Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Forfatteren takket Christine Probst (Luminex Corporation) for sin innsats i utviklingen av tidligere former for dataanalyse mal, samt Dr. Haley Pugsley (Luminex Corporation) og Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) for gjennomgang og redigering av Manuskriptet.

Forfatteren er ansatt av Luminex Corporation, skaperen av ImageStream multispectral Imaging Flow flowcytometer som ble brukt i dette arbeidet.

I en fersk publikasjon Verma et al. understreket viktigheten av å utvikle et system som kombinerer høy gjennomstrømming fordelen av Flow flowcytometri med data og bilde lagring fordelene med bildeanalyse35. Den MIFC in vitro MN analysen beskrevet i dette papiret tilfredsstiller dette sitatet, og har potensial til å overvinne mange av de nevnte utfordringene i mikroskopi og flyt flowcytometri metoder. Protokollen som beskrives her, viser at både cytotoksisitet og gentoksisitet kan evalueres ved hjelp av MIFC. Prøve forberedelser, mobilnettet farging og datainnsamling er grei, men det er noen kritiske trinn i protokollen som skal alltid implementeres. Tilsetning av kalium klorid (KCl) til cellene er avgjørende for å hovne opp cellene, genererer separasjon mellom de viktigste kjerner. Dette sikrer at maskering algoritmen kan identifisere alle individuelle kjerner i BNCs og POLY celler (POLY celler) som er nødvendig for deres opplisting. I tillegg gir KCL separasjon mellom kjerner og MN, som er avgjørende for nøyaktig MN maskering og kvantifisering. Videre, bruk av formalin etter tilsetning av KCl hindrer celler fra lysering under sentrifugering. Tillegg av Cytochalasin B forårsaker TK6 celler som har gjennomgått mer enn en kjernefysisk divisjon for å være ganske stor. Som et resultat blir cytoplasma skjør og kan lyse hvis sentrifugering utføres umiddelbart etter tilsetning av KCl. Videre er det svært viktig å innføre Hoechst til prøven i henhold til antall celler i prøven og ikke i henhold til en endelig konsentrasjon. For eksempel vil en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL av Hoechst bli jevnt flekker på en prøve på 1 x 106 celler, men det kan ikke være tilstrekkelig flekker på en prøve som inneholder 5 x 106 celler og kan resultere i mange celler med svakt fargede kjerner, noe som gjør analysen vanskelig. Det er også viktig å merke seg at Hoechst kan erstattes med en annen DNA fargestoff som DAPI hvis MIFC er utstyrt med 405 NM eksitasjon laser eller DRAQ5 hvis MIFC er utstyrt med 488 NM og/eller 642nm eksitasjon laser (s). Hvis du endrer den kjernefysiske flekken, er det avgjørende å titrere flekken for å finne riktig konsentrasjon for ønsket/ønsket laser kraft.
Når du samler inn data på MIFC, er det viktig å bestemme de optimale område grensene for gradient RMS-funksjonene. Grensene som presenteres i denne protokollen kan kreve justering på grunn av noen små variasjoner mellom MIFC instrumenter. Anvendelsen av denne funksjonen under datainnsamlingen er avgjørende for å sikre at svært fokuserte bilder fanges opp. Hvis datafiler inneholder mange uklare eller ufokusert bilder, er det sannsynlig at maskerings algoritmer i analyseprogramvaren vil feilaktig markere flekker gjenstander i uskarpe områder, fører til et høyt antall falske positive gjenstander blir scoret som MN. Selv om bildebehandling teknikker beskrevet her kan være vanskelig, når en analyse mal er utviklet i MIFC programvare, batch prosessering gjør det mulig for datafiler som skal automatisk analyseres, eliminerer brukermedvirkning og derfor scorer Bias. Også, hvis en cellelinje enn TK6 celler brukes til å utføre analysen, vil det være nødvendig å endre masker og region grenser som morfologiske egenskaper (f. eks størrelse) av celler vil avvike fra de av TK6 celler.
Resultatene som presenteres her (figur 5) viser statistisk signifikant økning i MN induksjon når utsette TK6 celler til ulike doser av Mitomycin C og kolkisin. Statistisk signifikant økning i hyppigheten av MN sammenlignet med løsemiddel kontroller ble observert i flere doser i begge kjemikalier. I tillegg, ingen dose av mannitol indusert en cytotoksisitet over 30%, eller en statistisk signifikant økning i hyppigheten av MN sammenlignet med løsemiddel kontroller, som forventet. Protokollen som er beskrevet i dette dokumentet ved hjelp av MIFC for å utføre in vitro MN-analysen gir forventede resultater fra både positive og negative kontroll kjemikalier. Det er svært viktig å utføre en rekke eksperimenter ved hjelp av både løsemiddel kontroller og negativ kontroll kjemikalier for å utvikle Baseline verdier av både frekvensen av MN samt Cytokinesi Block spredning index (CBPI). For gentoksisitet, statistisk signifikant økning i MN frekvens bestemmes gjennom sammenligning med Baseline MN frekvenser som må være kjent for celletypen som brukes. I tillegg er alle cytotoksisitet beregninger basert på CBPI av kontroll prøvene og derfor må Baseline utbredelsen av MONO-, BNCs-og POLY-celler være godt kvantifisert i kontroller.
