Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
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La autora agradece a Christine Probst (Luminex Corporation) sus esfuerzos en el desarrollo de formas anteriores de la plantilla de análisis de datos, así como la Dra. Haley Pugsley (Luminex Corporation) y el Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) por revisar y editar la Manuscrito.

El autor es empleado por Luminex Corporation, el fabricante del citómetro de flujo de imágenes multiespectral ImageStream que se utilizó en este trabajo.

En una publicación reciente, Verma et al. subrayaron la importancia de desarrollar un sistema que combine la ventaja de alto rendimiento de la citometría de flujo con los beneficios de datos y almacenamiento de imágenes del análisis de imágenes35. El ensayo IN vitro mN del MIFC descrito en este documento satisface esta cita y tiene el potencial de superar muchos de los desafíos antes mencionados en los métodos de microscopía y citometría de flujo. El protocolo descrito aquí demuestra que tanto la citotoxicidad como la genotoxicidad pueden evaluarse utilizando MIFC. La preparación de muestras, la tinción celular y la recopilación de datos son sencillas, pero hay algunos pasos críticos en el protocolo que siempre deben implementarse. La adición de cloruro de potasio (KCl) a las células es fundamental para hinchar las células, generando separación entre los núcleos principales. Esto garantiza que el algoritmo de enmascaramiento pueda identificar todos los núcleos individuales en las celdas BNIC y POLY (células POLY) que son necesarias para su enumeración. Además, La KCL proporciona separación entre núcleos y MN, lo que es esencial para el enmascaramiento y la cuantificación precisos de MN. Además, el uso de formalina después de la adición de KCl evita que las células lisien durante la centrifugación. La adición de cytochalasina B hace que las células TK6 que han sufrido más de una división nuclear sean bastante grandes. Como resultado, el citoplasma se vuelve frágil y puede aplicar seis si la centrifugación se realiza inmediatamente después de la adición de KCl. Además, es muy importante introducir Hoechst en la muestra según el número de células de la muestra y no según una concentración final. Por ejemplo, una concentración final de 10 g/ml de Hoechst manchará uniformemente una muestra de 1 x 106 células, pero puede no manchar adecuadamente una muestra que contenga 5 x 106 células y puede dar lugar a muchas células con núcleos tenuemente manchados, lo que dificulta el análisis. También es importante tener en cuenta que Hoechst puede ser reemplazado por otro tinte de ADN como DAPI si el MIFC está equipado con el láser de excitación de 405 nm o DRAQ5 si el MIFC está equipado con el láser de excitación de 488 nm y/o 642 nm. Si se modifica la mancha nuclear, es fundamental valorar la mancha para encontrar la concentración adecuada para la potencia láser requerida/deseada.
Al recopilar datos en el MIFC, es importante determinar los límites de región óptimos para las entidades de Gradient RMS. Los límites presentados en este protocolo pueden requerir un ajuste debido a algunas ligeras variaciones entre los instrumentos MIFC. La aplicación de esta característica durante la recopilación de datos es esencial para garantizar que se capturen imágenes altamente enfocadas. Si los archivos de datos contienen muchas imágenes borrosas o desenfocadas, es probable que los algoritmos de enmascaramiento en el software de análisis resalten incorrectamente los artefactos de tinción en las áreas borrosas, lo que conduce a un alto número de artefactos falsos positivos que se puntúan como MN. Aunque las técnicas de procesamiento de imágenes descritas aquí pueden ser difíciles, una vez que se ha desarrollado una plantilla de análisis en el software MIFC, el procesamiento por lotes permite analizar automáticamente los archivos de datos, eliminando la intervención del usuario y, por lo tanto, el marcador predisposición. Además, si se utiliza una línea de celda distinta de las celdas TK6 para realizar el ensayo, será necesario modificar las máscaras y los límites de región, ya que las propiedades morfológicas (por ejemplo, el tamaño) de las celdas diferirán de las de las celdas TK6.
Los resultados presentadosaquí (Figura 5) muestran aumentos estadísticamente significativos en la inducción de MN al exponer las células TK6 a varias dosis de Mitomicina C y Colchicina. Se observaron aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de MN en comparación con los controles de disolventes para varias dosis en ambos productos químicos. Además, ninguna dosis de Mannitol indujo una citotoxicidad por encima del 30%, ni un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de MN en comparación con los controles de disolvente, como se esperaba. El protocolo descrito en este documento utilizando MIFC para realizar el ensayo in vitro de MN da los resultados esperados de productos químicos de control positivos y negativos. Es muy importante realizar una serie de experimentos utilizando controles de disolvente y productos químicos de control negativo para desarrollar valores basales tanto de la frecuencia de MN como del índice de proliferación de bloques de citoquinesis (CBPI). En el caso de la genotoxicidad, los aumentos estadísticamente significativos de la frecuencia MN se determinan mediante la comparación con las frecuencias DeN basales que deben ser bien conocidas por el tipo de célula que se utiliza. Además, todos los cálculos de citotoxicidad se basan en el CBPI de las muestras de control y, por lo tanto, las tasas de referencia de las células MONO, BNC y POLY deben cuantificarse bien en los controles.
