Name: an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2019-05-13T12:30:00
Duration: 12 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Yazar sayesinde Christine Probst (Luminex Corporation) veri analizi şablonu önceki formları gelişmekte olan çabaları için, yanı sıra Dr Haley Pugsley (Luminex Corporation) ve Dr Phil Morrissey (Luminex Corporation) incelemek ve düzenlemek için El yazması.

Yazar Luminex Corporation, bu çalışmanın kullanılan ImageStream multispektral görüntüleme akışı sitometresi yapımcısı tarafından istihdam edilmektedir.

Son yayınında Verma ve al. akış sitometrisinin yüksek verimlilik avantajı ile görüntü analizi35veri ve görüntü depolama yararları birleştiren bir sistem geliştirme önemini vurguladı. Bu yazıda açıklanan MIFC in vitro MN tahlil bu tırnak karşılar ve mikroskobik ve akış sitometri yöntemlerinde yukarıda bahsedilen zorlukların çoğunu aşmak için potansiyele sahiptir. Burada açıklanan protokol, her iki sitotoksisite ve genotoksisite MIFC kullanılarak değerlendirilebilir gösterir. Numune hazırlama, hücresel boyama ve veri toplama basit ancak her zaman uygulanması gereken protokolde bazı kritik adımlar vardır. Hücrelere potasyum klorür (KCl) ilavesi, hücreleri şişmeye, ana çekirdekler arasında ayrılık yaratan öneme sahiptir. Bu maskeleme algoritması BNCs ve POLY hücreler (POLY hücreler) kendi numaralandırma için gerekli olan tüm bireysel çekirdekleri tanımlayabilir sağlar. Ayrıca, KCL doğru MN maskeleme ve quantitation için gerekli olan çekirdekler ve MN arasında ayrım sağlar. Ayrıca, KCL ilavesi sonrasında formalin kullanımı santrifüjleme sırasında hücrelerin parçalanması önler. Sitalasin B ilavesi, birden fazla nükleer bölünme geçirmiş TK6 hücrelere oldukça büyük olması neden olur. Sonuç olarak, sitoplazma kırılgan hale gelir ve santrifüjleme KCl eklendikten hemen sonra gerçekleştirilirse Lyse olabilir. Dahası, örnekdeki hücrelerin sayısına göre ve son konsantrasyona göre değil, örneklere Hoechst tanıtmak çok önemlidir. Örneğin, Hoechst 10 μg/ml son konsantrasyon eşit 1 x 106 hücreli bir örnek leke olacak ama yeterli 5 x 106 hücre içeren bir örnek leke olmayabilir ve loş lekeli çekirdekler ile birçok hücreye neden olabilir, analiz zor hale. Mifc 405 nm uyarma lazer veya DRAQ5 ile donatılmış ise Hoechst DAPı gibi başka bir DNA boya ile değiştirilebilir dikkat etmek de önemlidir MIFC 488 nm ve/veya 642nm uyarma lazer (ler) ile donatılmıştır. Nükleer leke değiştirirken, gerekli/istenen lazer gücü için uygun konsantrasyon bulmak için leke titrat için önemlidir.
MıC 'de veri topluyorsanız, gradyan RMS özellikleri için en uygun bölge sınırlarını belirlemek önemlidir. Bu protokolde sunulan sınırlar, MIFC aletleri arasındaki bazı hafif farklılıklar nedeniyle ayarlama gerektirebilir. Bu özelliğin veri toplama sırasında uygulanması, son derece odaklanmış görüntülerin yakalanmasını sağlamak için esastır. Veri dosyaları birçok bulanık veya odaksız görüntüler içeriyorsa, analiz yazılımındaki maskeleme algoritmaları yanlış pozitif eserler yüksek sayıda MN olarak puan önde gelen bulanık alanlarda boyama eserler hatalı vurgulamak olasıdır. Burada açıklanan görüntü işleme teknikleri zor olabilir rağmen, bir analiz şablonu MIFC yazılım geliştirilmiştir kez, toplu işlem veri dosyalarının otomatik olarak analiz edilmesini sağlar, kullanıcı müdahalesini ortadan kaldırmak ve bu nedenle, golcü Önyargı. Ayrıca, TK6 hücre dışındaki bir hücre çizgisi tahlil işlemini gerçekleştirmek için kullanılırsa, hücrelerin morfolojik özellikleri (örn. boyut) TK6 hücrelerden farklı olacak şekilde maskeler ve bölge sınırlarını değiştirmek gerekli olacaktır.
Burada sunulan sonuçlar (Şekil 5) Mitomycin C ve colchicine ÇEŞITLI dozlarda TK6 hücreleri AÇıĞA zaman MN indüksiyon istatistiksel olarak önemli artışları gösterir. Her iki kimyasallarda birkaç doz için solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışlar gözlenmiştir. Buna ek olarak, hiçbir doz mannitol üzerinde bir sitotoksisite indüklenen 30%, ne de MN frekansında istatistiksel olarak önemli bir artış zaman solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında, beklendiği gibi. In vitro MN tahlil gerçekleştirmek için MIFC kullanarak bu yazıda açıklanan protokol hem olumlu hem de negatif kontrol kimyasalları beklenen sonuçlar verir. Hem çözücü kontrolleri hem de negatif kontrol kimyasalları kullanarak, hem MN frekansının hem de sitokinez bloğu proliferasyon Indeksi (CBPı) temel değerleri geliştirmek için çok sayıda deney gerçekleştirmek çok önemlidir. Genotoksisite için, MN frekansında istatistiksel olarak önemli artış, kullanılan hücre tipi için tanınmış olması gereken temel MN frekanslarına kıyasla belirlenir. Ayrıca tüm sitotoksisite hesaplamaları, kontrol örneklerinin CBPı üzerine dayanır ve bu nedenle, MONO, BNCs ve POLY hücrelerinin temel oranları iyi kontroller nicelik olmalıdır.
