Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
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저자는 데이터 분석 템플릿의 이전 형태를 개발하는 그녀의 노력에 대한 크리스틴 Probst (루미넥스 공사) 감사뿐만 아니라 박사 헤일리 Pugsley (루미넥스 공사) 박사 필 모리시 (루미넥스 공사) 검토 및 편집 원고.

저자는 Luminex 공사에 의해 고용된다, 이 작품에 사용 된 ImageStream 다스펙트럼 이미징 유동 세포계의 제조 업체.

최근 발표된 Verma et al.에서는 유세포분석의 높은 처리량 이점과 이미지 분석의 데이터 및 이미지 저장 이점을결합한 시스템 개발의 중요성을 강조했다(35). 본 논문에 기재된 MIFC 체외 MN 분석법은 이러한 견적을 포화시키고 현미경 검사법 및 유세포분석법에서 전술한 많은 과제를 극복할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 여기서 설명된 프로토콜은 세포 독성 및 유독성 이 모두 MIFC를 사용하여 평가될 수 있음을 보여준다. 샘플 준비, 셀룰러 염색 및 데이터 수집은 간단하지만 프로토콜에는 항상 구현해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 세포에 염화칼륨(KCl)을 첨가하는 것은 세포를 팽창시키고, 주 핵 사이의 분리를 생성하는 데 중요하다. 이것은 마스킹 알고리즘이 그들의 열거에 필요한 BNCs 및 POLY 세포 (POLY 세포)에 있는 모든 개별적인 핵을 확인할 수 있다는 것을 확인합니다. 또한 KCL은 정확한 MN 마스킹 및 정량화에 필수적인 핵과 MN 사이의 분리를 제공합니다. 또한, KCl의 첨가 에 따른 포르말린의 사용은 원심분리 중에 세포가 용해되는 것을 방지합니다. Cytochalasin B의 추가는 하나 이상의 핵 분열을 겪은 TK6 세포를 아주 큰 원인이 됩니다. 그 결과, 세포질은 깨지기 쉬워지고 KCl첨가 직후원심분리가 수행되면 용해될 수 있다. 더욱이, 최종 농도에 따라가 아니라 시료의 세포 수에 따라 샘플에 Hoechst를 도입하는 것이 매우 중요하다. 예를 들어 Hoechst의 최종 농도는 1 x 106 세포의 샘플을 균일하게 염색하지만 5 x 106 세포를 포함하는 샘플을 적절하게 염색하지 않을 수 있으며 희미하게 염색 된 핵을 가진 많은 세포가 분석하기 어려울 수 있습니다. MIFC에 488 nm 및/또는 642nm 여기 레이저가 장착된 경우 MIFC에 405 nm 여기 레이저 또는 DRAQ5가 장착된 경우 Hoechst는 DAPI와 같은 다른 DNA 염료로 교체될 수 있습니다. 핵 얼룩을 수정하는 경우 필요한/원하는 레이저 전력에 적합한 농도를 찾기 위해 얼룩을 적정하는 것이 중요합니다.
MIFC에서 데이터를 수집할 때 그라데이션 RMS 피쳐에 대한 최적의 영역 경계를 결정하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 제시된 경계는 MIFC 계측기 간의 약간의 차이로 인해 조정이 필요할 수 있습니다. 데이터 수집 중에 이 기능을 적용하면 집중도가 높은 이미지를 캡처할 수 있습니다. 데이터 파일에 흐리거나 초점이 맞지 않는 이미지가 많이 포함된 경우 분석 소프트웨어의 마스킹 알고리즘이 흐린 영역의 얼룩 아티팩트를 잘못 강조 표시하여 MN으로 점수가 매겨진 거짓 긍정 아티팩트가 많을 수 있습니다. 여기에 설명된 이미지 처리 기술은 어려울 수 있지만 MIFC 소프트웨어에서 분석 템플릿이 개발되면 배치 처리를 통해 데이터 파일을 자동으로 분석할 수 있으므로 사용자의 개입이 제거되므로 득점자가 바이어스. 또한, TK6 세포 이외의 세포주가 분석을 수행하는 데 사용되는 경우, 세포의 형태학적 특성(예를 들어, 크기)이 TK6 세포의 것과 다를 것이기 때문에 마스크 및 영역 경계를 수정할 필요가 있을 것이다.
여기에 제시된결과 (도 5) 미토마이신 C 및 콜히친의 다양한 투여량에 TK6 세포를 노출시킬 때 MN 유도에서 통계적으로 유의한 증가를 보여준다. 용매 대조군과 비교했을 때 MN의 빈도에서 통계적으로 유의한 증가는 두 화학물질 모두에서 여러 투여량에 대해 관찰되었다. 또한, 만니톨의 투여량은 30% 이상의 세포독성을 유발하지 않으며, 예상대로 용매 대조군과 비교했을 때 MN의 빈도가 통계적으로 유의하게 증가하였다. 본 서에 기재된 프로토콜은 시험관 내 MN 분석결과를 수행하기 위해 MIFC를 사용하여 양성 및 음성 대조화학물질 모두에서 예상되는 결과를 제공한다. MN의 주파수뿐만 아니라 사이토 카인시스 블록 증식 지수 (CBPI)의 기준값을 개발하기 위해 용매 제어 및 음성 제어 화학 물질을 모두 사용하여 여러 실험을 수행하는 것이 매우 중요합니다. 유전자 독성의 경우, MN 주파수의 통계적으로 유의한 증가는 사용되는 세포 유형에 대해 잘 알려져 있어야 하는 기준선 MN 주파수와 비교를 통해 결정된다. 또한 모든 세포 독성 계산은 대조군 샘플의 CBPI를 기반으로 하므로 MONO, BNC 및 POLY 셀의 기준속도는 컨트롤에서 잘 정량화되어야 합니다.