Flere begrensninger og fordeler ved å bruke MIFC i sammenheng med MN-analysen har blitt beskrevet i tidligere arbeid29,32. De viktigste begrensningene gjelder lavere MN frekvenser i forhold til mikroskopi, som trolig skyldes både mangel på fleksibilitet ved implementering av scoring kriterier i analyseprogramvare samt begrenset dybdeskarphet av MIFC. Godt profilerte masker kan opprettes for å nøyaktig identifisere de viktigste kjerner, men MN som er rørende (eller svært nær) de viktigste kjerner kan være fanget i BNC maske. I tillegg svært små MN som kan være ganske lett scoret ved hjelp av mikroskopi er trolig feil savnet når du bruker MIFC grunn nedre grense på området parameteren på MN maske for å unngå scoring små gjenstander. I tillegg til vanskelighetene til stede i bilde-basert dataanalyse, på grunn av sin design, MIFC henter todimensjonale projeksjon bilder av tredimensjonale cellulære objekter. Dette sannsynligvis fører til at noen MN å bli fanget på en annen dybde i fokus at de to viktigste MN, noe som gjør dem vises veldig svakt og un-scorable bruker maskering. Videre, en liten brøkdel av MN kunne ligge bak en av de to viktigste kjerner, noe som gjør dem umulig å visualisere og score. Derfor, med tanke på disse vanskelighetene, bør forsiktighet brukes når tolke betydelige økninger i MN frekvens ved lave doser.
Til tross for disse svakhetene, MIFC metoden beskrevet her tilbyr flere fordeler fremfor andre teknikker. Fenech et al. foreslåtte kriterier og retningslinjer som bør vurderes ved utvikling av automatiserte systemer og metoder for MN-analyser36. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, direkte visualisering av de viktigste kjerner og cytoplasma, fastsettelse av hyppigheten av MN fra ulike doser av kjemiske eller agent blir testet og evnen til å quantitate morfologi og bestemme plasseringen av alle kjerner og MN for å sikre at de er innenfor cytoplasma. Dette papiret viser at MIFC metoden utviklet for å utføre in vitro MN analysen tilfredsstiller (eller besitter potensialet for å tilfredsstille) disse kriteriene. Spesielt, bilder av kjerner og MN kan fanges opp av fluorescerende lasere mens cytoplasmatiske bilder kan fås ved hjelp av BF LED. Bilder av celler med normal kjernefysisk morfologi kan automatisk skilles fra disse cellene med uregelmessig morfologi ved hjelp av en kombinasjon av avanserte masker og funksjoner. Resultatene som presenteres for Kolkisin og Mitomycin C (figur 5) viser at både gentoksisitet og cytotoksisitet kan vurderes ved ulike doser sammenlignet med løsemiddel kontroller, og at statistisk signifikante FREKVENSER for MN observeres Forventet. Videre anbefaler OECD test retningslinjen 487 scoring 2 000 BNCs per test konsentrasjon for å vurdere tilstedeværelsen av MN å bestemme gentoksisitet sammen med minst 500 celler per test konsentrasjon for å avgjøre cytotoksisitet9; Dette kan ta over 1 time ved hjelp av manuell mikroskopi. Protokollen og resulterer i dette papiret viser at et gjennomsnitt på ca 6 000 BNCs, 16 000 MONO celler, og 800 POLY celler ble fanget og scoret per test konsentrasjon i ca 20 min. Den raske hastigheten på datainnsamling og det høye antallet kandidat celler scoret på så kort tid markere en annen viktig fordel ved å ansette MIFC å utføre in vitro MN-analysen.