Birkaç sınırlamalar ve mn tahlil bağlamında mifc kullanmanın avantajları önceki çalışma açıklanan29,32. Ana sınırlamalar, mikroskopiye kıyasla düşük MN frekanslarını ilgilendiriyor, bu da analiz yazılımında Puanlama ölçütlerini ve MIFC alanının sınırlı derinliğini uygularken muhtemelen hem esnekliğin eksikliği sonucu oluşur. İyi konturlu maskeler doğru ana çekirdekler ama (veya çok yakın) ana çekirdekleri BNC maskesi içinde yakalanan olabilir dokunmadan MN tanımlamak için oluşturulabilir. Ayrıca, küçük eserler Puanlama önlemek için MN maskesi alan parametresi alt sınırı nedeniyle MıC kullanırken oldukça kolay mikroskobik kullanarak puan olabilir çok küçük MN muhtemelen yanlış cevapsız. Görüntü tabanlı veri analizinde mevcut zorluklara ek olarak, tasarım nedeniyle, MIFC üç boyutlu hücresel nesnelerin iki boyutlu projeksiyon görüntüleri alır. Bu muhtemelen bazı MN odak farklı bir derinlikte yakalanması neden iki ana MN, onları çok loş ve un-scorable maskeleme kullanarak görünmesini yapma. Dahası, MN küçük bir kısmı iki ana çekirdekleri birinin arkasında ikamet edebilir, onları imkansız görselleştirmek ve puan yapma. Bu nedenle, bu zorluklar göz önüne alındığında, düşük dozlarda MN frekansında önemli artışları yorumlarken dikkat kullanılmalıdır.
Bu eksiklikleri rağmen, MıC yöntemi burada açıklanan diğer teknikler üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor. Fenech ve ark. önerilen kriterler ve talimatlar MN için otomatik sistem ve metodolojileri geliştirirken dikkate alınmalıdır36. Bunlar, ancak, ana çekirdekler ve Sitoplazmanın doğrudan görselleştirme, kimyasal veya Ajan test edilen çeşitli dozlarda MN sıklığı belirlenmesi ve morfoloji Nice ve yeteneği tüm konumunu belirlemek için sınırlı değildir çekirdekleri ve MN, Sitoplazmanın içinde olduklarından emin olmak için. Bu yazıda MıC yöntemi in vitro MN tahlil karşılayan (veya karşılamak için potansiyel sahip) bu kriterleri gerçekleştirmek için geliştirilen gösterir. Özellikle, Çekirdekler ve MN görüntüleri floresan lazerler tarafından yakalanabilir, ancak sitoplazmik görüntüler BF LED 'i kullanılarak elde edilebilir. Normal nükleer morfolojiye sahip hücrelerin görüntüleri, gelişmiş maskeler ve Özellikler kombinasyonu kullanılarak düzensiz morfolojiye sahip bu hücrelerden otomatik olarak ayırt edilebilir. Colchicine ve Mitomycin C (Şekil 5) için sunulan sonuçlar, her iki genotoksisite ve sitotoksisite, solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında çeşitli dozlarda değerlendirilebilir ve istatistiksel olarak önemli MN frekanslarının nerede gözlemlendiğini gösterir Beklenen. Ayrıca, OECD test Kılavuzu 487, sitotoksisite9' ı belirlemek için test konsantrasyonu başına en az 500 hücre ile birlikte genotoksisite belirlemek için MN varlığını değerlendirmek için test konsantrasyonu başına 2.000 bncs Puanlama önerir; Bu manuel microkopi kullanarak 1 h üzerinde alabilir. Protokol ve bu yazıda sonuçları yaklaşık 6.000 BNCs, 16.000 MONO hücreler ve 800 POLY hücrelerin ortalama yakalanan ve yaklaşık 20 dakika içinde test konsantrasyonu başına puan olduğunu göstermektedir. Veri edinme hızlı oranı ve aday hücrelerin yüksek sayıda böyle kısa bir zamanda attı In vitro MN tahlil gerçekleştirmek için MIFC istihdam başka önemli bir avantajı vurgulamak.
Bu yazıda sunulan sonuçlar teşvik ederken, onlar erken bir kavram kanıtı yönteminin temsilcisidir. Bu çalışma, daha kapsamlı bir araştırma tarafından takip edilmelidir daha geniş, daha çeşitli kimyasal set birden fazla sınıf ve mekanizmalar genotoksisite ve sitotoksisite bu gibi Kirkland ve ark tarafından önerilen gibi kapsar.37 bu tür çalışmalar zaman alıcı ve emek yoğun, ve bu makalenin kapsamı dışında düşmek ancak, bu büyük ölçekli çalışmalar güvenilir zayıf genotoksisik ajanlar tanımlamak için yöntemin yeteneği içine değerli fikir verecektir. Burada sunulan metodoloji henüz daha büyük bir doz aralığında daha hızlı ve verimli tarama sağlayacak bir mikrowell biçimine, minyatürlenmiş olmamıştır. Böyle, mevcut formunda, MIFC tabanlı in vitro MN tahlil burada sunulan en iyi laboratuvar uygulamaları içine emek yoğun takip çalışmaları veya araştırma için uygun olabilir. Ancak, yöntem en iyi duruma getirilmeye devam edecek ve doğrulanır ve hücre oranını artıran aneugen pozlama gibi morfoloji ile ilgili kimyasal spesifik olayların saptanmasında artan esnekliğe izin verme potansiyeline sahiptir hala yanık38olan dairesel olmayan çekirdekler. Son olarak, mifc yöntemi, MN indüksiyon mekanizmasının daha kapsamlı bir görünümünü sağlamak için MN tahlil (örneğin kinetochore boyama) içine ek biyolojik tanıtmak için bir fırsat sunar.

