben separati l'uno dall'altro. Queste immagini di Brightfield e Hoechst, così come le maschere binucleate e micronucleus, facilitano l'identificazione e l'enumerazione di cellule binucleate e micronuclei. L'applicazione della caratteristica del conteggio spot utilizza la maschera polinucleata per identificare le cellule mononucleari, trinucleari e quadranucleari.Il numero di cellule tri e quadranucleari può quindi essere sommato per ottenere il numero finale di cellule polinucleate necessarie per il calcolo della citotossicità. Qui, i valori rappresentativi di genotossicità e citotossicità sono mostrati per la colchicina endogena, la mitomicina clastogena C e un controllo negativo, il mannitolo, per dimostrare la validità del protocollo. L'etichettatura delle cellule con un'adeguata concentrazione di macchie di DNA è fondamentale per garantire un'acquisizione di immagini di alta qualità, consentendo di identificare e segnare facilmente tutti gli eventi chiave.Queste tecniche sono applicabili anche al test del micronucleo per la biodosimetria da radiazioni, che consente la stima della dose in individui che potrebbero essere stati esposti alle radiazioni.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analizzando internalizzazione cellulare di nanoparticelle e batteri da Multi-spettrale Citometria a Flusso Imaging

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Ricerca

Bioingegneria

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

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Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

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Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

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Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

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Analisi dell'espressione genica di cellule endoteliali esposte per Shear Stress utilizzando più flusso parallelo-piastra Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

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Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Una piattaforma tecnologica open source per la produzione di modelli di cultura 3D basati su idrogel in modo automatizzato e standardizzato

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...