MN 분석법의 맥락에서 MIFC를 사용하는 몇 가지 제한 사항 및 장점은 전작29,32에기재되어 있다. 주요 한계는 현미경 검사법과 비교할 때 MN 주파수가 낮아지는데, 이는 분석 소프트웨어에서 채점 기준을 구현할 때 유연성이 부족하고 MIFC의 제한된 피사계 심도에서 비롯될 수 있습니다. 잘 윤곽이 잡힌 마스크는 주요 핵을 정확하게 식별하기 위해 생성될 수 있지만 주요 핵을 만지거나 (또는 매우 가깝게) 하는 MN은 BNC 마스크 내에서 포착될 수 있다. 또한, 현미경 을 사용하여 오히려 쉽게 채점 될 수있는 매우 작은 MN은 작은 아티팩트점수를 피하기 위해 MN 마스크의 영역 매개 변수에 대한 하한으로 인해 MIFC를 사용할 때 잘못 누락되었을 수 있습니다. MIFC는 이미지 기반 데이터 분석에 존재하는 어려움 외에도 설계로 인해 3차원 셀룰러 개체의 2차원 프로젝션 이미지를 얻습니다. 이로 인해 일부 MN이 두 가지 주요 MN이 다른 초점 깊이에서 캡처되어 마스킹을 사용하여 매우 어둡고 비할 데 없는 것처럼 보입니다. 더욱이, MN의 작은 분수는 그(것)들을 가시화하고 점수를 불가능하게 하는 2개의 주요 핵의 뒤에 상주할 수 있었습니다. 따라서, 이러한 어려움을 고려하여, 낮은 용량에서 MN 주파수의 현저한 증가를 해석할 때 주의를 기울여야 한다.
이러한 단점에도 불구하고 여기에 설명된 MIFC 방법은 다른 기술에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. Fenech et al. MN 분석법36에대한 자동화 된 시스템 및 방법론을 개발할 때 고려해야 할 기준 및 지침을 제안했습니다. 이들은, 이에 제한되지 않으나, 주요 핵 및 세포질의 직접 시각화, 시험중인 화학 물질 또는 에이전트의 다양한 투여량으로부터 MN의 주파수의 결정 및 형태학을 정량화하고 모든 위치를 결정하는 능력을 포함한다. 핵과 MN은 세포질 내에 있는지 확인합니다. 이 논문은 시험관 내 MN 분석법을 수행하기 위해 개발된 MIFC 방법이 이러한 기준을 만족시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여준다. 구체적으로, 핵 및 MN의 이미지는 형광 레이저에 의해 포착될 수 있고 세포질 이미지는 BF LED를 사용하여 얻을 수 있다. 정상적인 핵 형태를 가진 세포의 이미지는 고급 마스크와 기능의 조합을 사용하여 불규칙한 형태를 가진 세포와 자동으로 분화 될 수 있습니다. 콜히친과 미토마이신 C(그림 5)에 대해 제시된 결과는 용매 대조군과 비교할 때 다양한 용량으로 유독성 및 세포독성을 평가할 수 있으며 통계적으로 유의한 MN 주파수가 어디에서 관찰된다는 것을 보여준다. 예상. 또한, OECD 시험 지침 487은 세포 독성을 결정하기 위해 시험 농도 당 적어도 500 세포와 함께 유독성을 결정하기 위해 MN의 존재를평가하기 위해 시험 농도 당 2,000 BNC를 채점할 것을 권장합니다 9; 이것은 수동 현미경 검사법을 사용하여 1 시간 이상 걸릴 수 있습니다. 이 논문의 프로토콜 및 결과는 약 6,000개의 BNC, 16,000개의 MONO 세포 및 800개의 POLY 세포가 약 20분 에서 시험 농도당 포획및 득점되었다는 것을 보여준다. 이러한 짧은 시간에 득점된 데이터 수집의 빠른 속도 및 높은 수의 후보 세포는 시험관 내 MN 분석을 수행하기 위해 MIFC를 채택하는 또 다른 중요한 이점을 강조한다.
이 백서에 제시된 결과는 고무적이지만 초기 개념 증명 방법을 대표합니다. 이 일은 Kirkland 등에서 제안한 것과 같은 여러 종류의 독성 및 세포 독성메커니즘을 다루는 더 크고 다양한 화학 세트에 대한 보다 철저한 조사에 의해 수행되어야 합니다. 그러나 시간이 많이 걸리고 노동이 집중적이며, 이 논문의 범위를 벗어나는 이러한 대규모 연구는 약한 유독성 물질을 안정적으로 식별하는 방법의 능력에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 여기에 제시된 방법론은 아직 마이크로웰 형식으로 소형화되지 않았으며, 이는 더 큰 용량 범위에서 보다 신속하고 효율적인 스크리닝을 허용할 것이다. 이와 같이, 현재의 형태로, 여기에 제시된 MIFC 기반 의 체외 MN 분석제는 노동 집약적인 후속 연구 또는 좋은 실험실 관행에 대한 연구에 가장 적합할 수 있다. 그러나, 이 방법은 계속 최적화되고 검증될 것이며, 세포의 비율을 증가시키는 무균 노출과 같은 형태와 관련된 화학적 특정 사건을 검출하는 데 있어 유연성을 높일 수 있는 잠재력을 지니고 있다. 비 원형 핵은 여전히 코클수38. 마지막으로, MIFC 방법은 MN 유도의 메커니즘에 대한 보다 포괄적인 뷰를 제공하기 위해 MN 분석법(예: 키네토코레 염색)에 추가적인 바이오마커를 도입할 수 있는 기회를 제공한다.