İn vitro mikronükleus (MN) assay, çeşitli alanlara maruz kalan bireyler arasında insan biomonitoring gibi kimyasal ve ilaç geliştirme gibi çeşitli alanlarda bir tarama aracı olarak sitotoksisite ve genotoksisitesi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir testtir. çevre, mesleki veya yaşam tarzı faktörler1,2,3. MN, iki ana kız çekirdeğinden birine dahil olmayan hücre bölünmesi sırasında oluşturulan kromozom parçaları veya tüm kromozomlar oluşur. Telophase takipte, bu kromozomal malzeme, ana çekirdeklerden iki ayrı olan Sitoplazmanın içindeki bir birey, yuvarlak bir vücuda dönüşür2. Bu nedenle, MN DNA hasarının temsilcisidir ve genotoksisite testi4' te bir uç nokta olarak yıllardır kullanılmıştır. MN ölçmek için en uygun yöntem sitokinesis-Block Mikronukleus (cbmn) tahlil olduğunu. CBMN tahlil kullanarak, binükleated hücrelerde MN sıklığı (BNCs) numunenin içine Sitalasin B (CYT-B) ekleyerek puan olabilir. CYT-B nükleer bölünme sağlar ancak hücresel bölünmesini önler ve böylece, sadece bir kez5bölünmüş bncs için MN Puanlama kısıtlar.
Hem microskopi hem de Akış sitometrisi kullanarak protokoller geliştirilmiştir ve doğrulanmıştır ve rutin olarak in vitro MN tahlil6,7,8,9,10, gerçekleştirmek için kullanılır 11,12,13,14. Mikroskopide, MN 'in meşru olduğunu ancak zaman alıcı ve Puanlayıcılar15arasında değişkenliğe eğilimli olduğunu görsel olarak onaylayabilmesini sağlar. Bu adrese, otomatik mikroskopi yöntemleri slaytlar taramak ve çekirdekler ve mn16,17,18,19görüntüleri yakalamak için geliştirilmiştir, ancak sitoplazma görselleştirilebilir, yapma bir MN gerçekten belirli bir hücre ile ilişkili olup olmadığını belirlemek zor. Ayrıca, bu yöntemlerin CYT-B9kullanırken sitotoksisite hesaplanması için gerekli olan POLINÜKLEATED (Poly) hücreleri (Tri ve quadranucleated hücreler dahil) tespit zorlukları vardır. Akış cytometri yöntemleri MN tahlil gerçekleştirmek için geliştirilen floresans yanı sıra ileri ve yan Scatter yoğunlukları her iki çekirdekler ve mn aşağıdaki hücre dan kurtarılmış olan nüfus belirlemek için uygulanan lizis20,21 ,22. Bu, verilerin birkaç dakika içinde birkaç bin hücreden elde edilmesini sağlar ve otomatik analiz23' e izin verir; Ancak, hücreleri görselleştirmek için yetersizlik puan olayların hakiki olduğunu onaylamak mümkün kılar. Ayrıca, hücre membranı parçalanması CYT-B kullanımını inhibe yanı sıra kromozom agrega veya apoptotik organları gibi diğer enkaz içeren bir süspansiyon oluşturma ve bu MN24ayırt etmek için bir yolu yoktur.
Bu sınırlamalar ışığında, multispectral Imaging Flow cytometry (MIFC), mikroskopinin yüksek çözünürlüklü floresan görüntülerini konvansiyonel akış sitometri istatistiksel sağlamlık ve hızı ile birleştiren bu yana MN tahlil gerçekleştirmek için ideal bir sistemdir. Mifc 'de, tüm hücreler bir akışkanlar sistemine getirilmiştir ve daha sonra hidrodinamik olarak bir akış hücresi küvetinin merkezine odaklanmıştır. Tüm hücrelerin ortogonal aydınlatma bir aydınlık alan (BF) ışık yayan diyot (LED), bir yan Scatter lazer ve (en azından) bir floresan lazer kullanımı ile gerçekleştirilir. Floresan fotonlar üç (20X, 40X veya 60x) yüksek sayısal diyafram objektif lensler biri tarafından yakalanan ve daha sonra bir spektral ayrışma elemanı geçer. Fotonlar daha sonra akış hücresinden geçerek tüm hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera üzerine odaklanmıştır. Bulanıklaştırma veya streaking önlemek için, CCD zaman gecikmesi entegrasyonu (TDı) modunda, piksel içeriği satırdan hücreye akış hücre hızı ile eşzamanlı CCD aşağı satır aktararak izler çalışır. Piksel bilgileri daha sonra son piksel satırından toplanır. Spektral ayrıştırma ile birlikte TDı görüntüleme 12 görüntü (2 BF, 10 floresan) akış hücresinden geçen tüm hücrelerden aynı anda yakalanması için izin verir. Tüm yakalanan görüntüler örnek özgü veri dosyalarında saklanır, izin çözümleme MıC veri analizi yazılımı kullanarak herhangi bir zamanda gerçekleştirilecek. Son olarak, veri dosyaları tüm iki değişkenli grafiklerde hücresel görüntüler ve noktalar arasındaki bağlantıyı korur. Bu, geleneksel bir iki değişkenli arsa üzerinde herhangi bir nokta vurgulanabilir ve karşılık gelen BF ve floresan görüntüleri25görünecektir anlamına gelir.
