Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Författaren tack Christine Probst (Luminex Corporation) för hennes insatser för att utveckla tidigare former av dataanalys mallen, liksom Dr Haley Pugsley (Luminex Corporation) och Dr Phil Morrissey (Luminex Corporation) för att granska och redigera Manuskript.

Författaren är anställd av Luminex Corporation, tillverkaren av imagestream Multispektrala Imaging Flow flödescytometerns som användes i detta arbete.

I en nyligen publikation Verma et al. underströk vikten av att utveckla ett system som kombinerar den höga genomströmningen fördelen av flödescytometri med data och bildlagring fördelarna med bildanalys35. Den MIFC in vitro-MN-analysen som beskrivs i detta dokument uppfyller detta citat och har potential att övervinna många av de ovan nämnda utmaningarna i mikroskopi och flödescytometri metoder. Det protokoll som beskrivs här visar att både cytotoxicitet och genotoxicitet kan utvärderas med hjälp av MIFC. Provberedning, cellulär färgning och datainsamling är enkla men det finns några kritiska steg i protokollet som alltid ska implementeras. Tillsats av kaliumklorid (KCl) till cellerna är avgörande för att svälla cellerna, genererar separation mellan de viktigaste kärnor. Detta säkerställer att maskeringsalgoritmen kan identifiera alla enskilda kärnor i BNCs och POLY celler (POLY celler) som är nödvändig för deras uppräkning. Dessutom, KCL ger separation mellan kärnor och MN, vilket är viktigt för noggrann MN maskering och kvantifiering. Dessutom förhindrar användningen av formalin efter tillsats av KCl celler från lyseringslösning under centrifugering. Tillsatsen av Cytochalasin B orsakar TK6 celler som har genomgått mer än en kärnkrafts Division vara ganska stor. Som ett resultat, cytoplasman blir bräcklig och kan lyse om centrifugering utförs omedelbart efter tillsats av KCl. Dessutom är det mycket viktigt att införa Hoechst i provet enligt antalet celler i provet och inte enligt en slutlig koncentration. Till exempel, en slutkoncentration av 10 μg/mL Hoechst kommer jämnt fläcken ett prov av 1 x 106 celler, men kanske inte tillräckligt fläcken ett prov som innehåller 5 x 106 celler och kan resultera i många celler med svagt färgade kärnor, vilket gör analys svårt. Det är också viktigt att notera att Hoechst kan ersättas med en annan DNA-färg som DAPI om MIFC är utrustad med 405 nm excitation laser eller DRAQ5 om MIFC är utrustad med 488 nm och/eller 642nm excitation laser (s). Om du ändrar den nukleära fläcken, är det viktigt att titrera fläcken för att hitta lämplig koncentration för önskad/önskad lasereffekt.
Vid insamling av data på MIFC är det viktigt att fastställa de optimala regions gränserna för Övertoningsfunktionerna i RMS. De gränser som anges i detta protokoll kan kräva justering på grund av vissa smärre variationer mellan MIFC-instrumenten. Tillämpningen av den här funktionen vid datainsamling är viktigt för att säkerställa att mycket fokuserade bilder fångas. Om datafiler innehåller många suddiga eller ofokuserade bilder, är det troligt att maskeringsalgoritmerna i analysprogram varan felaktigt markerar färgning artefakter i suddiga områden, vilket leder till ett stort antal falskt positiva artefakter som görs som MN. Även om den bildbehandling tekniker som beskrivs här kan vara svårt, när en analys mall har utvecklats i MIFC programvara, tillåter batch-bearbetning för datafiler att automatiskt analyseras, vilket eliminerar användarnas ingripande och därför, målskytt Bias. Dessutom, om en cellinjer än TK6 celler används för att utföra analysen, kommer det att bli nödvändigt att ändra masker och regions gränser som de morfologiska egenskaperna (t. ex. storlek) av celler kommer att skilja sig från de i TK6 celler.
De resultat som presenteras här (figur 5) visar statistiskt signifikanta ökningar av mn induktion när de exponerar TK6 celler till olika doser av mitomycin C och Colchicine. Statistiskt signifikanta ökningar av frekvensen av MN jämfört med lösningsmedels kontroller observerades för flera doser i båda kemikalierna. Dessutom inducerade ingen dos av mannitol en cytotoxicitet över 30%, och inte heller en statistiskt signifikant ökning av frekvensen av MN jämfört med kontroller av lösningsmedel, som förväntat. Det protokoll som beskrivs i detta dokument med hjälp av MIFC för att utföra in vitro-MN-analysen ger förväntade resultat från både positiva och negativa kontrollkemikalier. Det är mycket viktigt att utföra ett antal experiment med både lösningsmedels kontroller och negativa kontrollkemikalier för att utveckla utgångsvärden för både frekvensen av MN samt Cytokinesis block proliferation index (CBPI). För genotoxicitet bestäms statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvensen genom jämförelse med MN-frekvenser som måste vara välkända för den celltyp som används. Dessutom baseras alla beräkningar av cytotoxicitet på kontroll provens CBPI och därför måste baslinje frekvenserna för MONO-, BNCs-och POLY-celler vara väl kvantifierade i kontrollerna.