Mens resultatene som presenteres i denne utredningen er oppmuntrende, de er representative for en tidlig proof-of-konsept metode. Dette arbeidet bør følges opp av grundigere undersøkelser av et større, mer mangfoldig kjemisk sett som dekker flere klasser og mekanismer for gentoksisitet og cytotoksisitet slik som de som foreslås av Kirkland et al.37 å gjennomføre slike studier er tidkrevende og arbeidsintensiv, og faller utenfor omfanget av denne utredningen imidlertid disse større skala studier vil gi verdifull innsikt i evnen til metoden for å pålitelig identifisere svakt gentoksisk agenter. Metodikken som presenteres her har ennå ikke blitt miniatyriserte til et mikrotiterplateleser format, noe som ville gi raskere og mer effektiv screening over et større dose område. Som sådan, i sin nåværende form, kan den MIFC-baserte in vitro-analysen som presenteres her, være best egnet for arbeidsintensive oppfølgingsstudier eller forskning på god laboratoriepraksis. Imidlertid vil metoden fortsette å være optimalisert og validert, og besitter potensialet for å gi økt fleksibilitet i å oppdage kjemiske spesifikke hendelser knyttet til morfologi, slik som aneugen eksponering som øker andelen av celler med ikke-sirkulære kjerner som fortsatt scorable38. Til slutt, den MIFC metoden presenterer en mulighet til å innføre flere biomarkører i MN-analysen (f. eks kinetochore farging) for å gi en mer helhetlig visning av mekanismen av MN induksjon.

The in vitro mikronukleus (MN) analysen er en vanlig brukt test for å vurdere cytotoksisitet og gentoksisitet som en screening verktøy i flere felt av studien som kjemisk og farmasøytisk utvikling samt menneskelig biomonitorering blant individer utsatt for ulike miljø-, yrkes-eller livsstilsfaktorer1,2,3. MN består av kromosom fragmenter eller hele kromosomer generert under celledeling som ikke er innlemmet i en av de to viktigste datter kjerner. Etter telophase, dette kromosom materialet danner en individuell, avrundet kropp inne i cytoplasma som er atskilt fra en av de viktigste kjerner2. Derfor MN er representative for DNA skade og har vært brukt i mange år som et endepunkt i gentoksisitet testing4. Den mest hensiktsmessige metoden for å måle MN er cytokinesi-Block mikronukleus (CBMN) analysen. Ved hjelp av CBMN-analysen kan hyppigheten av MN i binucleated celler (BNCs) scores ved å innlemme Cytochalasin B (Cyt-B) i prøven. Cyt-B tillater kjernefysiske divisjon, men hindrer mobilnettet divisjon og dermed begrenser scoring av MN til BNCs som har delt bare én gang5.
Protokoller som bruker både mikroskopi og Flow flowcytometri er utviklet og validert og brukes rutinemessig til å utføre in vitro MN-analysen6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Mikroskopi fordeler fra å kunne visuelt bekrefte at MN er legitime, men er tidkrevende og utsatt for variasjon mellom scoret15. For å løse dette, ble automatiserte mikroskopi metoder utviklet for å skanne lysbilder og ta bilder av kjerner og MN16,17,18,19, men cytoplasma kan ikke bli visualisere, noe som gjør det vanskelig å avgjøre om en MN faktisk er knyttet til en bestemt celle. Videre disse metodene har vanskeligheter med å identifisere polynucleated (POLY) celler (inkludert Tri-og quadranucleated celler) som er nødvendig for beregning av cytotoksisitet når du bruker Cyt-B9. Flow flowcytometri metoder utviklet for å utføre MN analysen ansette fluorescens så vel som fremover og side scatter intensitet for å identifisere bestander av både kjerner og MN som har blitt frigjort fra cellen etter lyse20,21 ,22. Dette gjør at data kan anskaffes fra flere tusen celler i løpet av få minutter og tillater automatisert analyse23; men manglende evne til å visualisere cellene gjør det umulig å bekrefte at scoret hendelser er ekte. I tillegg lysering cellemembranen hemmer bruken av Cyt-B i tillegg til å skape en suspensjon som inneholder andre rusk som kromosom aggregater eller apoptotisk organer og det er ingen måte å skille disse fra MN24.
I lys av disse begrensningene, er multispectral Imaging Flow flowcytometri (MIFC) et ideelt system for å utføre MN analysen siden den kombinerer høyoppløselig fluorescerende bilder av mikroskopi med statistisk robusthet og hastighet konvensjonelle flyt flowcytometri. I MIFC blir alle celler introdusert i et fluider system og blir deretter hydrodynamically fokusert inn i midten av en strømningscelle Cuvette. Ortogonale belysning av alle celler oppnås gjennom bruk av en brightfield (BF) Light-Emitting Diode (LED), en side scatter laser og (minst) en fluorescerende laser. Fluorescerende fotoner er fanget av en av tre (20x, 40x eller 60x) høy numerisk blenderåpning objektiv linser og deretter passere gjennom en Spectral ned brytings element. Fotoner er så fokusere onto en avgift-koplet apparat (CCD) kameraet å få høy resolution profilen av alle celler det admission card igjennom det flyte cellen. Å unngå sløret eller striper, det CCD fungerer inne tid forsinkelsen integrasjon (TDI) måte hvilke spor emner av overfører pixel innhold fra rad å rad ned det CCD inne Synchrony med det hastighet av cellen inne flyte. Pikselinformasjon samles deretter inn fra den siste raden med bildepunkter. TDI-avbildning kombinert med Spectral nedbryting tillater opptil 12 bilder (2 BF, 10 fluorescerende) som skal fanges samtidig fra alle celler som passerer gjennom strømningscellen. Alle innspilte bilder lagres i prøve spesifikke datafiler, slik at analyser kan utføres når som helst ved hjelp av MIFC dataanalyse programvare. Til slutt, datafiler beholde koblingen mellom cellulære bilder og prikker på alle bivariate tomter. Dette betyr at enhver prikk på en tradisjonell bivariate tomten kan utheves og tilhørende BF og fluorescerende bilder vil bli vist25.