Son zamanlarda, mifc tabanlı yöntemler her iki trik radyasyon biodosimetri için MN tahlil gerçekleştirmek için geliştirilmiştir26,27,28,29,30,31 ve genetik Toksikoloji32,33 test. Bu çalışma, ana çekirdeklerin, MN ve Sitoplazmanın hücresel görüntülerinin diğer yöntemlerden26' dan daha yüksek verim ile yansımalı olduğunu göstermiştir. MONO hücreler, BNCs (MN ile ve olmadan) ve POLI hücreler de dahil olmak üzere analiz için gerekli tüm hücre türleri, otomatik olarak MIFC veri analiz yazılımında tanımlanabilir ve Fenech ve ark. tarafından geliştirilen Puanlama kriterlerinin uygulanması ile gerçekleştirilir. çeşitli matematiksel algoritmalar kullanımı6,34. Biyodozimetri sonuçları, doz tepkisi kalibrasyonu eğrilerinin, BNC29başına MN oranını ölçerek literatürdeki diğer otomatik yöntemlerden elde ettikleri boyutta benzer olduğunu göstermiştir. Ayrıca, toksikoloji son çalışmalar MONO hücreler, BNCs (ve MN olmadan) ve POLY hücreler görüntüleri otomatik olarak, tespit, sınıflandırılmış ve MIFC kullanılarak numaralandırılmış olabilir göstermiştir. Protokol ve veri analizi çeşitli clastogens ve aneugens32TK6 hücreleri açığa sonra sitotoksisite ve genotoksisite hesaplanması sağladı.
Bu yazıda sunulan protokol MıC kullanarak in vitro MN tahlil gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada kullanılan örnek işleme tekniği, tek bir örnek işlemek için 2 h 'den az gerektirir ve diğer yöntemlere kıyasla gerçekleştirmek oldukça kolaydır. MıC analiz yazılımında veri analizi karmaşıktır, ancak analiz şablonunun oluşturulması bu yazıda özetlenen adımları izleyerek birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, şablon oluşturulduktan sonra, herhangi bir başka iş olmadan tüm toplanan verilere otomatik olarak uygulanabilir. Protokol, TK6 hücrelerini clastogens ve aneugens 'a göstermek için gereken tüm adımları özetliyor, nasıl kültür, işlem ve leke hücrelerini açıklar ve MIFC kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntülerin nasıl elde edildiğini gösterir. Ayrıca, bu yazıda otomatik olarak tanımlamak ve teklı hücreler, BNCs ve POLY hücreleri hem sitotoksisite ve genotoksisite hesaplamak amacıyla puan için MIFC yazılım verileri analiz için geçerli en iyi uygulamaları göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1012px;" width="1012">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Colchicine</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>64-86-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Corning bottle-top vacuum filter&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td style="width:299px;">0.22 um filter, 500 mL bottle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Cytochalasin B</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>14930-96-2</td>
			<td style="width:299px;">5 mg bottle</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++MG++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="240">
			<td height="240" style="height:240px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>H3570</td>
			<td style="width:299px;">10 mg/mL solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mannitol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="200">
			<td height="200" style="height:200px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Mitomycin C</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>50-07-7</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">NEAA Mixture 100X</td>
			<td>Lonza BioWhittaker</td>
			<td>13-114E</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RNase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>9001-99-4</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sterile water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T25 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">TK6 cells</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>95111735</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry

İn vitro Mikronukleus (MN) tahlil genellikle sitotoksisite ve genotoksisite değerlendirmek için kullanılır ama manuel mikroskobik ile tahlil Puanlama zahmetli ve SCORERS arasındaki değişkenlik nedeniyle sonuçlarında belirsizlik tanıttı. Bu sorunu gidermek için, otomatik slayt tarama mikroskopinin yanı sıra geleneksel akış sitometri yöntemleri, skorer önyargı kaldırılması ve verimi artırmak için bir girişim tanıtıldı. Ancak, bu yöntemlerin hücre sitoplazması ve akış sitometri ile görsel MN doğrulama veya görüntü veri depolama eksikliği görselleştirmek için yetersizlik gibi kendi içsel sınırlamaları vardır. Multispectral Imaging Flow cytometry (MIFC) bu sınırlamaların üstesinden gelme potansiyeline sahiptir. MIFC, mikroskopinin yüksek çözünürlüklü floresan görüntülerini geleneksel Akış sitometrisi ile istatistiksel sağlamlık ve hız ile birleştirir. Buna ek olarak, tüm toplanan görüntüler doza özgü dosyalarda depolanabilir. Bu yazıda MIFC üzerinde MN tahlil tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır. İnsan lenfoblastoid TK6 hücreler (75 mM KCl),% 4 formalin ile sabit ve nükleer içerik Hoechst 33342 ile lekelenmiş bir hipotonik çözüm kullanılarak büyütüldü. Tüm örnekler MıC üzerinde süspansiyon, tahlil için gerekli tüm önemli olayların yüksek çözünürlüklü görüntülerin satın alma (örneğin, ve MN olmadan mononükleated ve polinükleated hücreler gibi binükleated hücreler) çalıştırıldı. Görüntüler otomatik olarak tanımlanan, kategorize ve MIFC veri analizi yazılımı numaralandırılmış, hem sitotoksisite ve genotoksisite otomatik Puanlama için izin. Sonuç olarak MıC in vitro MN tahlil gerçekleştirmek için kullanarak MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışların sitotoksisite birkaç farklı düzeylerde tespit edilecek sağlar, solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında TK6 hücrelerin maruz kalma aşağıdaki Mitomisin C ve colchicine, mannitol 'a maruz kaldıktan sonra MN frekansında önemli bir artış görülmez.