Flera begränsningar och fördelar med att använda mifc i samband med mn-analysen har beskrivits i tidigare arbete29,32. De viktigaste begränsningarna gäller lägre MN frekvenser jämfört med mikroskopi, vilket förmodligen beror både på bristen på flexibilitet vid genomförandet av bedömningskriterierna i analysprogram varan samt det begränsade skärpedjupet av MIFC. Väl konturformade masker kan skapas för att exakt identifiera de viktigaste kärnor men MN som vidrör (eller mycket nära) de viktigaste kärnor kan fångas inom BNC masken. Dessutom mycket små MN som kan vara ganska lätt att göra med hjälp av mikroskopi är förmodligen felaktigt missade när du använder MIFC på grund av den nedre gränsen på området parametern i MN mask för att undvika scoring små artefakter. Förutom de svårigheter som finns i bildbaserad dataanalys, på grund av dess utformning, erhåller MIFC tvådimensionella projicering bilder av tredimensionella cellulära objekt. Detta orsakar sannolikt några MN att fångas på ett annat djup fokus att de två viktigaste MN, vilket gör dem verkar mycket svagt och un-scorable med maskering. Dessutom kan en liten del av MN bor bakom en av de två huvudsakliga kärnor, vilket gör dem omöjliga att visualisera och värdering. Därför, med tanke på dessa svårigheter, försiktighet bör iakttas vid tolkning av betydande ökningar i MN frekvens vid låga doser.
Trots dessa brister, den MIFC metod som beskrivs här erbjuder flera fördelar jämfört med andra tekniker. Fenech et al. förslag till kriterier och riktlinjer som bör övervägas vid utveckling av automatiserade system och metoder för MN-analyser36. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, direkt visualisering av de viktigaste kärnor och cytoplasma, bestämning av frekvensen av MN från olika doser av den kemiska eller medel som testas och förmågan att kvantifiera morfologi och bestämma positionen för alla kärnor och MN för att säkerställa att de är inom cytoplasman. Detta dokument visar att MIFC-metoden som utvecklats för att utföra den in vitro-MN-analysen uppfyller (eller besitter potentialen att tillfredsställa) dessa kriterier. Specifikt, bilder av atomkärnor och MN kan fångas upp av fluorescerande lasrar medan cytoplasmiska bilder kan erhållas genom att använda BF LED. Bilder av celler med normal nukleär morfologi kan automatiskt differentieras från dessa celler med oregelbunden morfologi med hjälp av en kombination av avancerade masker och funktioner. De resultat som presenterats för kolkicin och Mitomycinc (figur 5) visar att både genotoxicitet och cytotoxicitet kan bedömas vid olika doser jämfört med kontroll av lösningsmedel och att statistiskt signifikanta mn-frekvenser observeras där Förväntade. OECD: s testriktlinje 487 rekommenderar dessutom att man bedömer 2 000 BNCs per testkoncentration för att bedöma förekomsten av MN för bestämning av genotoxicitet tillsammans med minst 500 celler per test koncentration för bestämning av cytotoxicitet9. Detta kan ta över 1 h med hjälp av manuell mikroskopi. Protokollet och resultaten i detta dokument visar att ett genomsnitt på cirka 6 000 BNCs, 16 000 MONO celler, och 800 POLY celler fångades och poängsätts per testkoncentration i ca 20 min. Den snabba datainsamling och det stora antalet kandidat celler som görs på så kort tid belysa en annan viktig fördel med att anställa MIFC att utföra in vitro-MN-analysen.
Medan de resultat som presenteras i detta dokument är uppmuntrande, de är representativa för en tidig proof-of-koncept metod. Detta arbete bör följas upp genom en mer grundlig undersökning av en större, mer diversifierad kemikalie uppsättning som omfattar flera klasser och mekanismer för genotoxicitet och cytotoxicitet såsom de som föreslagits av Kirkland et al.37 genomföra sådana studier är tidskrävande och arbetsintensiva, och faller utanför tillämpningsområdet för detta dokument men dessa större skala studier kommer att ge värdefull insikt i förmågan hos metoden att tillförlitligt identifiera svagt genotoxiska agenter. Den metodik som presenteras här har ännu inte miniatyriserats till en mikrobrunn format, vilket skulle möjliggöra en snabbare och effektivare screening över ett större dosintervall. Som sådan, i sin nuvarande form, den MIFC-baserade in vitro-MN-analys som presenteras här kan vara bäst lämpad för arbetsintensiva uppföljningsstudier eller forskning om god laboratoriesed. Metoden kommer dock att fortsätta att optimeras och valideras och ha potential att möjliggöra ökad flexibilitet vid detektering av kemiska specifika händelser relaterade till morfologi, såsom aneugen-exponering som ökar andelen celler med icke-cirkulära kärnor som fortfarande är och38. Slutligen presenterar mifc-metoden en möjlighet att införa ytterligare biomarkörer i mn-analysen (t. ex. Kinetochor-färgning) för att ge en mer heltäckande bild av mekanismen för mn-induktion.