Nylig, MIFC-baserte metoder har blitt utviklet for å utføre MN analysen for både sortering stråling biodosimetry26,27,28,29,30,31 og genetisk toksikologiske32,33 testing. Dette arbeidet har vist at cellulære bilder av hoved kjerner, MN og cytoplasma kan bli avbildet med høyere gjennomstrømning enn andre metoder26. Alle celletyper som kreves for analyse, inkludert MONO celler, BNCs (med og uten MN), og POLY celler, kan automatisk identifiseres i MIFC dataanalyse programvare, og gjennomføringen av scoring kriterier utviklet av Fenech et al. oppnås gjennom Bruk av ulike matematiske algoritmer6,34. Resultater fra biodosimetry viste at kalibrerings kurvene for doserings responsen var like i størrelsesorden som de som ble innhentet fra andre automatiserte metoder i litteraturen da kvantifisere rate av MN per BNC29. I tillegg nyere arbeid i toksikologiske demonstrert at bilder av MONO-celler, BNCs (med og uten MN) og POLY celler kan automatisk fanget, identifisert, klassifisert og nummerert ved hjelp av MIFC. Protokollen og dataanalyse aktivert beregning av cytotoksisitet og gentoksisitet etter utsette TK6 celler til flere clastogens og aneugens32.
Protokollen som presenteres i dette dokumentet beskriver en metode for å utføre in vitro MN-analysen ved hjelp av MIFC. Prøven behandling teknikken som brukes i dette arbeidet krever mindre enn 2 t til å behandle en enkelt prøve og er relativt lett å utføre i forhold til andre metoder. Dataanalysen i MIFC analyseprogramvare er komplisert, men opprettelsen av analysen malen kan gjennomføres i et par timer etter trinnene skissert i denne utredningen. Videre, når malen er opprettet, kan den automatisk brukes på alle innsamlede data uten videre arbeid. Protokollen skisserer alle trinnene som kreves for å utsette TK6 celler til clastogens og aneugens, beskriver hvordan du kan kultur, prosess og beis cellene, og demonstrerer hvordan du anskaffer bilder med høy oppløsning ved hjelp av MIFC. Videre, denne papir illustrerer det aktuelle best praksis for analyserer data inne MIFC programvare å automatisk identifisere og snes MONO celler, BNCs, og POLY celler i den hensikt å beregnende begge to cytotoksisitet og gentoksisitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

In vitro mikronukleus (MN)-analysen brukes ofte til å evaluere cytotoksisitet og gentoksisitet, men scoring analysen via manuell mikroskopi er arbeidskrevende og introduserer usikkerhet i resultatene på grunn av variasjon mellom scoret. For å bøte på dette, automatisert Slide-skanning mikroskopi samt konvensjonelle flyt flowcytometri metoder har blitt innført i et forsøk på å fjerne målscorer bias og forbedre gjennomstrømning. Men disse metodene har sine egne iboende begrensninger som manglende evne til å visualisere cytoplasma av cellen og mangelen på visuell MN verifisering eller bildedata lagring med Flow flowcytometri. Multispectral Imaging Flow flowcytometri (MIFC) har potensial til å overvinne disse begrensningene. MIFC kombinerer høyoppløselig fluorescerende bilder av mikroskopi med statistisk robusthet og hastighet av konvensjonelle strømnings flowcytometri. I tillegg kan alle innsamlede bilder lagres i dose spesifikke filer. Dette papiret beskriver protokollen utviklet for å utføre en helautomatisk versjon av MN-analysen på MIFC. Human lymphoblastoid TK6 celler ble forstørret ved hjelp av en hypotonisk løsning (75 mM KCl), fast med 4% formalin og kjernefysisk innhold ble beiset med Hoechst 33342. Alle prøvene ble kjørt i suspensjon på MIFC, tillater oppkjøp av høyoppløselige bilder av alle viktige hendelser som kreves for analysen (f. eks binucleated celler med og uten MN samt mononucleated og polynucleated celler). Bilder ble automatisk identifisert, kategorisert og nummerert i MIFC dataanalyse programvare, noe som åpner for automatisert scoring av både cytotoksisitet og gentoksisitet. Resultatene viser at bruk av MIFC å utføre in vitro MN-analysen tillater statistisk signifikant økning i MN frekvens som skal oppdages på flere ulike nivåer av cytotoksisitet sammenlignet med løsemiddel kontroller etter eksponering av TK6 celler til Mitomycin C og Kolkisin, og at ingen signifikant økning i MN frekvens observeres etter eksponering for mannitol.