Bu yazıda özetlenen analiz yöntemi, genotoksisite hesaplamak için ve MN olmadan, BNCs otomatik kimlik ve Puanlama için izin verir. Buna ek olarak, MONO ve POLY hücreler de otomatik olarak tanımlanır ve sitotoksisite hesaplamak için attı. Yayımlanan puanlama kriterleri6,34 bu olayların mifc veri analiz yazılımında uygulanmakta olduğu zaman buna uymak zorundadır. Burada sunulan sonuçlar, artan sitotoksisite ile MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışların, insan lenfoblastoid TK6 hücrelerinin iyi bilinen MN İndükleme kimyasallara (Mitomycin C ve colchicine) maruz kalmasıyla algılandığını göstermektedir. Test ek kimyasallar için benzer sonuçlar ayrı bir yayın32gösterildi. Buna ek olarak, mannitol kullanımı sonucu olmayan-MN inducing kimyasallar da doğru burada özetlenen MIFC yöntemi kullanılarak tespit edilebilir gösterir. Tüm maskeler, Özellikler ve bölge sınırları oluşturmak için protokolde açıklanan parametreler büyük olasılıkla farklı hücre türleri (örneğin Çince hamster hücreleri) tahlil gerçekleştirmek için kullanıldığında ayarlanması gerekecektir.
Şekil 3 , bncs (Şekil 3A-3D) tanımlamak için seçilen dört paneli gösterir. Burada gösterilen iki çekirdekler (şekil3A) ve benzer döngü (Şekil 3B), benzer Alanlar ve yoğunluklarla bncs seçimi sağlayan iki değişkenli çizimleri ile hücrelerin seçimi sağlayan bir histogram olduğunu (şekil3C ) ve bncs iyi ayrılmış, çakışan olmayan çekirdekler (Şekil 3D) Puanlama ölçütünü6,34başına olarak. Şekil 3 E BF ve Hoechst görüntüleri yanı sıra BNC ve mn maskeleri tek veya bırden fazla MN Ile bncs tespit edilebilir ve numaralandırılmış gösteren gösterir. Bu, genotoksisite son BNC nüfusunun mikronükleated BNCs oranını belirleyerek hesaplanmasına olanak sağlar. Şekil 4 mono, TRI ve Quad hücrelerini tanımlamak için Poly maskesini kullanarak spot sayım özelliğinin uygulamasını gösterir. TRI ve QUAD hücrelerinin sayısı sonra POLY hücrelerinin son sayısını elde etmek için toplanır (Tablo 1). Bu, sitotoksisite protokolde gösterilen formül kullanılarak hesaplanmasını sağlar. Bu nedenle, denemede her doz noktası genotoksisite ve sitotoksisite parametreleri ile değerlendirilebilir.
Şekil 5 Aneugen colchicine için genotoksisite ve sitotoksisite değerlerini gösterir, clastogen mitomisin C ve negatif bir kontrol Için, mannitol. Colchicine için (Şekil 5A) 0,02 ile 0,05 μg/ml dozlar, MN frekansında istatistiksel olarak anlamlı artışlar üretilerek,% 1,28 ile% 2,44 arasında değişen Solvent kontrolü (Tablo 1). Mitomisin C (Şekil 5B) durumunda, 0,4 ve 0,5 μg/ml 'lik iki üst doz, solvent kontrolleri ile KARŞıLAŞTıRıLDıĞıNDA istatistiksel olarak anlamlı MN frekansları üretti. Bu MN frekansları 0,4 μg/mL 'de% 0,93, 0,5 μg/mL 'de% 1,02 (Tablo 2) idi. Son olarak, mannitol için (Şekil 5C), hiçbir doz test% 30 üzerinde bir sitotoksisite neden, ne de onlar beklendiği gibi, solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında MN frekansında önemli artışlar üretti (Tablo 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig1.jpg"> Şekil 1 : Mifc enstrüman ayarları. Protokolün 7. adımda açıklandığı gibi MIFC ayarlarının bir ekran görüntüsü. (A) 405 nm lazer gücünü 10 MW 'a ayarlama. (B) BF kanallarını 1 ve 9 olarak ayarlama. (C) 60x büyütme objektif objektifin seçilmesi. (D) en yüksek çözünürlükte görüntü üreten en yavaş akış hızını seçme. (E) 20.000 için toplanan olayların sayısını belirtme. (F) yükleme düğmesini tıklatarak örnek yükleme işlemine başlayabilirsiniz. (G) görüntüleri almaya başlamak için edinme düğmesine tıklamak. (H) herhangi bir kullanılmayan örnek döndürmek için Return düğmesini tıklatın. (I) tek hücrelerin seçilmesi Için BF alanı 'NA karşı KF en boy oranı 'nın dağılıdır. (J) odaklanmış hücrelerin seçilmesi Için Hoechst gradyan RMS 'Nin BF degrade RMS 'ye karşı bir çizim. (K) DNA pozitif hücrelerin seçilmesi Için Hoechst yoğunluğu histogram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig2.jpg"> Şekil 2 : Analiz yazılımı gating stratejisi. Protokol Bölüm 9 ' da açıklanan gating stratejisinin bir ekran görüntüsü. Bölgeler, binükleated hücrelerin (kırmızı kutu), mikronüklei (sarı kutu) ve mono-ve polinükleated hücreler (mavi kutu) tanımlaması için sıralı olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig3.jpg"> Şekil 3 : MN ile ve olmadan BNCs tanımlaması ve skorlama. (A) iki farklı çekirdekleri olan hücrelerin seçimi. (B) en boy oranı yoğunluğu özelliğinin kullanımı ile iki yüksek dairesel çekirdekleri olan binükleated hücrelerin (bncs) tanımlaması. (C) benzer Alanlar ve yoğunluklarla çekirdekleri