Mikrokärntestet in vitro är ett vanligt förekommande test för att bedöma cytotoxicitet och genotoxicitet som screening verktyg inom flera områden såsom kemisk och farmaceutisk utveckling samt Human biologisk övervakning bland individer som utsätts för olika miljö-, arbets-eller livsstilsfaktorer1,2,3. MN bestå av kromosom fragment eller hela kromosomer som genereras under celldelning som inte ingår i en av de två huvudsakliga dotter kärnor. Efter Telophase bildar detta kromosomala material in i en individuell, rundad kropp inne i cytoplasman som är skild från någon av de viktigaste atomkärnor2. Därför är MN representativa för DNA-skador och har använts i många år som en Endpoint i genotoxicitetstester4. Den lämpligaste metoden för att mäta mn är cytokinesis-blocket mikrokärntest (cbmn)-analysen. Med hjälp av CBMN-analysen kan frekvensen av MN i binucleated Cells (BNCs) poängsätts genom att införliva Cytochalasin B (CYT-B) i provet. CYT-B tillåter Nuclear division men förhindrar cellulära Division och därmed begränsar scoring av MN till BNCs som har delat endast en gång5.
Protokoll som använder både mikroskopi och flödescytometri har utvecklats och validerats och används rutinmässigt för att utföra den in vitro-mn-analysen6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Microscopy fördelar från att kunna visuellt bekräfta att MN är legitima men är tidskrävande och benägna att variationer mellan SCORERS15. För att åtgärda detta utvecklades automatiserade mikroskopi metoder för att skanna bilder och ta bilder av kärnor och mn16,17,18,19, men cytoplasman kan inte visualiseras, vilket gör det svårt att avgöra om ett MN faktiskt är associerat med en specifik cell. Dessutom har dessa metoder svårt att identifiera polynucleated (POLY) celler (inklusive Tri-och quadranucleated celler) som krävs för beräkning av cytotoxicitet vid användning av CYT-B9. Flödescytometrimetoder som utvecklats för att utföra mn-analysen använder fluorescens samt framåt-och sido spridningsnivåer för att identifiera populationer av både atomkärnor och mn som har befriats från cellen efter lysis20,21 ,22. Detta gör att data kan förvärvas från flera tusen celler på några minuter och tillåter automatiserad analys23; men oförmåga att visualisera cellerna gör det omöjligt att bekräfta att poängsatta händelser är äkta. Dessutom, lyseringslösning cellmembranet hämmar användningen av CYT-B samt skapa en suspension som innehåller andra skräp såsom kromosom aggregat eller apoptotiska organ och det finns inget sätt att skilja dessa från MN24.
Mot bakgrund av dessa begränsningar, Multispektrala Imaging Flow Cytometry (MIFC) är ett idealiskt system för att utföra MN-analysen eftersom den kombinerar högupplöst fluorescerande bilder av mikroskopi med statistisk robusthet och hastighet konventionella flödescytometri. I mifc, alla celler introduceras i ett mikroströmning system och sedan hydrodynamiskt fokuserad i mitten av en flöde cell kuvette. Ortogonala belysning av alla celler åstadkoms genom användning av en brightfield (BF) lysdioder (LED), en sida scatter laser och (åtminstone) en fluorescerande laser. Fluorescerande fotoner fångas upp av en av tre (20x, 40x eller 60x) hög numerisk bländare objektiv och sedan passera genom en spektral nedbrytning element. Fotoner är sedan fokuserade på en laddning-kopplad enhet (CCD) kamera för att få högupplösta bilder av alla celler som passerar genom cellen flöde. För att undvika oskärpa eller ränder, fungerar CCD i tidsfördröjning integration (TDI) läge som spårar objekt genom att överföra pixelinnehåll från rad till rad ner CCD i Synchrony med hastigheten på cellen i flödet. Pixel information samlas sedan in från den sista raden med pixlar. TDI-avbildning kombinerat med spektralnedbrytning gör att upp till 12 bilder (2 BF, 10 lysrör) fångas samtidigt från alla celler som passerar genom cellen flöde. Alla tagna bilder lagras i exempelspecifika datafiler, vilket möjliggör analys som ska utföras när som helst med hjälp av MIFC dataanalysprogram vara. Slutligen behåller datafiler länken mellan cellulära bilder och prickar på alla bivariate tomter. Detta innebär att varje prick på en traditionell bivariat tomt kan markeras och dess motsvarande BF och fluorescerande bilder kommer att visas25.