시험관 내 마이크로핵구(MN) 분석실험은 화학및 제약개발뿐만 아니라 다양한 에 노출된 개인들 간의 인간 생체모니터링과 같은 여러 연구 분야에서 세포독성 및 유전독성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 시험이다. 환경, 직업 또는라이프 스타일 요인 1,2,3. MN은 2개의 주요 딸 핵의 한으로 통합되지 않는 세포 분열 도중 생성된 염색체 단편 또는 전체 염색체로 이루어져 있습니다. 말단 말단 에 이어, 이 염색체 물질은 주요 핵 2중 하나에서 분리되는 세포질 안쪽에개별, 둥근 바디로 형성합니다. 따라서, MN은 DNA 손상을 대표하며, 수년 동안 유독성 검사4. MN을 측정하는 가장 적합한 방법은 사이토카인시스 블록 미세핵법(CBMN) 분석법이다. CBMN 분석법, 양핵세포(BNCs)에서의 MN의 빈도는 시토칼라신 B(Cyt-B)를 샘플내로 통합함으로써 채점될 수 있다. Cyt-B는 핵 분열을 허용하지만 세포 분열을 방지하므로 MN의 점수를한번만 분할한 BNC로 제한합니다.
현미경 검사법과 유세포분석법을 모두 이용한 프로토콜이 개발및 검증되었으며 시험관 내 MN 분석6,7,8,9,10, 11,12,13,14. 현미경 검사법은 MN이 합법적이지만 시간이 많이 걸리고 득점자15사이의 가변성을 가지고 있음을 시각적으로 확인할 수 있다는 이점을 제공합니다. 이를 해결하기 위해, 자동화 된 현미경 검사법은 슬라이드를 스캔하고 핵과 MN16,17,18,19의이미지를 캡처하기 위해 개발되었지만 세포질은 시각화 할 수 없으므로 MN이 실제로 특정 셀과 연관되어 있는지 확인하기가 어렵습니다. 더욱이, 이들 방법은 Cyt-B 9를 사용할 때 세포독성의 계산에 필요한 다핵(POLY) 세포(삼중 및 사분면세포 포함)를 식별하는 데 어려움을 겪는다. MN 분석법을 수행하기 위해 개발된 유세포분석법은 포염20,21에 이어 세포로부터 해방된 핵과 MN 모두의 집단을 식별하기 위해 전방 및 측 산란 강도뿐만 아니라 형광을 채용한다. ,22. 이를 통해 몇 분 안에 수천 개의 셀에서 데이터를수집할 수 있으며 자동화된 분석(23)을 허용합니다. 그러나 셀을 시각화할 수 없기 때문에 점수가 매겨진 이벤트가 정품인지 확인할 수 없습니다. 추가적으로, 세포막을 용해시키는 것은 Cyt-B의 사용을 억제할 뿐만 아니라 염색체 응집체 또는 세포사멸 체와 같은 다른 이물질을 포함하는 현탁액을 생성하고 이를 MN24와구별할 방법이 없다.
이러한 한계에 비추어, 다중 스펙트럼 이미징 유동 세포측정법(MIFC)은 현미경검사법의 고해상도 형광 이미지와 기존의 유세포분석의 통계적 견고성 및 속도를 결합하기 때문에 MN 분석법을 수행하는 이상적인 시스템입니다. MIFC에서 모든 세포는 유체 학 시스템으로 도입된 다음 유체 역학적으로 유동 세포 큐벳의 중심으로 집중됩니다. 모든 세포의 직교 조명은 브라이트필드(BF) 발광 다이오드(LED), 측면 산란 레이저 및(적어도) 하나의 형광 레이저를 사용하여 수행된다. 형광 광자는 3개(20x, 40x 또는 60x) 높은 수치 조리개 대물 렌즈 중 하나에 의해 포착된 다음 스펙트럼 분해 요소를 통과합니다. 그런 다음 광자가 충전 결합 장치(CCD) 카메라에 초점을 맞추어 유동 셀을 통과하는 모든 셀의 고해상도 이미지를 얻습니다. 흐리거나 줄무늬를 방지하기 위해 CCD는 흐름이 흐르는 셀의 속도와 동기화하여 CCD를 행에서 행아래로 연속으로 전송하여 개체를 추적하는 시간 지연 통합(TDI) 모드에서 작동합니다. 그런 다음 픽셀 정보는 마지막 픽셀 행에서 수집됩니다. 스펙트럼 분해와 결합된 TDI 이미징을 통해 최대 12개의 이미지(2 BF, 10 형광)를 유동 세포를 통과하는 모든 세포에서 동시에 캡처할 수 있습니다. 캡처된 모든 이미지는 샘플별 데이터 파일에 저장되어 MIFC 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 언제든지 분석을 수행할 수 있습니다. 마지막으로 데이터 파일은 모든 이변량 도표에서 셀룰러 이미지와 점 사이의 링크를 유지합니다. 즉, 기존의 이변량 플롯의 모든 점을 강조 표시할 수 있으며 해당 BF 및 형광 이미지가25로표시됩니다.
최근, MIFC 기반 의 방법은 분류 방사선 생체 도질학26,27,28,29,30,31 및 유전 모두에 대한 MN 분석법을 수행하기 위해 개발되었다. 독성학32,33 테스트. 이 연구는 주요 핵, MN 및 세포질의 세포 이미지가 다른 방법26보다더 높은 처리량으로 이미지화될 수 있음을 입증했다. MONO 셀, BNC(MN 유무) 및 폴리 셀을 포함한 분석에 필요한 모든 세포 유형은 MIFC 데이터 분석 소프트웨어에서 자동으로 식별될 수 있으며, Fenech et al.에 의해 개발된 채점 기준의 구현은 이를 통해 달성됩니다. 다양한 수학 알고리즘6,34의사용 . 생체 측정법으로부터의 결과는 BNC29당MN의 비율을 정량화할 때 문헌의 다른 자동화된 방법으로부터 수득된 것과 크기면에서 투여량 응답 교정 곡선이 유사하다는 것을 보여주었다. 또한, 독성학의 최근 작업은 MONO 세포, BNC (MN 유무에 관계없이) 및 POLY 세포의 이미지가 MIFC를 사용하여 자동으로 캡처, 식별, 분류 및 열거 될 수 있음을 입증했습니다. 프로토콜 및 데이터 분석은 TK6 세포를 여러 클라스토겐 및 기뉴겐(32)에 노출한 후세포 독성 및 유전독성의 계산을 가능하게 하였다.
본 백서에 제시된 프로토콜은 MIFC를 사용하여 시험관내 MN 분석법을 수행하는 방법을 설명한다. 이 작업에 사용되는 샘플 처리 기술은 단일 샘플을 처리하는 데 2시간 미만이 필요하며 다른 방법에 비해 상대적으로 쉽게 수행할 수 있습니다. MIFC 분석 소프트웨어의 데이터 분석은 복잡하지만 이 백서에 설명된 단계에 따라 몇 시간 안에 분석 템플릿을 만들 수 있습니다. 또한 템플릿이 만들어지면 추가 작업 없이 수집된 모든 데이터에 자동으로 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 TK6 세포를 클라스토겐및 어뉴겐에 노출하는 데 필요한 모든 단계를 간략하게 설명하고, 세포를 배양, 처리 및 염색하는 방법을 설명하고, MIFC를 사용하여 고해상도 이미지를 획득하는 방법을 보여줍니다. 또한 이 백서는 세포 독성과 유전독성을 모두 계산하기 위한 목적으로 MONO 세포, BNC 및 폴리 세포를 자동으로 식별하고 점수를 매기기 위해 MIFC 소프트웨어의 데이터를 분석하기 위한 현재 모범 사례를 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