olan bncs seçimi. Bu her iki çekirdeklerin alan oranı ve her iki çekirdeklerin en boy oranı oranını hesaplamak tarafından gerçekleştirilir. (D) iki iyi ayrılmış çekirdekleri olan bncs tanımlamak Için şekil oranı ve en boy oranı özellikleri kullanımı. (E) tek veya birden fazla MN ile bncs tespit ve numaralandırılabilir gösteren Mikronukleus (MN) maskesi kullanarak spot sayım özelliği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig4.jpg"> Şekil 4 : Mono ve Poly hücrelerinin tanımlanması ve Puanlama. Mono, Tri ve quadranucleated hücreleri tanımlamak ve numaralandırmak için spot sayımı özelliğinin kullanımı. Bileşen maskesi 1, mononükleated hücrelerin tanımlanması (üst görüntü) sağlar. 1 ile 3 arasındaki bileşen maskeleri, trinükleated hücrelerin (orta görüntü) tanımlanması sağlar. 1 ile 4 arasındaki bileşen maskeleri quadranucleated hücrelerin (alt görüntü) tanımlanması sağlar. Bu rakam Rodrigues 201832güncellenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59324/59324fig5.jpg"> Şekil 5 : Sitotoksisitenin ölçülmesini. Sitotoksisite, (a) kolşisin, (B) Mitomycin C ve (a) için 3 saat pozlama ve 24 saat iyileşme sonrasında MN (açık çubuklar) yüzdesi kullanılarak nicelendirme (siyah daireler) ve genotoksisite ile cytotoksiyon ile ölçülebilir. C) mannitol. Kontrol ile karşılaştırıldığında MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışlar yıldızlar (Chi-squared test; *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001) ile belirtilir. Tüm miktarlar her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır. Bu rakam Rodrigues 201832güncellenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/59324fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59324/59324table1.jpg"> Tablo 1: Sitotoksisite (mono-, bi-ve polinükleated hücrelerin sayısı) ve genotoksisite (mikronükleated binükleated hücrelerin sayısı ve yüzdesi) colchicine için hesaplamak için gerekli parametreler. Tüm hesaplanan miktarlarda her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/59324/59324table2.jpg"> Tablo 2: To parametreler sitotoksisite hesaplamak için gerekli (mono-, iki-ve polinükleated hücrelerin sayısı) ve genotoksisite (sayı ve mikronükleated binükleated hücrelerin yüzdesi) mitomisin C için. Tüm hesaplanan miktarlarda her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/59324/59324table3.jpg"> Tablo 3: Mannitol için sitotoksisite (mono-, iki ve polinükleated hücrelerin sayısı) ve genotoksisite (mikronükleated binükleated hücrelerin sayısı ve yüzdesi) hesaplamak için gerekli parametreler. Tüm hesaplanan miktarlarda her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır.
Ek 1: tam protokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_1-Full_Protocol.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek 2: maske listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59324/Supplement_2-Mask_List.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

İn vitro mikronükleus tahlil genotoksisite ve sitotoksisite değerlendirmek için iyi kurulan bir yöntemdir ama manuel mikroskobik kullanarak tahlil Puanlama zahmetli ve subjektif ve inter-scorer değişkenlik muzdariptir. Bu yazıda, multispektral görüntüleme akışı sitometrisi kullanılarak testin tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Görüntü akışı tabanlı mikronükleus tsay, düşük iş akışı ve olayların görsel teyidi nin olmaması da dahil olmak üzere otomatik mikroskopi ve konvansiyonel akış sitometrisi gibi yöntemlerin çeşitli sınırlamalarının üstesinden gelebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, genotoksisiteyi ve sitotoksisiteyi belirlemek için gerekli tüm olayların mikroskop slaytları oluşturmaya gerek kalmadan otomatik olarak görüntülenebilen, tanımlanabilen ve puanlandırılabilmesidir. Clastogens ve / veya aneugens hücre maruziyeti için, bir T25 şişesi ve kontrol kültürleri için su bir mililitre uygun hücre kültürü ortamının dokuz mililitre deneysel hücrelerin beşinci yedi ila sekiz kez 10 ilgi kimyasal bir milimetre ekleyin.Şişeleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle üç saat boyunca kuluçkaya yatırın ve hücreleri şişe başına 15 mililitrelik polipropilen tüpe aktarın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve yeni T25 kültür şişeleri tohumlama için tüp başına taze kültür orta 10 mililitre pelet resuspend. Sonra mililitre başına üç mikrogram nihai bir konsantrasyon elde etmek için her şişe için sitokasin B stok konsantrasyonu 150 mikrolitre ekleyin.