En los trabajos anteriores29,32,se han descrito varias limitaciones y ventajas de utilizar MIFC en el contexto del ensayo MN. Las principales limitaciones se refieren a frecuencias MN más bajas en comparación con la microscopía, que probablemente resulta tanto de la falta de flexibilidad al implementar los criterios de puntuación en el software de análisis, así como de la limitada profundidad de campo del MIFC. Las máscaras bien contorneadas se pueden crear para identificar con precisión los núcleos principales, pero mN que están tocando (o muy cerca) los núcleos principales podrían ser capturados dentro de la máscara BNC. Además, muy pequeño MN que se puede puntuar bastante fácilmente usando microscopía probablemente se pierda incorrectamente cuando se utiliza MIFC debido al límite inferior en el parámetro de área de la máscara MN para evitar la puntuación de artefactos pequeños. Además de las dificultades presentes en el análisis de datos basado en imágenes, debido a su diseño, MIFC obtiene imágenes de proyección bidimensional de objetos celulares tridimensionales. Esto probablemente hace que algunos MN sean capturados a una profundidad de enfoque diferente que los dos MN principales, haciéndolos parecer muy tenues e ircorables usando enmascaramiento. Además, una pequeña fracción de MN podría residir detrás de uno de los dos núcleos principales, por lo que es imposible visualizarlos y puntuarlos. Por lo tanto, teniendo en cuenta estas dificultades, se debe tener precaución al interpretar aumentos significativos en la frecuencia MN a dosis bajas.
A pesar de estas deficiencias, el método MIFC descrito aquí ofrece varias ventajas sobre otras técnicas. Fenech y otros propusieron criterios y directrices que deben tenerse en cuenta al desarrollar sistemas y metodologías automatizados para los ensayos de MN36. Estos incluyen, pero no se limitan a, la visualización directa de los núcleos principales y el citoplasma, la determinación de la frecuencia de MN a partir de diversas dosis del producto químico o agente que se está probando y la capacidad de cuantificar la morfología y determinar la posición de todos núcleos y MN para asegurarse de que están dentro del citoplasma. Este documento muestra que el método MIFC desarrollado para realizar el ensayo in vitro de MN satisface (o posee el potencial de satisfacer) estos criterios. Específicamente, las imágenes de los núcleos y MN pueden ser capturadas por los láseres fluorescentes, mientras que las imágenes citoplasmáticas se pueden obtener mediante el uso del LED BF. Las imágenes de células con morfología nuclear normal se pueden diferenciar automáticamente de aquellas células con morfología irregular utilizando una combinación de máscaras y características avanzadas. Los resultados presentados para Colchicina y Mitomicina C (Figura5) muestran que tanto la genotoxicidad como la citotoxicidad pueden evaluarse a diversas dosis en comparación con los controles de disolventes y que se observan frecuencias MN estadísticamente significativas cuando se observan frecuencias MN estadísticamente significativas Esperado. Además, la Orientación 487 de la OCDE recomienda puntuar 2.000 BNC por concentración de ensayo para evaluar la presencia deMN para determinar la genotoxicidad junto con al menos 500 células por concentración de ensayo para determinar la citotoxicidad 9; esto puede tomar más de 1 h usando microscopía manual. El protocolo y los resultados de este documento muestran que un promedio de aproximadamente 6.000 BNCs, 16.000 células MONO y 800 células POLY fueron capturados y puntuados por concentración de prueba en aproximadamente 20 minutos. La rápida tasa de adquisición de datos y el alto número de células candidatas puntuadas en tan poco tiempo ponen de relieve otra ventaja importante de emplear miFC para realizar el ensayo in vitro de MN.
Si bien los resultados presentados en este documento son alentadores, son representativos de un método de prueba de concepto temprano. Este trabajo debe ser seguido por una investigación más exhaustiva de un conjunto químico más grande y diverso que cubre múltiples clases y mecanismos de genotoxicidad y citotoxicidad como los sugeridos por Kirkland et al.37 Realización de tales estudios son tiempo y mucho trabajo, y quedan fuera del alcance de este documento, sin embargo, estos estudios a mayor escala proporcionarán información valiosa sobre la capacidad del método para identificar de manera confiable agentes débilmente genotóxicos. La metodología presentada aquí aún no se ha miniaturizado a un formato de micropozo, lo que permitiría un cribado más rápido y eficiente en un rango de dosis más grande. Como tal, en su forma actual, el ensayo in vitro MN basado en MIFC presentado aquí puede ser el más adecuado para estudios de seguimiento intensivos en mano de obra o investigación sobre buenas prácticas de laboratorio. Sin embargo, el método seguirá siendo optimizado y validado, y posee el potencial de permitir una mayor flexibilidad en la detección de eventos químicos específicos relacionados con la morfología, como la exposición a neugeno que aumenta la proporción de células con núcleos no circulares que todavía son escorables38. Por último, el método MIFC presenta una oportunidad para introducir biomarcadores adicionales en el ensayo MN (por ejemplo, tinción de kinetochore) para proporcionar una visión más completa del mecanismo de inducción de MN.