시험관 내 마이크로핵 (MN) 분석은 세포 독성 및 유독성을 평가하기 위하여 수시로 이용됩니다 그러나 수동 현미경 검사법을 통해 분석결과를 득점하는 것은 힘들고 득점자 사이 가변성 때문에 결과에 있는 불확실성을 소개합니다. 이를 해결하기 위해 자동 슬라이드 스캐닝 현미경 검사법과 기존의 유세포 분석 방법이 도입되어 득점자 편향을 제거하고 처리량을 개선했습니다. 그러나, 이러한 방법은 세포의 세포질을 시각화할 수 없고 유세포측정을 통한 시각적 MN 검증 또는 이미지 데이터 스토리지의 부족과 같은 고유한 한계를 가지고 있다. 다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정 (MIFC)는 이 한계를 극복할 가능성이 있습니다. MIFC는 현미경 검사법의 고해상도 형광 이미지와 기존의 유세포 분석의 통계적 견고성 및 속도를 결합합니다. 또한 수집된 모든 이미지는 용량별 파일에 저장할 수 있습니다. 이 백서에서는 MIFC에서 MN 분석의 완전 자동화버전을 수행하기 위해 개발된 프로토콜에 대해 설명합니다. 인간 림프모세포 TK6 세포를 저혈압 용액(75 mM KCl)을 사용하여 확대하였고, 4% 포르말린으로 고정하고 핵 함량을 Hoechst 33342로 염색하였다. 모든 샘플은 MIFC에서 현탁액으로 실행되어 분석에 필요한 모든 주요 이벤트의 고해상도 이미지 획득을 허용했습니다(예를 들어 MN유무에 관계없이 양핵세포뿐만 아니라 단핵핵및 다핵구세포). MIFC 데이터 분석 소프트웨어에서 이미지를 자동으로 식별, 분류 및 동그마리로 표시하여 세포 독성과 유전독성을 자동으로 채점할 수 있습니다. 결과는 MIFC를 사용하여 시험관 내 MN 분석기를 수행하면 TK6 세포의 노출 후 용매 대조군과 비교할 때 MN 주파수의 통계적으로 유의한 증가를 세포 독성의 여러 다른 수준에서 검출할 수 있음을 보여줍니다. 미토마이신 C 및 콜치친, 그리고 만니톨에 노출된 후 MN 빈도의 유의한 증가가 관찰되지 않는다는 것을.