Nyligen har mifc-baserade metoder utvecklats för att utföra mn-analysen för både triage Radiation biodosimetri26,27,28,29,30,31 och genetiska toxikologi32,33 testning. Detta arbete har visat att cellulära bilder av huvudsakliga kärnor, MN och cytoplasman kan avbildas med högre genomströmning än andra metoder26. Alla celltyper som krävs för analys, inklusive MONO celler, BNCs (med och utan MN), och POLY celler, kan identifieras automatiskt i MIFC dataanalysprogram vara, och genomförandet av bedömningskriterier som utvecklats av Fenech et al. åstadkoms genom användningen av olika matematiska algoritmer6,34. Resultaten från biodosimetri visade att kalibreringskurvor för dos reaktion var likartade i storleksordning som de som erhållits från andra automatiserade metoder i litteraturen vid kvantifiering av hastigheten för MN per BNC29. Dessutom, senaste arbete i toxikologi visade att bilder av MONO celler, BNCs (med och utan MN) och POLY celler kan automatiskt fångas, identifieras, klassificeras och räknas med MIFC. Protokollet och dataanalysen möjliggjorde beräkningen av cytotoxicitet och genotoxicitet efter att ha exponerar TK6 celler för flera klastogener och aneugener32.
Det protokoll som presenteras i detta dokument beskriver en metod för att utföra in vitro-MN-analysen med MIFC. Den prov bearbetningsteknik som används i detta arbete kräver mindre än 2 timmar för att bearbeta ett enda prov och är relativt lätt att utföra i jämförelse med andra metoder. Dataanalysen i MIFC-analyprogramvaran är komplicerad, men skapandet av analys mal len kan åstadkommas inom några timmar efter de steg som beskrivs i detta dokument. Dessutom, när mallen har skapats, kan den automatiskt tillämpas på alla insamlade data utan ytterligare arbete. Protokollet beskriver alla steg som krävs för att exponera TK6 celler för clastogener och aneugens, beskrivs hur man odlar, bearbetar och fläcken cellerna, och visar hur man skaffar högupplösta bilder med hjälp av MIFC. Dessutom illustrerar detta papper den nuvarande bästa praxis för att analysera data i MIFC programvara för att automatiskt identifiera och värdering MONO celler, BNCs, och POLY celler för att beräkna både cytotoxicitet och genotoxicitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

In vitro-analys av mikrokärnor (MN) används ofta för att utvärdera cytotoxicitet och genotoxicitet men scoring analysen via manuell mikroskopi är mödosam och introducerar osäkerhet i resultaten på grund av variationer mellan SCORERS. För att avhjälpa detta har automatiserad bild skanning mikroskopi samt konventionella flödescytometri metoder införts i ett försök att ta bort målskytt bias och förbättra genomströmningen. Emellertid, dessa metoder har sina egna inneboende begränsningar såsom oförmåga att visualisera cytoplasman i cellen och avsaknaden av visuell MN verifiering eller bild datalagring med flödescytometri. Multispektrala Imaging Flow Cytometry (MIFC) har potential att övervinna dessa begränsningar. MIFC kombinerar den högupplösta fluorescerande bilden av mikroskopi med den statistiska robustheten och hastigheten hos konventionell flödescytometri. Dessutom kan alla insamlade bilder lagras i dosspecifika filer. Detta dokument beskriver det protokoll som utvecklats för att utföra en helt automatiserad version av MN-analysen på MIFC. Humana lymfoblastoid TK6 celler utvidgades med hjälp av en hypoton lösning (75 mM KCl), fast med 4% formalin och kärninnehållet färgas med Hoechst 33342. Alla prover kördes i suspension på MIFC, tillåter förvärv av högupplösta bilder av alla viktiga händelser som krävs för analysen (t. ex. binucleated celler med och utan MN samt mononukleerade och polynucleated celler). Bilder identifierades automatiskt, kategoriseras och räknas upp i MIFC dataanalysprogram vara, vilket möjliggör automatiserad bedömning av både cytotoxicitet och genotoxicitet. Resultaten visar att användning av MIFC för att utföra den in vitro-MN-analysen möjliggör statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvens som ska upptäckas vid flera olika nivåer av cytotoxicitet jämfört med kontroller av lösningsmedel efter exponering av TK6-celler för att Och kolkicin, och att inga signifikanta ökningar av MN-frekvensen observeras efter exponering för mannitol.