El ensayo de micronúcleos in vitro (MN) es un ensayo de uso común para evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad como herramienta de cribado en varios campos de estudio, como el desarrollo químico y farmacéutico, así como la biomonitorización humana entre individuos expuestos a factores ambientales, ocupacionales o de estilo de vida1,2,3. El MN consiste en fragmentos cromosómicos o cromosomas enteros generados durante la división celular que no se incorporan a uno de los dos núcleos principales de la hija. Después de la telofase, este material cromosómico se forma en un cuerpo individual y redondeadodentro del citoplasma que es independiente de cualquiera de los núcleos principales 2. Por lo tanto, MN son representativos de los daños en el ADN y se han utilizado durante muchos años como punto final en las pruebas de genotoxicidad4. El método más adecuado para medir la MN es el ensayo del micronúcleo de bloque de citoquinesis (CBMN). Usando el ensayo CBMN, la frecuencia de MN en células binucleadas (BNC) se puede puntuar incorporando Cytochalasin B (Cyt-B) en la muestra. Cyt-B permite la división nuclear pero previene la división celular y por lo tanto, restringe la puntuación de MN a bNCs que se han dividido sólo una vez5.
Los protocolos que utilizan la microscopía y la citometría de flujo han sido desarrollados y validados y se utilizan rutinariamente para realizar el ensayo in vitro MN6,7,8,9,10, 11,12,13,14. La microscopía se beneficia de ser capaz de confirmar visualmente que la MN es legítima, pero consume mucho tiempo y es propensa a la variabilidad entre los marcadores15. Para hacer frente a esto, se desarrollaron métodos automatizados de microscopía para escanear diapositivas y capturar imágenes de núcleos y MN16,17,18,19, pero el citoplasma no se puede visualizar, por lo que no se puede visualizar, por lo que difícil de determinar si un MN está realmente asociado a una celda específica. Además, estos métodos tienen dificultades para identificar células polinucleadas (POLY) (incluidas las células trinucleadas y cuadrácidas) que son necesarias para el cálculo de la citotoxicidad cuando se utiliza Cyt-B9. Los métodos de citometría de flujo desarrollados para realizar el ensayo MN emplean fluorescencia, así como intensidades de dispersión hacia adelante y laterales para identificar poblaciones de los núcleos y MN que han sido liberadas de la célula después de la lisis20,21 ,22. Esto permite que los datos se adquieran de varios miles de células en pocos minutos y permite el análisis automatizado23; sin embargo, la incapacidad de visualizar las celdas hace que sea imposible confirmar que los eventos puntuados son genuinos. Además, el lising de la membrana celular inhibe el uso de Cyt-B, así como la creación de una suspensión que contiene otros desechos como agregados cromosómicos o cuerpos apoptoticos y no hay manera de diferenciarlos de MN24.
A la luz de estas limitaciones, Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) es un sistema ideal para realizar el ensayo MN ya que combina las imágenes fluorescentes de alta resolución de la microscopía con la robustez estadística y la velocidad de la citometría de flujo convencional. En MIFC, todas las células se introducen en un sistema de fluidos y luego se centran hidrodinámicamente en el centro de una cubeta de celda de flujo. La iluminación ortogonal de todas las células se logra mediante el uso de un diodo emisor de luz (LED) de campo brillante (BF), un láser de dispersión lateral y (al menos) un láser fluorescente. Los fotones fluorescentes son capturados por una de las tres lentes objetivos de alta apertura numérica (20x, 40x o 60x) y luego pasan a través de un elemento de descomposición espectral. Los fotones se centran en una cámara de dispositivo acoplado a carga (CCD) para obtener imágenes de alta resolución de todas las celdas que pasan a través de la celda de flujo. Para evitar desenfoqueoo o rayado, el CCD funciona en modo de integración de retardo de tiempo (TDI) que realiza un seguimiento de los objetos mediante la transferencia de contenido de píxeles de fila a fila hacia abajo el CCD en sincronía con la velocidad de la celda en flujo. A continuación, la información de píxeles se recopila de la última fila de píxeles. Las imágenes TDI combinadas con la descomposición espectral permiten capturar hasta 12 imágenes (2 BF, 10 fluorescentes) simultáneamente de todas las células que pasan a través de la célula de flujo. Todas las imágenes capturadas se almacenan en archivos de datos específicos de la muestra, lo que permite realizar análisis en cualquier momento utilizando el software de análisis de datos MIFC. Por último, los archivos de datos conservan el vínculo entre las imágenes celulares y los puntos en todas las gráficas bivariadas. Esto significa que cualquier punto en una gráfica bivariada tradicional se puede resaltar y sus correspondientes imágenes BF e fluorescentes se mostrarán25.