이 백서에 설명된 분석 방법을 통해 MN 유무에 관계없이 BNC의 자동 식별 및 채점을 통해 유독성을 계산할 수 있습니다. 또한 MONO 및 POLY 세포는 세포 독성을 계산하기 위해 자동으로 식별되고 점수가 매겨지기도 합니다. 게시된 점수매기기 기준 6,34는 이러한 이벤트를 채점할 때 준수해야 하는 MIFC 데이터 분석 소프트웨어에서 구현된다. 여기에 제시된 결과는 세포 독성이 증가하는 MN 주파수에서 통계적으로 유의한 증가가 잘 알려진 MN 유도 화학물질(미토마이신 C 및 콜히친)에 인간 림프구성 세포TK6 세포의 노출에 따라 검출될 수 있음을 나타낸다. 시험된 추가 화학물질에 대한 유사한 결과는 별도의 간행물32에서입증되었다. 또한 Mannitol의 사용으로 인한 결과는 여기에 설명된 MIFC 방법을 사용하여 비 MN 유도 화학 물질도 올바르게 식별될 수 있음을 보여줍니다. 모든 마스크, 특징 및 영역 경계를 생성하기 위해 프로토콜에 설명된 파라미터는 다른 세포 유형(예: 중국 햄스터 셀)이 분석을 수행하는 데 사용되는 경우 조정되어야 할 것입니다.
그림 3은 BNC를 식별하기 위해 선택된 4개의 패널을 보여 주며(그림3A-3D). 여기에 표시된 히스토그램은 두 개의 핵을 가진 세포의 선택을 가능하게 하는 히스토그램(그림3A)및 유사한 원형을 가진 BNC의 선택을 가능하게 하는 이변량 플롯(그림3B), 유사한 영역 및 강도(그림3C) ) 및 BNC는 점수 등급 에 따라 잘 분리된, 비중첩 핵(그림3D)을 스코어링 크리티에리아6,34에따라 한다. 그림 3 E는 단일 또는 다중 MN을 가진 BNC가 식별되고 열거될 수 있음을 나타내는 BNC 및 MN 마스크뿐만 아니라 BF 및 Hoechst 이미지를 나타낸다. 이것은 최종 BNC 인구에 있는 micronucleated BNC의 비율을 결정하여 유독성이 계산될 수 있게 합니다. 그림 4는 POLY 마스크를 사용하여 MONO, TRI 및 QUAD 셀을 식별하는 스팟 카운트 기능의 적용을 보여줍니다. TRI 및 QUAD 셀의 개수는 최종 폴리 셀 수를 얻기위해 합산될 수 있다(표 1). 이를 통해 프로토콜에 도시된 수식을 사용하여 세포 독성을 계산할 수 있습니다. 따라서, 실험에서 각 투여 지점은 유독성 및 세포독성 파라미터 모두에 의해 평가될 수 있다.
도 5는 아누겐 콜치친, 클라스토겐 미토마이신 C 및 음의 대조군, 만니톨에 대한 유전자 독성 및 세포독성 값을 나타낸다. 콜히친(도5A)의 경우 0.02 내지 0.05 μg/mL 투여량은 MN 빈도에서 통계적으로 유의한 증가를 일으켰으며, 용매 대조군을 통해 각각 1.28%에서 2.44%까지 다양하였다(표 1). 미토마이신 C의 경우 (그림5B) 용매 대조군과 비교할 때 0.4 및 0.5 μg/mL의 2개의 최고 투여량이 통계적으로 유의한 MN 주파수를 생성하였다. 이들 MN 주파수는 0.4 μg/mL에서 0.93%, 0.5 μg/mL에서 1.02%였다(표 2). 마지막으로, Mannitol(도5C)의 경우, 시험된 투여량은 30% 이상의 세포독성을 유도하지 않으며, 예상대로 용매 대조군과 비교했을 때 MN 주파수에서 현저한 증가를 일으키지도 않았다(표 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> 그림 1 : MIFC 계측기 설정. 프로토콜의 섹션 7에 설명된 대로 MIFC 설정의 스크린샷입니다. (A) 405 nm 레이저 전력을 10mW로 설정합니다. (B) BF 채널 1 및 9를 설정합니다. (C) 60배 배율 대물렌즈선택. (D) 가장 높은 해상도의 이미지를 생성하는 가장 느린 유속을 선택합니다. (E) 수집할 이벤트 수를 20,000개로 지정합니다. (F) 로드 버튼을 클릭하여 샘플 로드 프로세스를 시작합니다. (G) 획득 버튼을 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다. (H) 반환 단추를 클릭하여 사용하지 않은 샘플을 반환합니다. (I) 단일 셀의 선택을 위한 BF 종횡비 대 BF 면적의 산점도. (J) 집중 된 세포의 선택을위한 BF 그라데이션 RMS 대 Hoechst 그라데이션 RMS의 산시도. (K) DNA 양성 세포의 선택을 위한 Hoechst 강도의 히스토그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> 그림 2 : 분석 소프트웨어 게이팅 전략. 