Şişeleri, Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü yönergelerinin önerdiği gibi, 1,5 ila iki katına eşit bir iyileşme süresi için kuvöze iade edin. İyileşme süresinin sonunda, kültürleri santrifüj için 15 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın ve peletleri 75 milimolar potasyum klorür beş mililitrede yeniden askıya alın. Üç kez ters çevrilerek hafifçe karıştırın ve numuneleri yedi dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, her numuneye yüzde dört formalin iki mililitre ekleyin ve üç ters ile hafifçe karıştırın. Hücreleri santrifüj le toplamadan önce 10 dakika boyunca numuneleri dört dereceye geri verin. peletleri 100 mikrolitre taze %4 formalin ile 20 dakika boyunca yeniden askıya alın.Kuluçka sonunda, sabit hücreleri beş mililitre yıkama tamponu içinde merkezlendirme ile tüp başına yıkama tamponu yıkayın ve tüp başına yıkama tampon 100 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra, bir hemositometre saymak için bireysel 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler için örnekleri aktarın. Mililitre Başına 100 mikrogram beş mikrolitre Ekleyin Hoechst 33342 başına 1.0 x 10 mililitre başına altı hücre ve 10 mikrolitre mililitre Başına 500 mikrolitre mililitre RNase başına 100 mikrolitre tüp başına örnek başına.37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit 30 dakikalık kuluçka sonra, bir mikrocentrifuge örnekleri santrifüj ve her tüp ten supernatant tüm ama 30 mikrolitre çıkarın. Daha sonra kabarcık oluşumunu neden değil dikkat, dikkatle örnekleri askıya alın. Kabarcıklar yeniden süspansiyon üzerine görünürse, yavaşça onları kaldırmak için tüp flick.Örnekleri multispektral görüntüleme akış sitometrisi ile çalıştırmak için, önce 405 nanometre lazeri açın ve lazer gücünü 10 miliwatt'a ayarlayın. Yan dağılım lazeri de dahil olmak üzere diğer tüm lazerleri devre dışı bırak ve brightfield'ı bir ve dokuz numaralı kanallara ayarlayın. Büyütme kaydırıcısının 60x olarak ayarladığını, yüksek duyarlılık modunun seçildiğini ve görüntü galerisinde yalnızca bir, yedi ve dokuz kanalda görüntülenin.Dağılım çizimini tıklatın ve X eksenindeki tüm popülasyon ve alan M01'i seçin. Y ekseninde en boy oranı M01'i seçin ve tek hücrelerin etrafında bir bölge çizmek için kare bölgeye tıklayın. Bu bölgeye tek hücreleri adlandırın ve bölgeleri seçmek için çizime sağ tıklayın.Tek hücre bölgesini vurgulayın ve X koordinatlarını 100 ve 900, Y koordinatlarını 0,75 ve bir olarak değiştirin. Edinme parametrelerini ayarlayın ve dosya adını ve hedef klasörünü belirtin. Daha sonra olay sayısını 20,000'e değiştirin, DNA pozitif popülasyonunu seçin ve ilk örneği çalıştırın.IDEAS'ta bir veri dosyasını açmak için, Dosya Yı Aç Sihirbazı'nı başlatmak için Çözümle Başla'yı tıklatın ve istediğiniz ham resim dosyasını seçmek için göz atın. Ardından İleri'yi tıklatın ve resim galerisindeki binucleated hücreye göz atın. Maske oluşturmak için, ilgi alanı görüntüsünü seçmek ve analiz sekmesini açmak için tıklatın.LevelSet'i seçmek için Maskeler, Yeni ve İşlev'i tıklatın. Maske altında, M07 ve Orta Düzey Maske'yi seçin ve kontur ayrıntıları ölçeğini üçe ayarlayın. Ardından Iki kez Tamam'ı tıklatın.Binucleated hücre özelliklerini tespit etmek için Çözümsekmesini açın ve Özellikler ve Yeni'yi seçin. Özellik Türü için Spot Sayısı'nı seçin. Maske için, son binucleated maskeyi seçin ve bağlantı özelliğini dörde ayarlayın, ardından adı Spot Count BNC olarak değiştirin ve özellik değerlerini hesaplamak için Tamam'ı tıklatın ve kapatın.Bir nokta sayısı binucleated hücre histogram için, histogram tıklayın ve ana popülasyon olarak non-apoptopic seçin. X ekseni özelliği için, Spot Sayısı BNC'yi seçin ve Tamam ve doğrusal bölgeyi tıklatın, ardından Bim Two boyunca bir bölge çizin ve bu bölgeye 2N adını verin. Mikronükleus maskesi oluşturmak için, görüntü galerisinden mikronükleus içeren binucleated hücre seçin ve Analiz sekmesinde maskeleri açın.Nokta tanımlama maskesi oluşturmak için yeni ve işlev'i tıklatın ve Spot'u seçin. Parlak radyo düğmesinin seçildiğini onaylayın ve maske altında M07'yi seçin. Spot'u Hücre Arka Planı Oranına ve Minimum Yarıçap'ı ikiye ayarlayın ve Maksimum Yarıçapı altıya ayarlayın.Maskeyi soldaki listeye eklemek için Tamam ve Tamam'ı tıklatın, sonra başka bir maske oluşturmak için Yeni'yi tıklatın. Spot M07 Kanal yedi Parlak iki altı iki maske tıklayın ve maske tanımına eklemek için aşağı ok tıklayın ve Ve ve değil işleçleri tıklatın. Maske tanımına genişlemiş aralık maskesi eklemek için aşağı ok'u tıklatın.