Recientemente, se han desarrollado métodos basados en MIFC para realizar el ensayo MN tanto para biodosimetría de radiación de triaje26,27,28,29,30,31 y genética toxicología32,33 pruebas. Este trabajo ha demostrado que las imágenes celulares de los núcleos principales, MN y el citoplasma se pueden crear imágenes con un mayor rendimiento que otros métodos26. Todos los tipos de celdas necesarios para el análisis, incluidas las células MONO, las BNC (con y sin MN) y las células POLY, se pueden identificar automáticamente en el software de análisis de datos MIFC, y la implementación de los criterios de puntuación desarrollados por Fenech et al. se logra a través de el uso de varios algoritmos matemáticos6,34. Los resultados de la biodosimetría mostraron que las curvas de calibración de la respuesta a la dosis eran similares en magnitud a las obtenidas de otros métodos automatizados en la literatura al cuantificar la tasa de MN por BNC29. Además, los trabajos recientes en toxicología demostraron que las imágenes de células MONO, BNCs (con y sin MN) y células POLY pueden capturarse, identificarse, clasificarse y enumerarse automáticamente utilizando MIFC. El protocolo y el análisis de datos permitieron el cálculo de la citotoxicidad y la genotoxicidad después de exponer las células TK6 a varios clastógenos y aneugens32.
El protocolo presentado en este documento describe un método para realizar el ensayo de MN in vitro utilizando MIFC. La técnica de procesamiento de muestras utilizada en este trabajo requiere menos de 2 h para procesar una sola muestra y es relativamente fácil de realizar en comparación con otros métodos. El análisis de datos en el software de análisis MIFC es complicado, pero la creación de la plantilla de análisis se puede realizar en unas pocas horas siguiendo los pasos descritos en este documento. Además, una vez creada la plantilla, se puede aplicar automáticamente a todos los datos recopilados sin ningún otro trabajo. El protocolo describe todos los pasos necesarios para exponer las células TK6 a clastógenos y aneugens, describe cómo cultivar, procesar y manchar las celdas, y demuestra cómo adquirir imágenes de alta resolución mediante MIFC. Además, este documento ilustra las mejores prácticas actuales para analizar datos en el software MIFC para identificar y puntuar automáticamente células MONO, BNC y células POLY con el fin de calcular tanto la citotoxicidad como la genotoxicidad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

El ensayo de micronúcleos in vitro (MN) se utiliza a menudo para evaluar la citotoxicidad y la genotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa e introduce incertidumbre en los resultados debido a la variabilidad entre los marcadores. Para remediar esto, se han introducido microscopías automatizados de escaneo de diapositivas, así como métodos convencionales de citometría de flujo, en un intento de eliminar el sesgo del marcador y mejorar el rendimiento. Sin embargo, estos métodos tienen sus propias limitaciones inherentes, como la incapacidad para visualizar el citoplasma de la celda y la falta de verificación visual de MN o almacenamiento de datos de imagen con citometría de flujo. La citometría de flujo de imágenes multiespectrales (MIFC) tiene el potencial de superar estas limitaciones. MIFC combina las imágenes fluorescentes de alta resolución de la microscopía con la robustez estadística y la velocidad de la citometría de flujo convencional. Además, todas las imágenes recopiladas se pueden almacenar en archivos específicos de dosis. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo MN en MIFC. Las células TK6 linfoplóstoides humanas se agrandaron utilizando una solución hipotónica (75 mM de KCl), fijadas con un 4% de formalina y el contenido nuclear se tiñó con Hoechst 33342. Todas las muestras se ejecutaron en suspensión en el MIFC, lo que permitió la adquisición de imágenes de alta resolución de todos los eventos clave necesarios para el ensayo (por ejemplo, células binucleadas con y sin MN, así como células mononucleadas y polinucleadas). Las imágenes se identificaron, clasificaron y enumeraron automáticamente en el software de análisis de datos MIFC, lo que permite la puntuación automatizada de la citotoxicidad y la genotoxicidad. Los resultados demuestran que el uso de MIFC para realizar el ensayo in vitro de MN permite detectar aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de MN en varios niveles diferentes de citotoxicidad en comparación con los controles de disolvente según la exposición de células TK6 a La mitomicina C y la colchicina, y que no se observan aumentos significativos en la frecuencia de mN después de la exposición a Mannitol.

