Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af den nationale Natural Science Foundation i Kina (Grant nr. 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star-programmet (Grant No. 17QA1403000), og Science Technology Committee i Shanghai kommunal forvaltning (Grant No. 14441903002 af 15411963700).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med forsøgsprotokoller, som blev godkendt af Udvalget for dyreressourcer i Shanghai Jiao Tong University.
1. perfusion af musen aorta
<ol><li>Kort, bedøve 12-ugers gamle C57BL/6 mus med intraperitoneale injektioner af natriumpentobarbital (50 mg/kg legemsvægt). Bekræft korrekt anæstesering ved forsigtigt at klemme halen. Bemærk: Hvis der ikke observeres nogen bevægelse, er dyret tilstrækkeligt bedøvet til at starte eksperimenterne....

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

Endotelet er udsat for talrige proatherogenic faktorer, herunder lipider, inflammatoriske mediatorer, og Fluid shear stress1,11,12. Direkte observation af endotelceller in situ giver de særlige fordele til at analysere ændringer i celle morfologi, intercellulære kryds og molekyle udtryks mønstre som reaktion på skaden stimuli.
Tidligere undersøgelser har givet to forskellige en ansigt immun hist...

De tidlige ændringer i Vaskulaturen initierer primært i endotelet, som fungerer som en selektiv barriere mellem blodet og fartøjs væggen med dets intercellulære stramme supplerende komplekser1. Væsentlige beviser peger på en afgørende rolle for de mekaniske virkninger af blodgennemstrømningen i moduerende endotelfunktion2. Fluid shear stress, en friktions kraft genereret af blodgennemstrømning, differentielt former endotel celle morfologi og funktion, afhængigt af de specifikke flow paradigmer på forskellige vaskulære steder2,3. Aterosklerotiske læsioner fortrinsvis forekomme på steder af forstyrret blodgennemstrømning (d-flow), såsom fartøj curvatures, flow dividers, og gren punkter, sammenlignet med regioner af steady flow (s-flow), såsom lige segment af arterien. Derfor bør direkte observation af endotel morfologi og molekyle udtryks mønstre give vigtig indsigt i de strukturelle og funktionelle fænotyper af endotelceller under varierende flow paradigmer.
Dyrkede endotelceller kan ikke udtrykke den faktiske fænotype, som de gør in vivo delvis på grund af tab af indvirkning af Fluid shear stress, omgivende cytokiner, og celle-celle eller celle-ekstracellulære matrix interaktioner. For at hjælpe dette, kan den intakte endotelcelle enkeltlags undersøgt på tværsnit ved hjælp af klassisk immun histokemi. Men endotel enkeltlags er så tynd og skrøbelig, at det normalt ikke kan observeres tydeligt. En ansigts immun histokemi er blevet brugt til at observere den indre overflade af endotelet, men er enten kompliceret eller uregelmæssig i sine resultater, fordi endotelet er let strippet fra det underliggende væv, eller blot en del af arteriel væggen af rotter eller kaniner, Hvis vægge er tykke, er monteret4,5.
Musemodeller har betydelige fordele i forhold til andre dyr i mange henseender. Her ansætter vi en modificeret en-Face immunofluorescens teknik til at analysere endotelceller i aortabuen og thorax aorta i C57BL/6 mus. En sådan teknik er blevet almindeligt anvendt til at studere endotel Patofysiologi i forskellige flow mønstre og i udviklingen af åreforkalkning6,7,8,9,10. Denne metode giver forskerne mulighed for at observere hele overfladen af endotelet klart og at sammenligne udtryks mønstre af et givet protein i regioner under forskellige Fluid shear stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

Afvigende ændringer i endotelphenotype og morfologi anses for at være indledende hændelser i patogenesen af åreforkalkning. Direkte observation af intakt endotelet vil give værdifulde oplysninger for at forstå de cellulære og molekylære hændelser i dysfunktionelle endotelceller. Her beskriver vi en modificeret en-Face immunofluorescens farvningsteknik, som gør det muligt for forskerne at opnå klare billeder af den intakte endotelover flade og analysere molekyle udtryks mønstrene på stedet. Metoden er enkel og pålidelig til at observere hele endotel enkeltlags på forskellige steder i aorta. Denne teknik kan være et lovende redskab til at forstå Patofysiologi af åreforkalkning, især på et tidligt stadium.

En 12-ugers-gammel C57BL/6 mus blev aflives og perfekteret med normalt saltvand indeholdende 40 enheder/ml heparin og, derefter, forkølet 4% PARAFORMALDEHYD. Mus aorta blev eksponeret under et dissekere mikroskop (figur 1), dissekeret og skåret åben længderetningen (figur 2). En ansigt immunofluorescens farvning af de vaskulære endotelceller blev udført som illustreret i figur 3 og tabe...

Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Her præsenterer vi en protokol for immunofluorescens farvning for at observere endotelcellerne i musen aorta direkte. Denne teknik er nyttig, når man studerer den cellulære og molekylære fænotype af endotelceller i forskellige flow mønstre og i udviklingen af åreforkalkning.