Den analysmetod som beskrivs i detta dokument möjliggör automatisk identifiering och poängsättning av BNCs, med och utan MN, för att beräkna genotoxicitet. Dessutom, MONO och POLY celler identifieras också automatiskt och Poäng för att beräkna cytotoxicitet. Publicerade bedömningskriterier6,34 som måste följas vid bedömning av dessa händelser genomförs i mifc dataanalysprogram vara. De resultat som presenteras här tyder på att statistiskt signifikanta ökningar i MN frekvens med ökande cytotoxicitet kan upptäckas efter exponering av humana lymfoblastoid TK6 celler till välkända MN inducerande kemikalier (mitomycin C och Kolchixin). Liknande resultat för ytterligare testade kemikalier har visats i en separat publikation32. Dessutom visar resultaten från användningen av mannitol att icke-MN-inducerande kemikalier också kan identifieras korrekt med hjälp av MIFC-metoden som beskrivs här. Parametrarna som beskrivs i protokollet för att skapa alla masker, funktioner och områdesgränser kommer sannolikt att behöva justeras om olika celltyper (t. ex. kinesiska hamster celler) används för att utföra analysen.
Figur 3 visar fyra valda paneler för att identifiera BNCs (figur 3A-3D). Här visas ett histogram som gör det möjligt att välja ut celler med två kärnor (figur 3a) och bivariat som gör det möjligt att välja BNCs med liknande cirkulär (figur 3B), liknande områden och intensiteter (figur 3C ) och BNCs som har väl separerade, icke-överlappande kärnor (figur 3D) enligt poängsättningen frågevillkoret6,34. Figur 3 E visar BF och Hoechst bilder samt BNC och mn masker som indikerar att BNCs med en eller flera mn kan identifieras och räknas. Detta gör det möjligt att beräkna genotoxicitet genom att fastställa frekvensen av BNCs med mikrokärnor i den slutliga BNC-populationen. Figur 4 visar tillämpningen av funktionen spot Count med hjälp av poly mask för att identifiera mono, Tri och quad celler. Antalet TRI-och QUAD-celler kan sedan summeras för att erhålla det slutliga antalet POLY-celler (tabell 1). Detta gör det möjligt att beräkna cytotoxicitet med hjälp av formeln som visas i protokollet. Därför kan varje dos punkt i experimentet utvärderas med både genotoxicitet och cytotoxicitetsparametrar.
Figur 5 visar genotoxicitet och cytotoxicitetsvärden för aneugen kolkicin, klastogen Mitomycinc och för en negativ kontroll, mannitol. För kolkicin (figur 5A) gav doserna 0,02 till 0,05 μg/ml statistiskt signifikanta ökningar i mn-frekvens, från 1,28% till 2,44% över lösningsmedels kontrollen (tabell 1). När det gäller mitomycin C (figur 5B) producerade de två översta doserna 0,4 och 0,5 μg/ml statistiskt signifikanta mn-frekvenser jämfört med kontroller av lösningsmedel. Dessa MN-frekvenser var 0,93% vid 0,4 μg/mL och 1,02% vid 0,5 μg/mL (tabell 2). Slutligen, för mannitol (figur 5C), inga testade doser inducera en cytotoxicitet över 30%, inte heller de producerar betydande ökningar i mn frekvens jämfört med lösningsmedel kontroller, som förväntat (tabell 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> Figur 1 : Inställningar för Mifc-instrument. En skärmbild av MIFC-inställningarna enligt beskrivningen i avsnitt steg 7 i protokollet. A) inställning av 405 nm lasereffekt till 10 MW. (B) ställa in BF kanalerna 1 och 9. (C) välja objektivet 60x förstorings objektiv. (D) välja den långsammaste flödeshastigheten som genererar bilder med den högsta upplösningen. E) specificera antalet händelser som ska samlas in till 20 000. (F) Klicka på knappen load för att påbörja prov laddningsprocessen. (G) Klicka på knappen Hämta för att börja skaffa bilder. (H) Klicka på Return -knappen för att returnera eventuellt oanvänt prov. (I) scatterplot av BF aspektförhållande kontra BF område för val av enstaka celler. (J) scatterplot av Hoechst lutning RMS kontra BF lutning RMS för val av fokuserade celler. (K) histogram över Hoechst intensitet för val av