El método de análisis descrito en este documento permite la identificación automática y la puntuación de las BNC, con y sin MN, para calcular la genotoxicidad. Además, las células MONO y POLY también se identifican y puntúan automáticamente para calcular la citotoxicidad. Los criterios de puntuación publicados6,34 que deben cumplirse al puntuar estos eventos se implementan en el software de análisis de datos MIFC. Los resultados presentados aquí indican que se pueden detectar aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia de mn con citotoxicidad creciente tras la exposición de células TK6 linfooblastoide humanas a sustancias químicas inductoras de MN bien conocidas (Mitomicina C y Colchicina). En una publicación separada32se han demostrado resultados similares para productos químicos adicionales analizados. Además, los resultados del uso de Mannitol muestran que los productos químicos no inducidos por MN también se pueden identificar correctamente utilizando el método MIFC descrito aquí. Los parámetros descritos en el protocolo para crear todas las máscaras, entidades y límites de región probablemente tendrán que ajustarse si se utilizan diferentes tipos de celdas (por ejemplo, celdas de hámster chino) para realizar el ensayo.
La Figura 3 muestra cuatro paneles seleccionados para identificar los BNC (Figura3A-3D). Aquí se muestra un histograma que permite la selección de celdas con dos núcleos (Figura3A)y gráficas bivariadas que permiten la selección de BNCs con una circularidad similar (Figura3B), áreas e intensidades similares (Figura3C ) y las BNC que tengan núcleos bien separados y no superpuestos (figura3D) según la critieria de puntuación6,34. Figura 3 E muestra las imágenes BF y Hoechst, así como las máscaras BNC y MN que indican que los BNC con un MN simple o múltiple pueden ser identificados y enumerados. Esto permite calcular la genotoxicidad determinando la tasa de BNC micronucleadas en la población final de BNC. La Figura 4 muestra la aplicación de la función Recuento de puntos utilizando la máscara POLY para identificar las celdas MONO, TRI y QUAD. El número de celdas TRI y QUAD se puede sumar para obtener el número final de celdas POLY (Tabla 1). Esto permite que la citotoxicidad se calcule utilizando la fórmula que se muestra en el protocolo. Por lo tanto, cada punto de dosis en el experimento puede ser evaluado por parámetros de genotoxicidad y citotoxicidad.
La Figura 5 muestra los valores de genotoxicidad y citotoxicidad para la colchicina de aneugénica, el clastogen Mitomicina C y para un control negativo, Mannitol. Para La colchicina (Figura5A) las dosis de 0,02 a 0,05 g/ml produjeron aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia MN, que oscilaban entre el 1,28% y el 2,44%, respectivamente, sobre el control del disolvente (Tabla1). En el caso de la mitomicina C (Figura5B), las dos dosis superiores de 0,4 y 0,5 g/ml produjeron frecuencias MN estadísticamente significativas en comparación con los controles de disolvente. Estas frecuencias MN fueron del 0,93% a 0,4 g/ml y del 1,02% a 0,5 g/ml (Tabla2). Por último, para Mannitol (Figura5C),ninguna dosis probada induce una citotoxicidad superior al 30%, ni produjeron aumentos significativos en la frecuencia De MN en comparación con los controles de disolvente, como se esperaba (Tabla3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> Figura 1 : Ajustes del instrumento MIFC. Una captura de pantalla de la configuración MIFC como se describe en el paso de sección 7 del protocolo. (A) Ajuste de la potencia láser de 405 nm a 10 mW. (B) Ajuste de los canales BF 1 y 9. (C) Selección de la lente objetivo de aumento de 60x. (D) Selección de la velocidad de flujo más lenta que genera imágenes con la resolución más alta. (E) Especificar el número de eventos que se recopilarán en 20.000. (F) Haga clic en el botón Cargar para iniciar el proceso de carga de muestra. (G) Haga clic en el botón Adquirir para comenzar a adquirir imágenes. (H) Haga clic en el botón Retorno para devolver cualquier muestra no utilizada. (I) Gráfico de dispersión de la relación de aspecto BF frente al área BF para la selección de celdas individuales. (J) Diagrama de dispersión de Degradado Hoechst RMS frente a Degradado BF RMS para la selección de celdas enfocadas. (K) Histograma de intensidad Hoechst para la selección de células positivas de ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> Figura 2 : Estrategia de análisis de software. Una captura de pantalla de la estrategia de gating descrita en la sección 9 del protocolo. Las regiones se muestran en orden secuencial para la identificación de células binucleadas (caja roja), micronúcleos (caja amarilla) y células monoyucleadas y polinucleadas (caja azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> Figura 3 : Identificación y puntuación de BNCs con y sin MN. (A) Selección de células que tienen dos núcleos distintos. (B) Identificación de células binucleadas (BCN) que tienen dos núcleos altamente circulares mediante el uso de la función Intensidad de relación de aspecto. (C) Selección de BNCs que tienen núcleos con áreas e intensidades similares. Esto se logra calculando la relación entre el área de ambos núcleos como la relación de aspecto de ambos núcleos. (D) Uso de las características Relación de forma y Relación de aspecto para identificar los BNC que tienen dos núcleos bien separados. (E) La función de recuento de manchas mediante la máscara de micronúcleo (MN) que demuestra que se pueden identificar y enumerar bNC con un mN único o múltiple. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> Figura 4 : Identificación y puntuación de células MONO y POLY. Uso de la función de recuento de puntos para identificar y enumerar celdas mono, triculas y cuadránucleadas. La máscara de componente 1 permite la identificación de celdas mononucleadas (imagen superior). Las máscaras de componentes del 1 al 3 permiten la identificación de celdas trinucleadas (imagen media). Las máscaras de componentes del 1 al 4 permiten la identificación de celdas cuadranucleadas (imagen inferior). Esta cifra ha sido modificada de Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> Figura 5 : Cuantificación de la citotoxicidad. Citotoxicidad cuantificada utilizando el índice de proliferación de bloques de citoquinesis (círculos negros) y genotoxicidad cuantificada utilizando el porcentaje de MN (barras claras) tras una exposición de 3 h y una recuperación de 24 h para (A) Colchicina, (B) Mitomicina C y ( C) Mannitol. Los aumentos estadísticamente significativos en la frecuencia MN en comparación con los controles son indicados por las estrellas (prueba chi-cuadrada; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001). Todas las cantidades son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis. Esta cifra ha sido modificada de Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> Tabla 1: Los parámetros necesarios para calcular la citotoxicidad (el número de células mononucleadas, biypolinucleadas) y la genotoxicidad (el número y porcentaje de células binucleadas micronucleadas) para Colchicina. Todas las cantidades calculadas son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> Cuadro 2: Losparámetros necesarios para calcular la citotoxicidad (el número de células mononucleadas, biynucleadas) y la genotoxicidad (el número y porcentaje de células binucleadas micronucleadas) para la mitomicina C. Todas las cantidades calculadas son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> Cuadro 3: Los parámetros necesarios para calcular la citotoxicidad (el número de células mononucleadas, biypolinucleadas) y la genotoxicidad (el número y porcentaje de células binucleadas micronucleadas) para Mannitol. Todas las cantidades calculadas son el promedio de dos réplicas en cada punto de dosis.
Suplemento 1: Protocolo completo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Suplemento 2: Lista de máscaras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

El ensayo de micronúcleos in vitro es un método bien establecido para evaluar la genotoxicidad y la citotoxicidad, pero la puntuación del ensayo mediante microscopía manual es laboriosa y sufre de subjetividad y variabilidad entre marcadores. Este documento describe el protocolo desarrollado para realizar una versión totalmente automatizada del ensayo utilizando citometría de flujo de imágenes multiespectral.

Un método automatizado para realizar el ensayo de micronúcleos In Vitro mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

El ensayo de micronúcleos basado en flujos de imágenes puede superar varias limitaciones de métodos como la microscopía automatizada y la citometría de flujo convencional, incluyendo un bajo rendimiento y la falta de confirmación visual de eventos. La principal ventaja de esta técnica es que todos los eventos necesarios para determinar la genotoxicidad y la citotoxicidad se pueden identificar, identificar y puntuar automáticamente sin necesidad de crear diapositivas de microscopio. Para la exposición celular a clastógenos y/o anéuticos, añada un milímetro del producto químico de interés a siete a ocho veces 10 a la quinta de las células experimentales en nueve mililitros del medio de cultivo celular apropiado en un matraz T25 y un mililitro de agua a los cultivos de control.Incubar los matraces a 37 grados centígrados y cinco por ciento de dióxido de carbono durante tres horas antes de transferir las células a un tubo de polipropileno de 15 mililitros por matraz. Recoger las células por centrifugación y resuspender los pellets en 10 mililitros de medio de cultivo fresco por tubo para la siembra en nuevos matraces de cultivo T25. A continuación, añada 150 microlitros de la concentración en stock de citocaplasina B a cada matraz para lograr una concentración final de tres microgramos por mililitro.Devolver los matraces a la incubadora para un tiempo de recuperación igual a 1,5 a dos tiempos duplicados, según lo recomendado por las directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos. Al final del período de recuperación, transfiera los cultivos a tubos individuales de polipropileno de 15 mililitros para centrifugación y