Analysemetoden skissert i dette papiret gjør det mulig for automatisk identifisering og scoring av BNCs, med og uten MN, å beregne gentoksisitet. I tillegg er MONO-og POLY-celler også automatisk identifisert og scoret for å beregne cytotoksisitet. Publiserte poengkriterier6,34 som må overholdes når du skårer disse hendelsene, implementeres i MIFC dataanalyse programvare. Resultatene som presenteres her tyder på at statistisk signifikant økning i MN frekvens med økende cytotoksisitet kan oppdages følgende eksponering av menneskelig lymphoblastoid TK6 celler til velkjente MN inducing kjemikalier (Mitomycin C og Kolkisin). Lignende resultater for ytterligere kjemikalier testet har blitt demonstrert i en egen publikasjon32. Dessuten, resultater fra bruken av mannitol viser det ingen-MN inducing kjemikaliene kanne likeledes være korrekt kjennemerke benytter det MIFC metoden skissert her over. Parametrene beskrevet i protokollen for å opprette alle masker, funksjoner og region grenser vil trolig måtte justeres hvis ulike celletyper (f. eks kinesisk hamster celler) brukes til å utføre analysen.
Figur 3 viser fire utvalgte paneler for å identifisere BNCs (Figur 3A-3D). Vist her er et histogram som gjør det mulig å velge celler med to kjerner (figur 3a) og bivariate tomter som muliggjør valg av BNCs med lignende sirkularitet (Figur 3B), lignende områder og intensitet (Figur 3C ) og BNCs som har godt separerte, ikke-overlappende kjerner (Figur 3D) i henhold til scoring kriteriene6,34. Figur 3 E viser BF og Hoechst bilder samt BNC og MN masker som indikerer at BNCs med én eller flere MN kan identifiseres og nummerert. Dette gjør at gentoksisitet kan beregnes ved å bestemme frekvensen av micronucleated BNCs i den endelige BNC-populasjonen. Figur 4 viser anvendelsen av spot Count funksjonen ved hjelp av Poly masken for å identifisere mono, Tri og Quad celler. Antallet av TRI og kvadrant celler kanne så være summeres å få det final antallet av POLY celler (bord 1). Dette gjør at cytotoksisitet kan beregnes ved hjelp av formelen som vises i protokollen. Derfor kan hvert dose punkt i eksperimentet evalueres av både gentoksisitet og cytotoksisitet parametre.
Figur 5 viser gentoksisitet og cytotoksisitet verdier for aneugen kolkisin, den Clastogen Mitomycin C og for en negativ kontroll, mannitol. For Kolkisin (figur 5A) 0,02 gjennom 0,05 μg/ml doser produsert STATISTISK signifikant økning i MN frekvens, alt fra 1,28% til 2,44% henholdsvis over løsemiddel kontroll (tabell 1). I tilfelle av Mitomycin C (figur 5B) de to øverste dosene på 0,4 og 0,5 μg/ml produserte statistisk signifikante MN frekvenser sammenlignet med løsemiddel kontroller. Disse MN-frekvensene var 0,93% ved 0,4 μg/mL og 1,02% ved 0,5 μg/mL (tabell 2). Til slutt, for mannitol (figur 5C), ingen doser testet indusere en cytotoksisitet over 30%, heller ikke de produserer betydelige økninger i MN frekvens sammenlignet med løsemiddel kontroller, som forventet (tabell 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> Figur 1 : Innstillinger for MIFC-instrumentet. Et skjermbilde av MIFC-innstillingene som beskrevet i punkt 7 i protokollen. (A) innstilling av 405 NM laser effekt til 10 MW. (B) innstilling av BF-kanalene 1 og 9. (C) valg av 60x forstørrelse objektiv linse. (D) valg av den tregeste strømningshastigheten som genererer bilder med høyest oppløsning. (E) spesifisere antall hendelser som skal samles til 20 000. (F) klikk på Last inn -knappen for å starte prøve belastnings prosessen. (G) klikke på Hent -knappen for å begynne å anskaffe bilder. (H) klikke på Return -knappen for å returnere ubrukt prøve. (I) SCATTERPLOT av BF størrelsesforhold versus BF Area for valg av enkeltceller. (J) Scatterplot av HOECHST gradient RMS versus BF gradient RMS for valg av fokuserte celler. (K) histogram av Hoechst intensitet for valg av DNA-positive celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> Figur 2 : Analyseprogramvare gating strategi. Et skjermbilde av gating strategien beskrevet i punkt 9 i protokollen. Områder vises i sekvensiell rekkefølge for identifikasjonen av binucleated celler (rød boks), mikronuklei (gul boks) og mono-og polynucleated-celler (blå boks). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> Figur 3 : Identifisering og scoring av BNCs med og uten MN. (A) valg av celler som har to forskjellige kjerner. (B) identifisering av binucleated celler (BNCs) som har to svært sirkulære kjerner gjennom bruk av funksjonen for sideforhold intensitet. (C) valg av BNCs som har kjerner med lignende områder og intensitet. Dette oppnås ved å beregne forholdet mellom arealet av både kjerner og forholdet mellom størrelsesforholdet mellom begge kjerner. (D) bruk av funksjonene for figur forhold og størrelsesforhold for å identifisere BNCs som har to godt separerte kjerner. (E) det flekk greven ansiktstrekk benytter det MIKRONUKLEUS (MN) maske demonstrasjon det BNCs med enkelt eller mangfoldig MN kan kjennemerke og nummerert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> Figur 4 : Identifisering og scoring av mono og Poly celler. Bruk av funksjonen for spot telling til å identifisere og liste opp mono-, Tri-og quadranucleated-celler. Komponent maske 1 tillater identifisering av mononucleated celler (øverste bilde). Komponent masker 1 til 3 tillater identifisering av trinucleated celler (midtre bilde). Komponent masker 1 til 4 tillater identifisering av quadranucleated celler (nederste bilde). Dette tallet har blitt modifisert fra Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> Figur 5 : Kvantifisering av cytotoksisitet. Cytotoksisitet kvantifisert bruker cytokinesi blokk spredning indeks (svart sirkler) og gentoksisitet kvantifisert bruker prosentandelen av MN (klare barer) etter en 3 h eksponering og 24 h Recovery for (a) kolkisin, (B) Mitomycin C og ( C) mannitol. Statistisk signifikant økning i MN frekvens i forhold til kontrollene er indikert av stjerner (chi-kvadrat test; *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001). Alle antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt. Dette tallet har blitt modifisert fra Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> Tabell 1: Parametrene som kreves for å beregne cytotoksisitet (antall mono-, bi-og polynucleated celler) og gentoksisitet (antall og prosentandel av micronucleated binucleated celler) for kolkisin. Alle beregnede antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> Tabell 2: Than parametere som kreves for å beregne cytotoksisitet (antall mono-, bi-og polynucleated celler) og gentoksisitet (antall og prosentandel av micronucleated binucleated celler) for Mitomycin C. Alle beregnede antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> Tabell 3: Parametrene som kreves for å beregne cytotoksisitet (antall mono-, bi-og polynucleated celler) og gentoksisitet (antall og prosentandel av micronucleated binucleated celler) for mannitol. Alle beregnede antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt.
Tillegg 1: full protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplement 2: maske liste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro mikronukleus analysen er en veletablert metode for å evaluere gentoksisitet og cytotoksisitet men scoring analysen bruker manuell mikroskopi er arbeidskrevende og lider av subjektivitet og inter-scorer variasjon. Denne utredningen beskriver protokollen utviklet for å utføre en helautomatisk versjon av analysen ved hjelp av multispectral Imaging Flow flowcytometri.