Brug af en Face immunofluorescens farvning for at observere vaskulære endotelceller direkte

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Denne protokol hjælper folk analysere endotelcellemorfologi, og ekspressionen af molekyler i regioner, under forskellige væske forskydning stress. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en direkte vurdering af vaskulære endotelceller under forskellige væske forskydning stress. Når du udfører denne procedure, centrale trin er at bruge frisk forberedt paraformaldehyd og til at udføre en god perfusion.Begynd denne procedure med bedøvelse af en 12 uger gammel C57BL/6-mus som beskrevet i tekstprotokollen. Bekræft korrekt bedøvelse ved forsigtigt at klemme halen. Tape musens poter til en stak papirservietter, med tape.Hold huden på musen med snævler, og skær huden med en saks fra maven til toppen af brystkassen. Åbn bughulen, under brystkassen, med en skarp saks. Løft brystbenet med snævninger, og skær mellemgulvet.Derefter skæres væk brystkassen til at udsætte brysthulen. Skær vena cava lige over leveren med en saks. Tryk gennemtræg arteriel træet i fem minutter, med forkølet normal saltvand indeholder 40 enheder pr milliliter heparin, gennem venstre hjertekammer, indtil lungerne og leveren bliver bleg.Derefter gennemgås med forkølet 4% paraformaldehyd i PBS i fire minutter. Fjern alle muskler, organer og fedt, indtil aorta er udsat. Placer musen under et dissekerende mikroskop.Brug sarte kraftbefængdere og en sart saks til at eksponere aorta klart under et dissekerende mikroskop, og fjern bindevævet langs aortaen, så rent som muligt. Dissekere brystaorta fra hjertet til cøliaki stammen med et par delikate saks. Placer aorta i en seks centimeter celle kultur parabol, med PBS.Skær aorta langsgående, først langs den mindre kurve, og brug derefter mikroscissorerne til at skære de tre grene af aortabuen, herunder innominatet, venstre almindelig carotis, og den venstre subclavia arterie langs den større kurve, indtil det lige segment er opfyldt. Permeabilize aorta med 1% polyoxyethylen octyl pheny ether, i PBS i 10 minutter. Derefter blokere aorta med 10% normal gedeserum i tris-buffered saltvand indeholder 2,5% polysorbat 20 for en time ved stuetemperatur, i en 12 godt celle kultur plade.Næste inkubere aorta i blokering buffer indeholder fem gram pr milliliter kanin anti-VCAM1, og fem gram pr milliliter rotte anti-VE-Cadherin, natten over ved fire grader Celsius. Efter skylning af prøven tre gange med vaskeopløsning påføres fluorescenskonjugeret sekundære antistoffer i en time ved stuetemperatur, hvor den opbevares på et mørkt sted. Skyl yderligere tre gange i vaskeopløsningen.Kontrastain aorta med DAPI i 10 minutter, holde i et mørkt sted. Skyl derefter den farvede aorta tre gange i vaskeopløsning. Anvend aortaen på en dækselslip med lumenaloverfladen nedad, og flyt den langsomt til antifademonteringsopløsning, der tidligere er faldet på dækslet.Stræk forsigtigt aortaen for at holde prøven fladt. Inverter dækslet og læg det på glasrutsjebanen. Pas på at undgå luftbobler mellem prøven og glasset.Undersøg aorta med en laser scanning konfokal mikroskop. Analysér farveintensiteter for forskellige kanaler fra det ønskede område i billeder med Billed-Pro Plus-software. En ansigt immunfluorescens farvning billeder af vaskulære endotelceller fra musen aorta er vist.En face immunofluorescens af vaskulær celle vedhæftning protein en, og udtryk med VE-Cadherin som en endotel markør, er vist under varierende flow mønstre fra forskellige regioner af musen aorta. DAPI blev også modstained for at vise cellekernerne for bedre visualisering. Når man ser gennem Z stakke under mikroskop, endotel og glatte muskelceller kan let skelnes ved deres cellekerner morfologi.Endotelcellekernerne er ovale og større end spindelenformet, glatte muskelcellekerner. Udtryk for VCAM-1 var mere rigelige i regioner under forstyrret flow, ved mindre krumning af aorta bue, sammenlignet med regioner under støt flow, ved større krumning af aorta bue, og på thorax aorta. Her er områder med mindre krumning af en mus aorta angivet som d-flow områder, og jo større krumning og thorax.Med den rigtige ændring, kan denne teknik også anvendes til analyse af vaskulær permeabilitet, og placeringen af makromolekyler i endotelcelle intima.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolering og Differentiering af Stromale vaskulære celler til Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISH Brug Direkte mærkede prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirekte Immunofluorescens på frosne snit af Mouse brystkirtel

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection af nitrogenoxid og Superoxide i Endotel Layer af intakte arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En simpel Bioassay for Vurdering af Vascular endotelvækstfaktorer

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En ansigtsbehandling af museblodfartøjer

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...