DNA-positiva celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> Figur 2 : Analysprogramvara gating strategi. En skärmdump av den gating strategi som beskrivs i avsnitt 9 i protokollet. Regioner visas i sekventiell ordning för identifiering av binucleated celler (röd ruta), mikrokärnor (gul ruta), och mono-och polynucleated celler (blå ruta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> Figur 3 : Identifiering och poängsättning av BNCs med och utan mn. (A) val av celler som har två distinkta kärnor. B) identifiering av binucleerade celler (BNCs) som har två mycket cirkulära kärnor genom användning av funktionen för proportioner. C) urval av BNCs som har kärnor med liknande områden och intensiteter. Detta åstadkoms genom att beräkna förhållandet mellan området av både kärnor och förhållandet mellan proportionerna av båda kärnor. Danvändning av form kvoten och proportionerna för att identifiera BNCs som har två väl avgränsade kärnor. (E) funktionen spot Count med hjälp av mikrokärnmasken (MN) som visar att BNCs med en eller flera mn kan identifieras och räknas upp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> Figur 4 : Identifiering och poängsättning av mono-och Poly-celler. Användning av funktionen spot Count för att identifiera och räkna upp mono-, Tri-och quadranucleated celler. Komponent mask 1 gör det möjligt att identifiera mononukleerade celler (översta bilden). Komponentmasker 1 till 3 gör det möjligt att identifiera trinukleerade celler (mellersta bilden). Komponentmasker 1 till 4 möjliggör identifiering av quadranucleated celler (botten bild). Denna siffra har modifierats från Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> Figur 5 : Kvantifiering av cytotoxicitet. Cytotoxicitet kvantifieras med hjälp av cytokinesi-blockspridningsindex (svarta cirklar) och genotoxicitet som kvantifierats med hjälp av den procentuella andelen MN (genomskinliga staplar) efter en exponering på 3 timmar och 24 h återhämtning för (a) kolkicin, (B) mitomycinc och ( C) mannitol. Statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvens jämfört med kontroller indikeras med stjärnor (Chi-kvadrattest, *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001). Alla kvantiteter är medelvärdet av två replikat vid varje dos punkt. Denna siffra har modifierats från Rodrigues 201832. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> Tabell 1: De parametrar som krävs för att beräkna cytotoxicitet (antalet mono-, bi-och polynucleated celler) och genotoxicitet (antalet och procent av mikrokärnor binucleated celler) för kolkicin. Alla beräknade kvantiteter är genomsnittet av två replikat vid varje dos punkt.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> Tabell 2: Deparametrar som krävs för att beräkna cytotoxicitet (antalet mono-, bi-och polynucleerade celler) och genotoxicitet (antal och procent av mikrokärnbaserade binukleerade celler) för mitomycin C. Alla beräknade kvantiteter är genomsnittet av två replikat vid varje dos punkt.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> Tabell 3: De parametrar som krävs för att beräkna cytotoxicitet (antalet mono-, bi-och polynucleated-celler) och genotoxicitet (antalet och procentandelen av de binucleerade cellerna i mikrokärnor) för mannitol. Alla beräknade kvantiteter är genomsnittet av två replikat vid varje dos punkt.
Tillägg 1: fullständigt protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>
Tillägg 2: mask lista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Mikrokärnanalysen in vitro är en väletablerad metod för att utvärdera genotoxicitet och cytotoxicitet men poängsättningen av analysen med hjälp av manuell mikroskopi är mödosam och lider av subjektivitet och variabilitet mellan målgörare. Denna uppsats beskriver det protokoll som utvecklats för att utföra en helt automatiserad version av analysen med hjälp av Multispektrala Imaging Flow cytometry.