프로토콜의 섹션 9에 설명된 게이팅 전략의 스크린샷입니다. 영역은 이중 핵 세포 (적색 상자), 미세 핵 (노란색 상자), 및 단핵 및 다중 핵 세포 (파란색 상자)의 식별을 위해 순차적으로 도시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> 그림 3 : MN 유무에 관계없이 BNC의 식별 및 채점 (A) 두 개의 뚜렷한 핵을 가진 세포의 선택. (B) 종횡비 강도 기능을 사용하여 2개의 고원형 핵을 가지는 이중핵세포(BNCs)의 식별. (C) 유사한 영역과 강도를 가진 핵을 가진 BNC의 선택. 이것은 둘 핵의 면적의 비율과 두 핵의 종횡비 비율을 계산함으로써 달성된다. (D) 두 개의 잘 분리된 핵을 가진 BNC를 식별하기 위해 형상 비율 및 종횡비 기능을 사용합니다. (e) 단일 또는 다중 MN을 가진 BNC가 식별되고 열거될 수 있음을 입증하는 마이크로핵큐피우스(MN) 마스크를 사용한 스팟 카운트 기능. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> 그림 4 : MONO 및 폴리 셀의 식별 및 채점. 스팟 카운트 피처를 사용하여 모노, 트라이- 및 사분면 세포를 식별하고 여반합니다. 컴포넌트 마스크 1은 단핵구 세포(상단 이미지)의 식별을 허용한다. 성분 마스크 1 ~ 3은 삼각형 세포 (중간 이미지)의 식별을 허용합니다. 성분 마스크 1 ~ 4는 사분면 세포 (하단 이미지)의 식별을 허용합니다. 이 수치는 로드리게스 201832에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> 그림 5 : 세포독성 정량화. 세포독성은 사이토카인시스 블록 증식 지수(black circles)를 이용하여 정량화하고, 3시간 노출 후 MN(클리어 바)의 백분율을이용하여 정량화하고 24시간 회복(A) 콜히친, (B) 미토마이신 C 및 ( C)만니톨. 대조군과 비교하여 MN 빈도의 통계적으로 유의한 증가는 별(카이제곱 테스트; * p&0.05, **p< 0.01, ***p < 0.001)으로 표시됩니다. 모든 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다. 이 수치는 로드리게스 201832에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> 표 1: Colchicine에 대한 세포 독성 (단핵, 이중 및 다핵 구종 세포의 수) 및 유독성 (미세 핵 핵 이핵세포의 수 및 백분율)을 계산하는 데 필요한 매개 변수. 모든 계산된 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> 표 2: T그는 세포 독성 (단핵, 이중 핵 및 다중 핵 세포의 수) 및 유독성 (미세 핵 이핵화 된 세포의 수 와 백분율)을 미토 마이신 C에 대해 계산하는 데 필요한 매개 변수. 모든 계산된 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> 표 3: Mannitol에 대한 세포 독성 (단핵, 이중 및 다핵 구종 세포의 수) 및 유독성 (미세 핵 핵 이핵세포의 수 및 백분율)을 계산하는 데 필요한 매개 변수. 모든 계산된 수량은 각 투여 지점에서 2개의 복제물의 평균이다.
보충 1: 전체 프로토콜. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 2: 마스크 목록. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

