Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
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Cette étude a été soutenue par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81670451, 81770430), le Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) et le Science Technology Committee of the Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles expérimentaux approuvés par le Comité des ressources animales de l'Université Jiao Tong de Shanghai.
1. Perfusion de l'aorte de souris
<ol><li>En bref, anesthésier les souris C57BL/6 de 12 semaines avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital de sodium (50 mg/kg de poids corporel). Confirmer l'anesthésie appropriée en pinçant doucement la queue. REMARQUE : Si aucun mouvement n'est ob...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

L'endothélium est exposé à de nombreux facteurs proathérogènes, y compris les lipides, les médiateurs inflammatoires, et le stress de cisaillement des fluides1,11,12. L'observation directe des cellules endothéliales in situ fournit les avantages spéciaux pour analyser des changements dans la morphologie de cellules, les jonctions intercellulaires, et les modèles d'expression de molécule en réponse aux stimulus de bles...

Les premiers changements dans la vascularisation commencent principalement dans l'endothélium, qui fonctionne comme une barrière sélective entre le sang et la paroi du vaisseau avec sescomplexesintercellulaires de jonction serré 1 . Des preuves substantielles indiquent un rôle critique pour les effets mécaniques du flux sanguin dans la modulation de la fonction endothéliale2. Le stress de cisaillement de fluide, une force de frottement produite par le flux sanguin, forme différentiellement la morphologie et la fonction des cellules endothéliales, selon les paradigmes spécifiques de flux à différents emplacements vasculaires2,3. Les lésions athérosclérotiques se produisent préférentiellement aux emplacements du flux sanguin perturbé (d-flow), tels que les courbures de navire, les diviseurs d'écoulement, et les points de branche, comparés aux régions de flux régulier (s-flux), telles que le segment droit de l'artère. Par conséquent, l'observation directe de la morphologie endothéliale et des modèles d'expression de molécule devrait fournir des perspicacités importantes dans les phénotypes structurels et fonctionnels des cellules endothéliales sous des paradigmes variables de flux.
Les cellules endothéliales cultivées peuvent ne pas exprimer le phénotype réel comme elles le font in vivo en partie en raison de la perte de l'impact du stress de cisaillement de fluide, des cytokines environnantes, et des interactions de cellules-cellules-extracellulaires de matrice. Pour faciliter ceci, la monocouche endothéliale intacte de cellules peut être étudiée sur des sections transversales utilisant l'immunohistochemistry classique. Cependant, la monocouche endothéliale est si mince et fragile qu'elle ne peut généralement pas être observée clairement. En face immunohistochemistry a été utilisé pour observer la surface intérieure de l'endothélium, mais est soit compliqué ou erratique dans ses résultats parce que l'endothélium est facilement dépouillé du tissu sous-jacent, ou juste une partie de la paroi artérielle des rats ou des lapins, dont les murs sont épais, est monté4,5.
Les modèles de souris ont des avantages considérables par rapport aux autres animaux à bien des égards. Ici, nous employons une technique modifiée d'immunofluorescence en face pour analyser les cellules endothéliales de l'arc aortique et de l'aorte thoracique dans la souris C57BL/6. Une telle technique a été largement utilisée pour étudier la pathophysiologie endothéliale dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose6,7,8,9,10. Cette méthode permet aux scientifiques d'observer clairement toute la surface de l'endothélium et de comparer les modèles d'expression d'une protéine donnée dans des régions soumises à différents stress de cisaillement des fluides.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

Des changements aberrants dans le phénotype et la morphologie endothéliales sont considérés comme des événements initiaux dans la pathogénie de l'athérosclérose. L'observation directe de l'endothélium intact fournira des informations précieuses pour comprendre les événements cellulaires et moléculaires dans les cellules endothéliales dysfonctionnelles. Ici, nous décrivons une technique modifiée de coloration d'immunofluorescence d'en face qui permet aux scientifiques d'obtenir des images claires de la surface endothéliale intacte et d'analyser les modèles d'expression de molécule in situ. La méthode est simple et fiable pour observer l'ensemble de la monocouche endothéliale à différents sites de l'aorte. Cette technique peut être un outil prometteur pour comprendre la pathophysiologie de l'athérosclérose, particulièrement à un stade précoce.

Une souris C57BL/6 de 12 semaines a été euthanasiée et perfisée avec la saline normale contenant 40 unités/mL d'héparine et, ensuite, le paraformaldéhyde préréfrigéré de 4%. L'aorte de souris a été exposée sous un microscope disséquant (Figure 1), disséqué, et coupée longitudinalement ouverte (Figure 2). La coloration d'immunofluorescence de visage des cellules endothéliales vasculaires a été exécutée comme...

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Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d'immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l'aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l'étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose.