resuspend los pellets en cinco mililitros de cloruro de potasio milimiolar 75 mililitro. Mezclar suavemente por inversión tres veces e incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante siete minutos.Al final de la incubación, añadir dos mililitros de cuatro por ciento de formalina a cada muestra y mezclar suavemente con tres inversiones. Devuelva las muestras a cuatro grados centígrados durante 10 minutos antes de recoger las células por centrifugación. resuspender los pellets en 100 microlitros de formalina fresca del cuatro por ciento durante 20 minutos.Al final de la incubación, lave las células fijas en cinco mililitros de tampón de lavado por tubo por centrifugación y resusppend los pellets en 100 microlitros de tampón de lavado por tubo. A continuación, transfiera las muestras a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros para contar con un hemocicómetro. Añadir cinco microlitros de 100 microgramos por mililitro Hoechst 33342 por 1,0 x 10 a las seis células por mililitro y 10 microlitros de 500 microgramos por mililitro de RNase por cada 100 microlitros de muestra por tubo.Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius y cinco por ciento de dióxido de carbono, centrifugar las muestras en una microcentrífuga y eliminar todos los microlitros de sobrenadante de cada tubo. A continuación, resuspender cuidadosamente las muestras, teniendo cuidado de no inducir la formación de burbujas. Si aparecen burbujas al resuspension, deslice suavemente el tubo para extraerlas.Para ejecutar las muestras mediante citometría de flujo de imágenes multiespectral, primero encienda el láser de 405 nanómetros y ajuste la potencia del láser a 10 milivatios. Deshabilite todos los otros láseres, incluido el láser de dispersión lateral, y establezca el campo brillante en los canales uno y nueve. Confirme que el control deslizante de ampliación está establecido en 60x, que el modo de alta sensibilidad está seleccionado y que solo se muestran los canales uno, siete y nueve en la galería de imágenes.Haga clic en Gráfica de dispersión y seleccione toda la población y el área M01 en el eje X. Seleccione la relación de aspecto M01 en el eje Y y haga clic en región cuadrada para dibujar una región alrededor de las celdas individuales. Asigne un nombre a esta región a las celdas individuales y haga clic con el botón derecho en el trazado para seleccionar regiones.Resalte la región de celdas individuales y cambie las coordenadas X a 100 y 900 y las coordenadas Y a 0.75 y una. Establezca los parámetros de adquisición y especifique el nombre de archivo y la carpeta de destino. A continuación, cambie el número de eventos a 20.000, seleccione la población positiva de ADN y ejecute la primera muestra.Para abrir un archivo de datos en IDEAS, haga clic en Iniciar análisis para iniciar el Asistente para abrir archivos y busque para seleccionar el archivo de imagen sin formato deseado. A continuación, haga clic en Siguiente y busque una celda binucleated en la galería de imágenes. Para crear una máscara, haga clic para seleccionar la imagen de interés y abrir la pestaña de análisis.Haga clic en Máscaras, Nuevo y Función para seleccionar LevelSet. En Máscara, seleccione M07 y Máscara de nivel medio y establezca la escala de detalles del contorno en tres. A continuación, haga clic en Aceptar dos veces.Para detectar operaciones de celda binucleadas de recuento, abra la pestaña Análisis y seleccione Características y Nuevo. En Tipo de operación, seleccione Recuento de puntos. En Máscara, seleccione la máscara binucleada final y establezca la conexión en cuatro, luego cambie el nombre a BNC de recuento de manchas y haga clic en Aceptar y cerrar para calcular los valores de entidad.Para un histograma de celda binucleado de recuento de puntos, haga clic en histograma y seleccione no apoptopic como la población primaria. Para la operación Eje X, seleccione Recuento de manchas BNC y haga clic en Aceptar y región lineal, luego dibuje una región en Bim Two y asigne a esta región el nombre 2N. Para crear una máscara de micronúcleos, seleccione una celda binucleada que contenga un micronúcleo de la galería de imágenes y abra las máscaras en la pestaña Análisis.Para crear una máscara de identificación de punto, haga clic en Nuevo y función y seleccione Spot. Confirme que el botón de opción Brillante está seleccionado y seleccione M07 bajo máscara. Establezca la relación de fondo de punto a celda y el radio mínimo en dos y establezca el Radio máximo en seis.Haga clic en Aceptar y Aceptar para agregar la máscara a la lista de la izquierda y, a continuación, haga clic en Nuevo para crear otra máscara. Haga clic en el canal M07 de punto siete brillante dos seis dos máscara y haga clic en la flecha hacia abajo para agregarla a la definición de máscara y haga clic en los operadores Y y No. Haga clic en la flecha hacia abajo para agregar máscara de rango dilatado a la definición de máscara.Para crear una máscara de población polinucleada, haga clic en Análisis, Máscaras, Nuevo y Función. En Función, seleccione Rango. En Máscara, seleccione