시험관 내 미세핵 분석은 유전체 독성 및 세포 독성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법이지만 수동 현미경 을 사용하여 분석법을 채점하는 것은 힘들고 주관성 및 득점자 간 가변성으로 고통받고 있습니다. 이 논문은 다중 스펙트럼 화상 진찰 유동 세포측정을 사용하여 분석의 완전 자동화된 버전을 능력을 발휘하기 위하여 개발된 프로토콜을 기술합니다.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

이미지 스트림 기반 미세 핵 분석법은 낮은 처리량 및 이벤트의 시각적 확인 부족을 포함하여 자동화된 현미경 검사법과 종래의 유동 세포측정과 같은 방법의 몇 가지 한계를 극복할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 지독성과 세포 독성을 결정하는 데 필요한 모든 이벤트가 현미경 슬라이드를 만들 필요없이 자동으로 이미지, 식별 및 득점 될 수 있다는 것입니다. 클라스토겐 및/또는 무균에 세포 노출을 위해, T25 플라스크에서 적절한 세포 배양 배지의 9밀리리터에서 실험 세포의 5분의 1에 7~8회 10에 관심 있는 화학 물질의 1밀리미터를 대조군 배양에 넣고 1밀리리터의 물을 대조문화에 추가한다.플라스크당 15밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 세포를 옮기기 전에 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3시간 동안 배양합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 새로운 T25 배양 플라스크에서 파종하기 위한 튜브 당 신선한 배양 배지의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보종한다. 그런 다음 각 플라스크에 150 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 3마이크로그램의 최종 농도를 달성합니다.경제협력개발기구(OECD)가 권고한 대로 1.5~2배의 회복시간을 인큐베이터에 반환한다. 회복 기간이 끝나면 원심분리를 위해 개별 15 밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 배양을 옮기고 75밀리머 칼륨염의 5밀리리터로 펠릿을 재보종한다. 반전으로 부드럽게 섞어서 샘플을 섭씨 4도에서 7분간 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 각 샘플에 4퍼센트 포르말린의 밀리리터 2개를 추가하고 3개의 반전과 부드럽게 섞습니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하기 전에 샘플을 섭씨 4도로 10분 간 반품합니다. 20 분 동안 신선한 4 % 포르말린의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.인큐베이션이 끝나면 고정 된 세포를 튜브 당 세척 버퍼 5 밀리리터로 원심 분리에 의해 세척하고 튜브 당 세척 버퍼 100 마이크로 리터로 펠릿을 다시 분리하십시오. 다음으로, 혈혈계에 계산하기 위한 개별 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 샘플을 전송합니다. 밀리리터 당 1.0 x 10당 100 마이크로그램의 마이크로리터 5개, 밀리리터당 6개 세포에 1.0 x 10마이크로리터, 튜브당 100마이크로리터당 500마이크로리터를 밀리리터 RNase당 500마이크로리터를 첨가한다.섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 이산화탄소 5%를 인큐베이션한 후, 미세원심분리기에서 샘플을 원심분리하고 각 튜브에서 30마이크로리터를 제외한 모든 것을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 시료를 다시 중단하여 거품 형성을 유도하지 않도록주의하십시오. 재서스펜션 시 거품이 나타나면 튜브를 부드럽게 쓸어 제거합니다.다중 스펙트럼 이미징 흐름 세포측정에 의해 샘플을 실행하려면 먼저 405 나노미터 레이저를 켜고 레이저 전력을 10 밀리와트로 설정합니다. 측면 분산 레이저를 포함한 다른 모든 레이저를 사용하지 않도록 설정하고 밝은 필드를 채널 1및 9로 설정합니다. 배율 슬라이더가 60배로 설정되어 있고, 고감도 모드가 선택되고, 채널 1, 7, 9만 이미지 갤러리에 표시되는지 확인합니다.분산 플롯을 클릭하고 X 축의 모든 모집단 및 면적 M01을 선택합니다. Y 축에서 종횡비 M01을 선택하고 사각형 영역을 클릭하여 단일 셀 주위에 영역을 그립니다. 이 영역의 단일 셀이름을 지정하고 플롯을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 지역을 선택합니다.단일 셀 영역을 강조 표시하고 X 좌표를 100 및 900으로 변경하고 Y 좌표를 0.75 및 1로 변경합니다. 획득 매개 변수를 설정하고 파일 이름과 대상 폴더를 지정합니다. 그런 다음 이벤트 수를 20, 000으로 변경하고 DNA 양성 집단을 선택하고 첫 번째 샘플을 실행합니다.IDEA에서 데이터 파일을 열려면 분석 시작을 클릭하여 파일 마법사 열기를 시작하고 원하는 원시 이미지 파일을 선택하려면 찾아봅합니다. 그런 다음을 클릭하고 이미지 갤러리에서 이중 핵세포를 찾아봅누를 수 있습니다. 마스크를 만들려면 클릭하여 관심 이미지를 선택하고 분석 탭을 엽니다.마스크, 새 기능 및 함수를 클릭하여 LevelSet을 선택합니다. 마스크 에서 M07 및 중간 레벨 마스크를 선택하고 등고선 세부 크기 조정을 3으로 설정합니다. 그런 다음 확인을 두 번 클릭합니다.이중 핵셀 피처 수를 발견하려면 분석 탭을 열고 피처 및 새 기능을 선택합니다. 피처 유형의 경우 스팟 카운트를 선택합니다. 마스크의 경우 최종 이중 핵이 있는 마스크를 선택하고 결합을 4개로 설정한 다음 이름을 스팟 카운트 BNC로 변경하고 확인을 클릭하고 닫기하여 피처 값을 계산합니다.스팟 카운트 바이뉴클레아드 세포 히스토그램을 보려면 히스토그램을 클릭하고 비아포토픽을 부모 집단으로 선택하십시오. X 축 피쳐의 경우 스팟 카운트 BNC를 선택하고 확인 및 선형 영역을 클릭한 다음 Bim Two에서 영역을 그리고 이 영역 2N이름을 지정합니다. 