En automatiserad metod för att utföra Mikrokärnanalys in vitro med hjälp av Multispektral avbildning flödescytometri

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Bilden ström-baserade micronucleus assay kan övervinna flera begränsningar av metoder såsom automatiserad mikroskopi och konventionella flöde cytometry, inklusive låg genomströmning och brist på visuell bekräftelse av händelser. Den största fördelen med denna teknik är att alla nödvändiga händelser för att bestämma genotoxicitet och cytotoxicitet automatiskt kan avbildas, identifieras och poängsätts utan att behöva skapa mikroskop diabilder. För cellexponering för clastogener och/eller aneugens, tillsätt en millimeter av kemikalien av intresse till sju till åtta gånger 10 till den femte av de experimentella cellerna i nio milliliter av lämpligt cellodlingsmedium i en T25-kolv och en milliliter vatten till kontrollkulturerna.Inkubera kolvarna i 37 grader Celsius och fem procent koldioxid i tre timmar innan cellerna överförs till en 15 milliliter polypropylen röret per kolv. Samla upp cellerna genom centrifugering och resuspend pelletsen i 10 milliliter färsk odling medium per rör för sådd i nya T25 odlingskolvar. Tillsätt sedan 150 mikroliter av lagerkoncentrationen av cytochalasin B till varje kolv för att uppnå en slutlig koncentration av tre mikrogram per milliliter.Återför kolvarna till inkubatorn för en återhämtningstid som motsvarar 1,5 till två fördubblingstider, enligt deklarationen från Organisationen för ekonomiskt samarbete och utvecklingsriktlinjer. Vid återvinningsperiodens överför man kulturerna i enskilda 15 milliliter polypropylenrör för centrifugering och återanvänder pelletarna i fem milliliter på 75 millimolär kaliumklorid. Blanda försiktigt genom inversion tre gånger och inkubera proverna i fyra grader Celsius i sju minuter.I slutet av inkubationen, tillsätt två milliliter av fyra procent formalin till varje prov och blanda försiktigt med tre inversioner. Återför proverna till fyra grader Celsius i 10 minuter innan du samlar in cellerna genom centrifugeringen. resuspend pellets i 100 mikroliter av färska fyra procent formalin i 20 minuter.Vid slutet av inkuberingen, tvätta de fasta cellerna i fem milliliter tvättbuffert per rör genom centrifugering och återanvända pelletsen i 100 mikroliter tvättbuffert per rör. Därefter överför du proverna till enskilda 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för att räkna med en hemocytometer. Tillsätt fem mikroliter på 100 mikrogram per milliliter Hoechst 33342 per 1,0 x 10 till de sex cellerna per milliliter och 10 mikroliter på 500 mikrogram per milliliter RNase per 100 mikroliter prov per rör.Efter en 30 minuters inkubation vid 37 grader Celsius och fem procent koldioxid, centrifugerna proverna i en mikrocentrifug och ta bort alla utom 30 mikroliter av supernatant från varje rör. Sedan försiktigt återanvända proverna, ta hand om att inte inducera bubbla bildning. Om bubblor visas vid återfpension, försiktigt flick röret för att ta bort dem.För att köra proverna genom multispektrala bildande flödescytometri, först slå på 405 nanometerlaser och ställ in lasereffekten på 10 milliwatt. Inaktivera alla de andra lasrarna, inklusive sidosprid lasern, och ställ in brightfield till kanaler ett och nio. Bekräfta att förstoringsreglaget är inställt på 60x, att högkänslighetsläget är markerat och att endast kanalerna ett, sju och nio visas i bildgalleriet.Klicka på Scatter Plot och välj alla population och område M01 på X-axeln. Välj proportioner M01 på Y-axeln och klicka på fyrkantig region för att rita ett område runt de enstaka cellerna. Namn denna region enda celler och högerklicka på tomten för att välja regioner.Framhäv regionen med enstaka celler och ändra X-koordinaterna till 100 och 900 och Y-koordinaterna till 0,75 och en. Ställ in anskaffningsparametrarna och ange filnamnet och målmappen. Ändra sedan antalet händelser till 20, 000, välj DNA-positiv population och kör det första provet.Om du vill öppna en datafil i IDÉER klickar du på Starta analys för att starta guiden Öppna fil och bläddra för att välja önskad råbildfil. Klicka sedan på Nästa och bläddra efter en binucleated cell i bildgalleriet. Om du vill skapa en mask klickar du för att välja bilden av intresse och öppnar analysfliken.Klicka på Masker, Nytt och Funktion om du vill välja LevelSet. Under Mask väljer du M07 och Mellannivåmask och ställer in konturdetaljernas skala till tre. Klicka sedan på OK två gånger.Om du vill dekorera lagerplats för binucleated cellfunktioner, öppna fliken Analys och välj Funktioner och Nytt. För funktionstyp väljer du Dekorantal. För Mask väljer du den slutliga binucleated masken och ange bindningsbarheten till fyra, ändra sedan namnet till Spot Count BNC och klicka på OK och stäng för att beräkna funktionsvärdena.För en dekorräkning binucleated cell histogram, klicka histogram och välj icke-apoptopic som den överordnade befolkningen. För X-axeln funktionen, välj Dekorräkning BNC och klicka på OK och linjär region, dra sedan en region över Bim Two och namn här region 2N. Om du vill skapa en mikrokärnmask markerar du en binucleerad cell som innehåller en mikrokärna från bildgalleriet, och öppnar masker i fliken Analys.Om du vill skapa en dekoridentifieringsmask en klickar du på Ny och Funktion