Um método automatizado para realizar o ensaio de micronúcleos in vitro usando citometria de fluxo de imagem multiespectral

O ensaio de micronucleus baseado em fluxo de imagem pode superar várias limitações de métodos como microscopia automatizada e citometria de fluxo convencional, incluindo baixo rendimento e falta de confirmação visual dos eventos. A principal vantagem desta técnica é que todos os eventos necessários para determinar genotoxicidade e citotoxicidade podem ser automaticamente imagens, identificadas e pontuadas sem a necessidade de criar slides de microscópio. Para exposição celular a clastogens e/ou aneugens, adicione um milímetro do produto químico de interesse de sete a oito vezes 10 a o quinto das células experimentais em nove mililitros do meio de cultura celular apropriada em um frasco T25 e um mililitro de água às culturas de controle.

Incubar os frascos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três horas antes de transferir as células para um tubo de polipropileno de 15 mililitros por frasco. Colete as células por centrifugação e resuspenque as pelotas em 10 mililitros de cultura fresca média por tubo para semeadura em novos frascos de cultura T25. Em seguida, adicione 150 microliters da concentração de estoque de citochalasina B a cada frasco para alcançar uma concentração final de três microgramas por mililitro.

Devolva os frascos à incubadora por um tempo de recuperação igual a 1,5 a duas vezes, conforme recomendado pelas diretrizes da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico. Ao final do período de recuperação, transfira as culturas para tubos individuais de polipropileno de 15 mililitros para centrifugação e resuspenda as pelotas em cinco mililitros de cloreto de potássio mililitro. Misture suavemente por inversão três vezes e incubar as amostras a quatro graus Celsius por sete minutos.

No final da incubação, adicione dois mililitros de quatro por cento de formalina a cada amostra e misture suavemente com três inversões. Devolva as amostras a quatro graus Celsius por 10 minutos antes de coletar as células por centrifugação. resuspenja as pelotas em 100 microliters de formalina fresca de 4% por 20 minutos.

No final da incubação, lave as células fixas em cinco mililitros de tampão de lavagem por tubo por centrifugação e resuspenja as pelotas em 100 microliters de tampão de lavagem por tubo. Em seguida, transfira as amostras para tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitros individuais para contar com um hemótmetro. Adicione cinco microlitadores de 100 microgramas por mililitro Hoechst 33342 por 1,0 x 10 às seis células por mililitro e 10 microliters de 500 microgramas por mililitro RNase por 100 microliters de amostra por tubo.

Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, centrifugar as amostras em um microcentrifuuge e remover todos, exceto 30 microlitres de supernacer de cada tubo. Em seguida, resususpenda cuidadosamente as amostras, tomando cuidado para não induzir a formação de bolhas. Se as bolhas aparecerem sobre a ressuspensão, gire suavemente o tubo para removê-las.

Para executar as amostras por citometria de fluxo de imagem multiespectral, primeiro ligue o laser de 405 nanômetros e defina a potência laser para 10 miliwatts. Desabilite todos os outros lasers, incluindo o laser de dispersão lateral, e coloque o campo brilhante nos canais um e nove. Confirme que o controle deslizante de ampliação está definido em 60x, que o modo de alta sensibilidade está selecionado, e que apenas os canais um, sete e nove estão sendo exibidos na galeria de imagens.

Clique em dispersar o plot e selecione toda a população e área M01 no eixo X. Selecione a proporção M01 no eixo Y e clique na região quadrada para desenhar uma região ao redor das células únicas. Nomeie esta região células únicas e clique com o botão direito do mouse no gráfico para selecionar regiões.

Destaque a região de células únicas e altere as coordenadas X para 100 e 900 e as coordenadas Y para 0,75 e uma. Defina os parâmetros de aquisição e especifique o nome do arquivo e a pasta de destino. Em seguida, mude o número de eventos para 20.000, selecione a população positiva de DNA, e execute a primeira amostra.

Para abrir um arquivo de dados em IDEIAS, clique em Iniciar análise para iniciar o Assistente de Arquivo Aberto e navegue para selecionar o arquivo de imagem bruta desejado. Em seguida, clique em Next e procure por uma célula binucleada na galeria de imagens. Para criar uma máscara, clique para selecionar a imagem de interesse e abra a guia de análise.

Clique em Máscaras, Novas e Funções para selecionar LevelSet. Em Máscara, selecione M07 e Máscara de Nível Médio e defina a escala de detalhes do contorno para três. Em seguida, clique em OK duas vezes.

Para identificar as características das células binucleadas, abra a guia Análise e selecione Recursos e Novos. Para obter o tipo de recurso, selecione Contagem de pontos. Para Máscara, selecione a máscara binucleada final e defina a conexão para quatro, em seguida, altere o nome para Spot Count BNC e clique em OK e perto para calcular os valores do recurso.