마이크로핵 마스크를 만들려면 이미지 갤러리에서 미세 핵을 포함하는 이중 핵세포를 선택하고 분석 탭에서 마스크를 엽니다.스팟 식별 마스크 하나를 만들려면 새 기능 및 함수를 클릭하고 스팟을 선택합니다. 밝은 라디오 버튼이 선택되어 있는지 확인하고 마스크 에서 M07을 선택합니다. 스팟을 셀 배경 비율과 최소 반지름을 두 개로 설정하고 최대 반지름을 6으로 설정합니다.확인을 클릭하고 확인을 클릭하여 왼쪽의 목록에 마스크를 추가한 다음 새 마스크를 클릭하여 다른 마스크를 만듭니다. 스팟 M07 채널 7 브라이트 두 개의 두 개의 두 개의 마스크를 클릭하고 마스크 정의에 추가하고 And 및 Not 연산자를 클릭다운 화살표를 클릭합니다. 아래쪽 화살표를 클릭하여 마스크 정의에 확장 된 범위 마스크를 추가합니다.폴리핵형 인구 마스크를 만들려면 분석, 마스크, 새 및 기능을 클릭합니다. 함수에서 범위를 선택합니다. 마스크에서 유역 증류수 세트 M07 채널07, 중간, 3, 2를 선택하고 채널을 07에 표시하도록 이미지를 설정합니다.최소 면적 및 최대 면적 값을 각각 135 및 5000으로 설정하고 최소 및 최대 종횡비 값을 각각 0.4와 1로 설정합니다. 확인을 클릭하고 이름 필드에서 텍스트를 변경하여 POLY 마스크를 읽은 다음 확인 및 닫기를 클릭합니다. 사용자 지정 보기를 만들려면 이미지 갤러리 속성 단추를 클릭하고 복합 정보 탭을 열고 새 뷰를 클릭합니다.이름 아래에 채널 01을 채널 07로 입력합니다. 이미지 추가를 클릭하고 이미지 아래에서 채널 01을 선택하고 백분율을 100으로 설정합니다. 이미지 추가를 클릭하고 이미지 아래에서 채널 07을 선택하고 백분율을 100으로 설정합니다.보기 탭을 클릭하고 새 탭을 클릭하고 이름 아래BNC 및 MN 마스크를 입력합니다. 그런 다음 열 추가를 클릭하고 이미지 유형 에서 채널 01과 마스크 아래에서 선택하여 없음을 선택합니다. 열 추가를 클릭하고 이미지 유형 아래에서 채널 07을 선택하고 마스크 아래에서 없음을 선택합니다.열을 클릭하고 복합 라디오 버튼을 클릭한 다음 Okay를 클릭하여 사용자 지정 보기를 완료합니다. 풀다운 보기 메뉴를 클릭하고 BNC 및 MN 마스크 보기를 클릭합니다. 숨기기 마스크 표시 버튼을 클릭합니다.주요 이벤트를 열거하려면 보고서 탭을 열고 통계 정의 보고서를 클릭한 다음 새 창에서 열 추가를 클릭합니다. 통계에서 이중 핵으로 된 셀 카운트 통계를 추가하려면 BNC 채우기를 선택한 다음 통계 추가를 클릭하여 목록에 통계를 추가하고 템플릿을 저장합니다. 모든 통계가 목록에 추가되면 닫기를 클릭한 다음 확인을 클릭한 다음 데이터 분석 템플릿을 저장합니다.도구 메뉴에서 실험 파일을 일괄 처리하려면 일괄 처리 데이터 파일을 클릭하고 새 창에서 일괄 처리 추가를 클릭합니다. 파일 추가를 클릭하여 실험 파일을 선택하여 일괄 처리에 추가하고 템플릿 또는 데이터 분석 파일 선택 옵션 에서 열린 폴더 단추를 클릭합니다. 방금 저장된 템플릿을 찾아보고 엽니다.확인을 클릭하여 현재 창을 닫습니다. 그런 다음 일괄 처리 제출을 클릭하여 모든 파일의 일괄 처리를 시작합니다. 여기서, 이중핵세포를 식별하기 위한 4개의 선택된 패널이 도시된다.이러한 편변량 플롯 및 히스토그램은 이중 핵 세포의 선택뿐만 아니라 유사한 원형, 영역 및 강도와 함께 두 개의 핵을 가지고 있고 서로 잘 분리되는 세포의 식별을 가능하게합니다. 이 브라이트필드 와 Hoechst 심상은 양핵 세포 및 미세 핵 마스크뿐만 아니라 이중 핵세포 및 미세 핵의 식별 및 열거를 용이하게합니다. 현물 카운트 피쳐의 적용은 폴리핵 마스크를 사용하여 단일핵, 삼핵 및 사분핵 세포를 식별합니다.그런 다음 삼중 핵 세포의 수를 합산하여 세포 독성 계산에 필요한 폴리핵 세포의 최종 수를 얻을 수 있다. 여기서, 대표적인 게놈 독성 및 세포독성 값은 프로토콜의 유효성을 입증하기 위해 내균 콜시친, 클로스토겐 미토마이신 C 및 음의 대조군, 매니톨에 대해 도시된다. DNA 얼룩의 적절 한 농도 세포를 레이블링은 높은 품질의 이미지 캡처를 보장 하기 위해 중요 하다, 모든 주요 이벤트를 쉽게 식별 하 고 득점 할 수 있도록.이러한 기술은 또한 방사선 생물도시메트리에 대한 미세 핵 분석법에 적용되며, 이는 방사선에 노출되었을 수 있는 개인의 투여량 추정을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

연구

생체공학

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

멀티 스펙트럼 이미징 유동 세포 계측법과 세포의 현지화 및 탄소 나노 튜브의 상대 정량

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

<em&gt; 체외</em&gt; 효소 분석은 갈륨 (III) 및 H에 의해 전사 억제를 측정하기 위해<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15 트리스 (펜타 플루오로 페닐) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

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미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

가 여러 명의 병렬 접시 흐름 챔버를 사용 하 여 스트레스에 노출 된 내 피 세포의 유전자 표정 분석

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

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광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출

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암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

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