En automatisert metode for å utføre in vitro Mikronukleus analysen bruker multispectral Imaging Flow flowcytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Den bildestrømbaserte mikronukleusanalysen kan overvinne flere begrensninger av metoder som automatisert mikroskopi og konvensjonell strømningscytometri, inkludert lav gjennomstrømning og mangel på visuell bekreftelse av hendelser. Den største fordelen med denne teknikken er at alle nødvendige hendelser for å bestemme gentoksisitet og cytotoksisitet automatisk kan avbildes, identifiseres og scores uten å måtte lage mikroskoplysbilder. For celleeksponering for clastogener og/eller aneugens, tilsett en millimeter av kjemikaliet av interesse til syv til åtte ganger 10 til den femte av de eksperimentelle cellene i ni milliliter av riktig cellekulturmedium i en T25-kolbe og en milliliter vann til kontrollkulturene.Inkuber kolben ved 37 grader Celsius og fem prosent karbondioksid i tre timer før du overfører cellene til en 15 milliliter polypropylenrør per kolbe. Samle cellene ved sentrifugering og gjenbruk pellets i 10 milliliter frisk kultur medium per rør for såing i nye T25 kultur kolbe. Tilsett deretter 150 mikroliter av lagerkonsentrasjonen av cytochalasin B til hver kolbe for å oppnå en endelig konsentrasjon på tre mikrogram per milliliter.Returner kolben til inkubatoren for en gjenopprettingstid lik 1,5 til to dobling ganger, som anbefalt av Organisasjonen for økonomisk samarbeid og utvikling retningslinjer. På slutten av gjenopprettingsperioden overfører kulturene til individuelle 15 milliliter polypropylenrør for sentrifugering og gjenbruk pellets i fem milliliter med 75 millimolar kaliumklorid. Bland forsiktig ved inversjon tre ganger og inkuber prøvene ved fire grader Celsius i syv minutter.På slutten av inkubasjonen, tilsett to milliliter på fire prosent formalin til hver prøve og bland forsiktig med tre inversjoner. Returner prøvene til fire grader Celsius i 10 minutter før du samler cellene ved sentrifugering. gjenbruk pellets i 100 mikroliter av friske fire prosent formalin i 20 minutter.På slutten av inkubasjonen, vask de faste cellene i fem milliliter vaskebuffer per rør ved sentrifugering og resuspend pellets i 100 mikroliter vaskebuffer per rør. Deretter overfører du prøvene til individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifugerør for å regne med et hemocytometer. Tilsett fem mikroliter på 100 mikrogram per milliliter Hoechst 33342 per 1,0 x 10 til de seks cellene per milliliter og 10 mikroliter på 500 mikrogram per milliliter RNase per 100 mikroliter prøve per rør.Etter en 30 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius og fem prosent karbondioksid, sentrifuger prøvene i en mikrocentrifuge og fjern alle unntatt 30 mikroliter supernatant fra hvert rør. Deretter forsiktig resuspend prøvene, ta vare på ikke å indusere bobledannelse. Hvis bobler vises ved gjenoppliving, knips forsiktig røret for å fjerne dem.For å kjøre prøvene med multispektral bildestrømcytometri, slå først på 405 nanometer laser og sett laserkraften til 10 milliwatt. Deaktiver alle de andre lasere, inkludert siden scatter laser, og sette brightfield til kanaler en og ni. Kontroller at forstørrelsesglidebryteren er satt til 60x, at høyfølsomhetsmodus er valgt, og at bare kanaler én, syv og ni vises i bildegalleriet.Klikk punktdiagram, og velg hele populasjonen og området M01 på X-aksen. Velg sideforhold M01 på Y-aksen, og klikk firkantet område for å tegne et område rundt enkeltcellene. Gi dette området enkeltceller navn, og høyreklikk på plottet for å velge regioner.Merk enkeltceller-området og endre X-koordinatene til 100 og 900 og Y-koordinatene til 0,75 og én. Angi anskaffelsesparameterne, og angi filnavnet og målmappen. Deretter endrer du antall hendelser til 20 000, velger DNA-positiv populasjon, og kjører den første prøven.Hvis du vil åpne en datafil i IDEAS, klikker du Start analyse for å starte veiviseren for åpne filer, og blar for å velge ønsket raw-bildefil. Klikk deretter Neste og bla etter en hyllespiset celle i bildegalleriet. Hvis du vil opprette en maske, klikker du for å velge bildet av interesse og åpne analysefanen.Klikk Masker, Ny og Funksjon for å velge LevelSet. Velg M07 og Middle Level Mask under Maske, og sett konturdetaljene skalert til tre. Klikk deretter OK to ganger.Hvis du vil oppdage binucleated cellefunksjoner, åpner du kategorien Analyse og velger Funksjoner og Ny. Velg Antall spotantall for funksjonstypen. For Mask velger du den endelige binucleated masken, og setter tilkoblingsfunksjonen til fire, og deretter endrer du navnet til Spot Count BNC og klikker OK og lukker for å beregne funksjonsverdiene.For en flekktelling binucleated celle histogrammet, klikk histogrammet og velg ikke-apoptopic som den overordnede populasjonen. For X-aksefunksjonen velger du Punkttelling BNC og klikker OK og lineært område, tegn deretter et område på tvers av Bim Two og navngir dette området 2N. Hvis du vil opprette en mikronukleusmaske, velger du en binucleated celle som inneholder en mikronukleus fra bildegalleriet, og åpner masker i kategorien Analyse.Hvis du vil opprette en spotidentifikasjonsmaske én, klikker