Para um histograma de célula binucleada de contagem de manchas, clique em histograma e selecione não-apoptópico como a população dos pais. Para o recurso do eixo X, selecione Spot Count BNC e clique em OK e região linear, em seguida, desenhe uma região através de Bim Two e nomeie esta região 2N. Para criar uma máscara de micronucleus, selecione uma célula binucleada que contenha um micronucleus da galeria de imagens e abra máscaras na guia Análise.

Para criar uma máscara de identificação de ponto, clique em Novo e Função e selecione Spot. Confirme se o botão de rádio Bright está selecionado e selecione M07 sob máscara. Defina a relação de fundo spot para celular e o raio mínimo para dois e defina o raio máximo para seis.

Clique em OK e OK para adicionar a máscara à lista à esquerda e clique em Novo para criar outra máscara. Clique no Spot M07 Channel seven Bright two six two mask e clique na seta para baixo para adicioná-la à definição da máscara e clique nos operadores E e Não. Clique na seta para baixo para adicionar máscara de alcance dilatada à definição da máscara.

Para criar uma máscara populacional polinucleada, clique em Análise, Máscaras, Novas e Funções. Em Função, selecione Intervalo. Sob Máscara, selecione Watershed Dilate Set M07 Channel07, Middle, três, dois, e defina a imagem para exibir no Canal 07.

Fixar os valores mínimos e máximos de área para 135 e 5000, respectivamente, e definir os valores de proporção mínima e máxima para 0,4 e um, respectivamente. Clique em OK e no campo de nome, altere o texto para ler máscara POLY e clique em OK e Feche. Para criar uma exibição personalizada, clique no botão Propriedades da Galeria de Imagens, abra a guia Compósitos e clique em Novo.

Em Name, entre no Canal 01 até o Canal 07. Clique em Adicionar imagem e em Imagem, selecione o Canal 01 e defina a porcentagem para 100. Clique em Adicionar imagem novamente e em imagem, selecione o Canal 07 e defina a porcentagem para 100.

Clique na guia Exibir, clique em Novo e em Nome, digite máscaras BNC e MN. Em seguida, clique em Adicionar coluna e, no tipo Imagem, selecione Canal 01 e em Máscara, selecione Nenhum. Clique em Adicionar coluna e em tipo de imagem, selecione Canal 07 e em Máscara, selecione Nenhum.

Clique em Adicionar coluna, clique no botão de rádio Composto e clique em "Ok" para concluir a exibição personalizada. Clique no menu 'Exibir', e clique na exibição de máscaras BNC e MN. Clique no botão Mostrar máscaras de ocultação.

Para enumerar os principais eventos, abra a guia Relatórios e clique em Definir Relatório de Estatísticas e, em seguida, na nova janela, clique em Adicionar colunas. Para adicionar a estatística de contagem de células binucleadas, em Estatísticas, selecione Contagem e em População Selecionada, selecione a população BNC e clique em Adicionar estatísticas para adicionar a estatística à lista e salvar o modelo. Uma vez que todas as estatísticas tenham sido adicionadas à lista, clique em Fechar e clique em OK e, em seguida, salve o modelo de análise de dados.

Para processar em lote os arquivos experimentais, no menu Ferramentas, clique em Arquivos de Dados em Lote e clique em Adicionar lote na nova janela. Clique em Adicionar arquivos para selecionar os arquivos de experimento para adicionar ao lote e clique no botão Criar pastas sob a opção Selecionar um modelo ou uma opção de arquivo de análise de dados. Navegue até o modelo que acaba de ser salvo e abra-o.

Clique em OK para fechar a janela atual. Em seguida, clique em Enviar Batches para iniciar o processamento em lote de todos os arquivos. Aqui, são mostrados quatro painéis selecionados para identificação de células binucleadas.

Esses enredos bivariados e histogramas permitem a seleção de células binucleadas, bem como a identificação dessas células que possuem dois núcleos com circularidade, áreas e intensidades semelhantes e que estão bem separados entre si. Estas imagens de Brightfield e Hoechst, bem como as máscaras binucleadas de células e micronucleus, facilitam a identificação e enumeração de células binucleadas e micronucleis. A aplicação do recurso de contagem de manchas utiliza a máscara polinucleada para identificar células mononucleares, trinucleares e quadranucleares.

O número de células tri e quadranucleares pode então ser somado para obter o número final de células polinucleadas necessárias para o cálculo da citotoxicidade. Aqui, valores representativos de genotoxicidade e citotoxicidade são mostrados para a colchicina endógena, a mitomicina clastogena C, e um controle negativo, mannitol, para demonstrar a validade do protocolo. Rotular as células com uma concentração adequada de mancha de DNA é fundamental para garantir a captura de imagens de alta qualidade, permitindo que todos os eventos-chave sejam facilmente identificados e pontuados.

Essas técnicas também são aplicáveis ao ensaio de micronucleo para biodosimetria de radiação, que permite a estimativa de dose em indivíduos que podem ter sido expostos à radiação.