och väljer Dekor. Bekräfta att ljusstark alternativknapp är markerad, och välj M07 under mask. Ange Dekor till cellbakgrundsförhållande och minsta radie på två och ställ in maximal radie till sex.Klicka på OK och OK om du vill lägga till masken i listan till vänster, klicka sedan på Ny för att skapa en annan mask. Klicka på Spot M07 Channel seven Bright två sex två mask och klicka på nedåtpilen för att lägga till den i masken definition och klicka på och inte operatorer. Klicka på nedpilen om du vill lägga till vidgade intervallmask i maskdefinitionen.Om du vill skapa en polynukleerad populationsmask klickar du på Analys, Masker, Ny och Funktion. Välj Område under Funktion. Under Mask väljer du Vattendelare Inställt M07 Channel07, Mitten, tre, två och ställer in bilden på kanal 07.Ange minimi- och maximiområdesvärdena till 135 respektive 5000 och ange minimi- och maximi-bredd-höjd-värde till 0,4 respektive ett. Klicka på OK och i namnfältet ändrar du texten så att polymasken läses, klicka sedan på OK och Stäng. Om du vill skapa en anpassad vy klickar du på knappen Egenskaper för bildgalleri, öppnar fliken Kompositer och klickar på Nytt.Under Namn anger du Kanal 01 till Kanal 07. Klicka på Lägg till bild och under Bild väljer du Kanal 01 och anger procenten till 100. Klicka på Lägg till bild igen och under bild väljer du Kanal 07 och anger procenten till 100.Klicka på fliken Visa, klicka på Nytt och ange BNC- och MN-masker under Namn. Klicka sedan på Lägg till kolumn och välj Kanal 01 och under Mask under Bildtyp. Klicka på Lägg till kolumn och välj Kanal 07 under Bildtyp och under Mask väljer du Ingen.Klicka på Lägg till kolumn, klicka på alternativknappen Sammansatt och sedan på Okej för att slutföra den anpassade vyn. Klicka på pulldown-menyn Visa och klicka på BNC- och MN-maskervyn. Klicka på knappen Visa dölja masker.Om du vill räkna upp nyckelhändelser öppnar du fliken Rapporter och klickar på Definiera statistikrapport, sedan klickar du på Lägg till kolumner i det nya fönstret. Om du vill lägga till statistiken för lagerplatsutdelningar i cellantal markerar du Antal och under Markerad population, bNC-populationen genom att klicka sedan på Lägg till statistik för att lägga till statistiken i listan och spara mallen. När all statistik har lagts till i listan klickar du på Stäng, sedan på OK, sedan spara dataanalysmallen.Om du vill batchbeprocessen de experimentella filerna klickar du på Batchdatafiler under Verktyg-menyn och klickar på Lägg till batch i det nya fönstret. Klicka på Lägg till filer för att markera experimentfilerna som ska läggas till i batchen och klicka på knappen Öppna mapp under alternativet Välj en mall eller dataanalysfil. Bläddra till den mall som just har sparats och öppna den.Klicka på OK för att stänga det aktuella fönstret. Klicka sedan på Skicka batchar för att starta batchbearbetningen av alla filer. Här visas fyra markerade paneler för identifiering av binucleerade celler.Dessa bivariata tomter och histogram möjliggör val av binucleerade celler samt identifiering av de celler som har två kärnor med liknande cirkuläritet, områden och intensiteter och som är väl åtskilda från varandra. Dessa Brightfield och Hoechst bilder, liksom binucleated cell och mikronukleus masker, underlätta identifiering och uppräkning av binucleated celler och mikrokärnor. Tillämpning av funktionen dekorräkning använder polynucleated masken för att identifiera mononukleära, trinuclear och quadranuclear celler.Antalet tri- och quadranuclearceller kan sedan summeras för att erhålla det slutliga antalet polynukleerade celler som krävs för beräkning av cytotoxicitet. Här visas representativa genotoxicitets- och cytotoxicitetsvärden för endogenskolkicin, den clastogena mitomycin C, och en negativ kontroll, mannitol, för att visa protokollets giltighet. Märkning av cellerna med en lämplig koncentration av DNA-fläck är avgörande för att säkerställa högkvalitativ bildfångst, vilket gör det lättare att identifiera och poängsas med alla viktiga händelser.Dessa tekniker är också tillämpliga på mikrokärnanalysen för strålningsbiodosimetri, vilket möjliggör dosuppskattning hos individer som kan ha exponerats för strålning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Lokalisering och relativ kvantifiering av kolnanorör i celler med multispekt flödescytometri

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatisk analys för att mäta transkription Hämning av gallium (III) och H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroflödes Flow Chambers Använda Beredd blod till modell Hemostas och trombocyttransfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen uttryck analys av Endothelial celler utsätts för Shear Stress med hjälp av flera parallella-plattan flöde Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Äggstocks cancer detektion med Photoacoustic Flow Cytometry

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Samtidig kvantifiering av utvalda kynukreniner analyserade av flytande kromatografi-masspektrometri i medium som samlats in från cancercellkulturer

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

En öppen källkodsteknikplattform för tillverkning av hydrogelbaserade 3D-kulturmodeller på ett automatiserat och standardiserat sätt

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...