Çok çekirdekli bir popülasyon maskesi oluşturmak için Çözümleme, Maskeler, Yeni ve İşlev'i tıklatın. İşlev altında Aralık'ı seçin. Maske'nin altında, Havza Dilate Set M07 Channel07, Orta, üç, iki'yi seçin ve görüntüyü Kanal 07'ye görüntülemek üzere ayarlayın.Minimum ve maksimum alan değerlerini sırasıyla 135 ve 5000 olarak ayarlayın ve minimum ve maksimum en boy oranı değerlerini sırasıyla 0,4 ve bir olarak ayarlayın. Tamam'ı tıklatın ve ad alanında, METNI POLY maskesini okumak için değiştirin, ardından Tamam ve Kapat'ı tıklatın. Özel bir görünüm oluşturmak için Resim Galerisi Özellikleri düğmesini tıklatın, Bileşikler sekmesini açın ve Yeni'yi tıklatın.Ad altında, Kanal 01'den Kanal 07'ye girin. Resim Ekle'yi tıklatın ve Resim'in altında Kanal 01'i seçin ve yüzdeyi 100 olarak ayarlayın. Yeniden Resim Ekle'yi tıklatın ve görüntünün altında Kanal 07'yi seçin ve yüzdeyi 100 olarak ayarlayın.Görünüm sekmesini tıklatın, Yeni'yi tıklatın ve Ad'ın altında BNC ve MN maskelerini girin. Ardından Sütun Ekle'yi tıklatın ve Resim türünün altında Kanal 01'i ve Maske'nin altında Yok'u seçin. Sütun Ekle'yi tıklatın ve Resim Türü'nün altında Kanal 07'yi seçin ve Maske'nin altında Yok'u seçin.Sütun Ekle'yi tıklatın, Bileşik radyo düğmesini tıklatın ve ardından özel görünümü tamamlamak için Tamam'ı tıklatın. Görünüm aşağı çekme menüsüne tıklayın ve BNC ve MN maskeleri görünümünü tıklatın. Maskeleri gizle düğmesini tıklatın.Önemli olayları sıralamak için Raporlar sekmesini açın ve İstatistik Raporu Tanımla'yı tıklatın, ardından yeni pencerede Sütun Ekle'yi tıklatın. İstatistikler altında binucleated hücre sayıları istatistiklerini eklemek için, Sayı'yı seçin ve Seçili Popülasyon'un altında BNC popülasyonu seçin, ardından istatistiği listeye eklemek ve şablonu kaydetmek için İstatistik Ekle'yi tıklatın. Tüm istatistikler listeye eklendikten sonra Kapat'ı tıklatın, ardından Tamam'ı tıklatın ve ardından veri analizi şablonuna kaydedin.Ara gelen dosyaları toplu olarak işlemek için, Araçlar menüsü altında Toplu Veri Dosyaları'nı tıklatın ve yeni pencerede Toplu İş Ekle'yi tıklatın. Toplu iş partisine eklemek için deneme dosyalarını seçmek için Dosya Ekle'yi tıklatın ve şablon veya veri analizi dosyası seç seçeneğinin altındaki Klasörü Aç düğmesini tıklatın. Kaydedilmiş şablona göz atın ve açın.Geçerli pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Ardından, tüm dosyaların toplu işlemesini başlatmak için Toplu İş gönder'i tıklatın. Burada, binükleli hücreleri tanımlamak için seçilen dört panel gösterilmiştir.Bu bivariate plots ve histogramlar binükleated hücrelerin seçimi yanı sıra benzer dairesellik, alanlar ve yoğunlukları ile iki çekirdekleri olan ve iyi birbirinden ayrılmış bu hücrelerin belirlenmesini sağlar. Bu Brightfield ve Hoechst görüntüleri, yanı sıra binucleated hücre ve mikronükleus maskeleri, kimlik ve binucleated hücreleri ve mikronükleus numaralandırma kolaylaştırmak. Nokta sayısı özelliğinin uygulanması mononükleer, trinükleer ve kuadranükleer hücreleri tanımlamak için polinükleatlı maske kullanır.Tri ve kuadranükleer hücrelerin sayısı daha sonra sitotoksisite hesaplaması için gerekli polinükleatlı hücrelerin son sayısını elde etmek için özetlenebilir. Burada, endojen kolşisin, klastojen mitomisin C ve negatif kontrol mannitol için protokolün geçerliliğini göstermek için temsili genotoksisite ve sitotoksisite değerleri gösterilmiştir. Hücrelerin uygun bir DNA lekesi konsantrasyonu yla etiketlanması, yüksek kaliteli görüntü yakalamayı sağlamak ve tüm önemli olayların kolayca tespit edilebilmesine ve puanlanmasına izin vermek için önemlidir.Bu teknikler aynı zamanda radyasyon biyodosimetrisi için mikronükleus töz için de geçerlidir, hangi radyasyona maruz kalmış olabilir bireylerde doz tahmini sağlar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Çokspektrumlu Görüntüleme Sitometrisi ile Hücreleri yerelleştirme ve Karbon nanotüpler Bağıl Kantitasyonu

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Yeniden İnşa İnsan Kornea gibi Epitelyal (RHCE) Doku Modeli kullanılarak Göz tahriş Kimyasalların Tehlike Tanımlaması Göz tahrişi Testi (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Stres birden çok paralel-plaka akışı Chambers kullanarak yamultmak için maruz endotel hücrelerinin gen ifade Analizi

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Fotoakustik Akış Sitometri kullanarak Yumurtalık Kanseri Algılama

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

Hidrojel Tabanlı 3D Kültür Modellerini Otomatik ve StandartLaştırılmış Bir Şekilde Üretecek Açık Kaynaklı Bir Teknoloji Platformu

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...