Utilisation de la coloration en immunofluorescence pour observer directement les cellules endothéliales vasculaires

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Ce protocole aide les gens à analyser la morphologie des cellules endothéliales, et l’expression de molécules dans les régions, sous différents stress de cisaillement des fluides. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une évaluation directe des cellules endothéliales vasculaires sous différents stress de cisaillement liquide. Lors de l’exécution de cette procédure, les étapes clés sont d’utiliser du paraformaldéhyde fraîchement préparé et d’effectuer une bonne perfusion.Commencez cette procédure par l’anesthésie d’une souris C57BL/6 vieille de 12 semaines, telle que décrite dans le protocole textuel. Confirmez l’anesthésie appropriée en pinçant doucement la queue. Tapez les pattes de la souris sur une pile de serviettes en papier, avec du ruban adhésif.Tenez la peau de la souris avec des forceps, et coupez la peau avec une paire de ciseaux de l’abdomen au sommet du thorax. Ouvrez la cavité abdominale, sous la cage thoracique, avec une paire tranchante de ciseaux. Soulevez le sternum avec des forceps, et coupez le diaphragme.Ensuite, coupez la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique. Couper le cava vena juste au-dessus du foie avec des ciseaux. La pression imprèce l’arbre artélial pendant cinq minutes, avec une solution saline normale pré-refroidie contenant 40 unités par héparine millilitre, à travers le ventricule gauche, jusqu’à ce que les poumons et le foie deviennent pâles.Puis perfuser avec pré-réfrigéré 4%paraformaldéhyde dans PBS pendant quatre minutes. Retirez tous les muscles, les organes et la graisse, jusqu’à ce que l’aorte soit exposée. Placez la souris sous un microscope disséquant.Utilisez des forceps délicats et une paire de ciseaux délicats pour exposer l’aorte clairement sous un microscope disséquant, et enlever le tissu conjonctif le long de l’aorte, aussi proprement que possible. Disséquer l’aorte thoracique du cœur au tronc coeliaque avec une paire de ciseaux délicats. Placer l’aorte dans un plat de culture cellulaire de six centimètres, avec PBS.Coupez l’aorte longitudienment, d’abord le long de la courbe inférieure, puis utilisez les microscisseurs pour ouvrir les trois branches de l’arc aortique, y compris la carotide commune innominate, et l’artère subclavian gauche le long de la plus grande courbe jusqu’à ce que le segment droit soit atteint. Perméabiliz l’aorte avec 1% d’éther octyl phénylique d’octyl polyoxyéthylène, dans PBS pendant 10 minutes. Bloquez ensuite l’aorte avec 10% de sérum de chèvre normal dans la solution saline tamponnée de tris contenant 2,5% de polysorbate 20 pendant une heure à température ambiante, dans une plaque de culture de cellules de 12 puits.Ensuite, incuber l’aorte dans le tampon de blocage contenant cinq grammes par millilitre lapin anti-VCAM1, et cinq grammes par rat millilitre anti-VE-Cadherin, nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir rinçé l’échantillon trois fois avec la solution de lavage, appliquez les anticorps secondaires conjugués de fluorescence pendant une heure à température ambiante, en gardant dans un endroit foncé. Rincez encore trois fois dans la solution de lavage.Contrestain l’aorte avec DAPI pendant 10 minutes, en gardant dans un endroit sombre. Rincez ensuite l’aorte tachée trois fois dans la solution de lavage. Placez l’aorte sur un glissement de couverture avec la surface lumenale vers le bas, et déplacez-la lentement à la solution de montage d’antifade qui a été précédemment abandonnée sur le glissement de couverture.Étirez doucement l’aorte pour garder le spécimen à plat. Inverser le slip de couverture et le mettre sur la glissière en verre. Prenez soin d’éviter toute bulle d’air entre le spécimen et le verre.Examinez l’aorte à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Analyser les intensités de couleur des différents canaux de la région désirée dans les images en face, avec le logiciel Image-Pro Plus. En face des images de coloration d’immunofluorescence des cellules endothéliales vasculaires de l’aorte de souris sont montrées.En face immunofluorescence de la protéine d’adhérence des cellules vasculaires un, et l’expression avec VE-Cadherin comme un marqueur endothélial, sont montrés sous différents modèles de flux de différentes régions de l’aorte de souris. DAPI a également été contre-taché pour montrer les noyaux cellulaires pour une meilleure visualisation. Lorsque vous regardez à travers les piles Z sous le microscope, les cellules musculaires endothéliales et lisses peuvent être facilement distinguées par leur morphologie des noyaux cellulaires.Les noyaux cellulaires endothéliales sont de forme ovale, et plus grands que les noyaux de cellules musculaires lisses en forme de fuseau. L’expression de VCAM-1 était plus abondante dans les régions sous écoulement perturbé, à la courbure moindre de l’arc d’aorte, comparée aux régions sous le flux régulier, à une plus grande courbure de l’arc d’aorte, et à l’aorte thoracique. Ici, les zones de courbure moindre d’une aorte de souris sont indiquées comme zones d-flow, et la plus grande courbure et thoracique.Avec la bonne modification, cette technique peut également être appliquée à l’analyse de la perméabilité vasculaire, et la position des macromolécules dans l’intima de cellules endothéliales.

Research

JoVE Journal

Biology

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