Conjunto de dilatación de cuenca hidrográfica M07 Channel07, Medio, tres, dos y establezca la imagen para que se muestre en Canal 07.Establezca los valores de área mínima y máxima en 135 y 5000, respectivamente, y establezca los valores de relación de aspecto mínimo y máximo en 0,4 y uno, respectivamente. Haga clic en Aceptar y, en el campo Nombre, cambie el texto para leer máscara POLY y, a continuación, haga clic en Aceptar y Cerrar. Para crear una vista personalizada, haga clic en el botón Propiedades de la Galería de imágenes, abra la pestaña Compuestos y haga clic en Nuevo.En Nombre, ingrese Canal 01 al Canal 07. Haga clic en Agregar imagen y, en Imagen, seleccione Canal 01 y establezca el porcentaje en 100. Haga clic en Agregar imagen de nuevo y, en imagen, seleccione Canal 07 y establezca el porcentaje en 100.Haga clic en la pestaña Ver, haga clic en Nuevo y, en Nombre, escriba Máscaras BNC y MN. A continuación, haga clic en Agregar columna y, en Tipo de imagen, seleccione Canal 01 y, en Máscara, seleccione Ninguno. Haga clic en Agregar columna y, en Tipo de imagen, seleccione Canal 07 y, en Máscara, seleccione Ninguno.Haga clic en Agregar columna, haga clic en el botón de opción Compuesto y, a continuación, haga clic en Aceptar para completar la vista personalizada. Haga clic en el menú desplegable Ver y haga clic en la vista Máscaras BNC y MN. Haga clic en el botón Mostrar máscaras ocultas.Para enumerar eventos clave, abra la pestaña Informes y haga clic en Definir informe de estadísticas y, a continuación, en la nueva ventana, haga clic en Agregar columnas. Para agregar la estadística de recuentos de celdas binucleadas, en Estadísticas, seleccione Recuento y, en Población seleccionada, seleccione la población de BNC y, a continuación, haga clic en Agregar estadísticas para agregar la estadística a la lista y guardar la plantilla. Una vez agregadas todas las estadísticas a la lista, haga clic en Cerrar, luego haga clic en Aceptar y, a continuación, guarde la plantilla de análisis de datos.Para procesar por lotes los archivos experimentales, en el menú Herramientas, haga clic en Archivos de datos por lotes y haga clic en Agregar lote en la nueva ventana. Haga clic en Agregar archivos para seleccionar los archivos de experimento que desea agregar al lote y haga clic en el botón Abrir carpeta en la opción Seleccionar una plantilla o un archivo de análisis de datos. Vaya a la plantilla que se acaba de guardar y ábrala.Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana actual. A continuación, haga clic en Enviar lotes para iniciar el procesamiento por lotes de todos los archivos. Aquí se muestran cuatro paneles seleccionados para identificar celdas binucleateds.Estas gráficas e histogramas bivariados permiten la selección de celdas binucleadas, así como la identificación de aquellas células que tienen dos núcleos con circularidad, áreas e intensidades similares y que están bien separadas unas de otras. Estas imágenes de Brightfield y Hoechst, así como las máscaras de célula binucleada y micronúcleos, facilitan la identificación y enumeración de células binucleadas y micronúcleos. La aplicación de la entidad de recuento de puntos utiliza la máscara polinucleada para identificar celdas mononucleares, trinucleares y cuadrúcleas.El número de células tri y cuadrranucleares se puede sumar para obtener el número final de células polinucleadas necesarias para el cálculo de la citotoxicidad. Aquí, se muestran valores representativos de genotoxicidad y citotoxicidad para la colchicina endógeno, la mitomicina C clastágena y un control negativo, el manitol, para demostrar la validez del protocolo. Etiquetar las células con una concentración adecuada de la mancha de ADN es fundamental para garantizar la captura de imágenes de alta calidad, lo que permite identificar y puntuar fácilmente todos los eventos clave.Estas técnicas también son aplicables al ensayo de micronúcleos para la biodosimetría de radiación, que permite la estimación de la dosis en individuos que pueden haber estado expuestos a la radiación.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Investigación

Bioingeniería

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimática Ensayo para medir la transcripción Inhibición por galio (III) y H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

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Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

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Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Detección de cáncer de ovario mediante citometría de flujo fotoacústico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Cuantificación simultánea de kynureninas seleccionadas analizadas por cromatografía líquida-espectrometría de masas en medio recogido de cultivos celulares oncológicos

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Una plataforma tecnológica de código abierto para fabricar modelos de cultivo 3D basados en hidrogel de manera automatizada y estandarizada

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...