du Ny og Funksjon og velger Spot. Kontroller at lysradioknappen er valgt, og velg M07 under maske. Angi spot-til-cellebakgrunnsforholdet og minimumsradiusen til to, og angi maksimal radius til seks.Klikk OK og OK for å legge til masken i listen til venstre, og klikk deretter Ny for å opprette en ny maske. Klikk spot M07 Channel syv Lyse to seks to maske og klikk pil ned for å legge den til maskedefinisjonen og klikk på Og og ikke-operatorene. Klikk pil ned for å legge til utvidet områdemaske i maskedefinisjonen.Hvis du vil opprette en polynuklert populasjonsmaske, klikker du Analyse, Masker, Ny og Funksjon. Velg Område under Funksjon. Under Maske velger du Vannskille dilate Set M07 Channel07, Middle, tre, to, og setter bildet til å vises til Kanal 07.Angi minimums- og maksimumsområdeverdiene til henholdsvis 135 og 5000, og angi minimums- og maksimumsforholdsverdiene til henholdsvis 0,4 og én. Klikk OK, og endre teksten til å lese POLY-maske i navnefeltet, og klikk deretter OK og Lukk. Hvis du vil opprette en egendefinert visning, klikker du Knappen Egenskaper for bildegalleri, åpner Kategorien Kompositter og klikker Ny.Skriv inn Kanal 01 til Kanal 07 under Navn. Klikk Legg til bilde, velg Kanal 01 under Bilde, og angi prosenten til 100. Klikk Legg til bilde på nytt, og velg Kanal 07 under bilde, og angi prosenten til 100.Klikk kategorien Vis, klikk Ny, og skriv inn BNC- og MN-masker under Navn. Klikk deretter Legg til kolonne, og velg Kanal 01 under Bildetype, og velg Ingen under Maske. Klikk Legg til kolonne, velg Kanal 07 under Bildetype, og velg Ingen under Maske.Klikk Legg til kolonne, klikk alternativknappen Kompositt, og klikk deretter Ok for å fullføre den egendefinerte visningen. Klikk vis rullegardinmenyen, og klikk BNC- og MN-masker-visningen. Klikk Vis skjul masker-knappen.Hvis du vil liste opp viktige hendelser, åpner du kategorien Rapporter og klikker Definer statistikkrapport, og deretter klikker du Legg til kolonner i det nye vinduet. Hvis du vil legge til den hyllede celletellingsstatistikken, velger du Antall under Statistikk, og under Valgt populasjon velger du BNC-populasjonen, og deretter klikker du Legg til statistikk for å legge til statistikken i listen og lagre malen. Når all statistikk er lagt til i listen, klikker du Lukk, klikker ok og lagrer deretter dataanalysemalen.Hvis du vil behandle de eksperimentelle filene, klikker du Satsvise datafiler på Verktøy-menyen og klikker Legg til parti i det nye vinduet. Klikk Legg til filer for å velge eksperimentfilene du vil legge til i bunken, og klikk Åpne mappe-knappen under alternativet Velg en mal eller dataanalysefil. Bla til malen som nettopp er lagret, og åpne den.Klikk OK for å lukke gjeldende vindu. Klikk deretter Send partier for å starte den satsvise behandlingen av alle filene. Her vises fire valgte paneler for å identifisere binucleated celler.Disse bivariate plott og histogrammer muliggjør valg av binucleated celler samt identifisering av de cellene som har to kjerner med lignende sirkularitet, områder og intensiteter, og som er godt atskilt fra hverandre. Disse Brightfield og Hoechst bilder, samt binucleated celle og micronucleus masker, lette identifisering og opplisting av binucleated celler og micronuclei. Påføring av spottellingsfunksjonen bruker den polynukleerte masken til å identifisere mononukleære, trinukleære og quadranuclear-celler.Antall tri- og quadranukleære celler kan deretter oppsummeres for å oppnå det endelige antallet polynukleerte celler som kreves for beregning av cytotoksisitet. Her er representative gentoksisitets- og cytotoksisitetsverdier vist for endogenkolkisin, clastogen mitomycin C, og en negativ kontroll, mannitol, for å demonstrere protokollens gyldighet. Merking av cellene med en passende konsentrasjon av DNA-flekk er avgjørende for å sikre bildeopptak av høy kvalitet, slik at alle viktige hendelser enkelt kan identifiseres og scores.Disse teknikkene gjelder også for mikronukleusanalysen for strålingsbiodosimetry, noe som gjør det mulig å estimere doseestimering hos personer som kan ha blitt utsatt for stråling.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering og Relativ Kvantifisering av karbonnanorør i Celler med Multispectral Imaging flowcytometrisystemer

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk Assay å måle transkripsjon Hemming av Gallium (III) og H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Bruke Rekonstituert Blood Model Hemostase og platetransfusjon<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gene Expression analyse av endotelceller utsatt for skjæring Stress ved hjelp av flere parallelle-plate flyt Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Kreft deteksjon av eggstokkene bruke Photoacoustic Flow flowcytometri

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantifisering av utvalgte kynureniner analysert av flytende kromatografi-massespektrometri i medium samlet fra kreftcellekulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En åpen kildekode-teknologiplattform for produksjon av Hydrogel-baserte 3D-kulturmodeller på en automatisert og standardisert måte

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...