Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
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Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. 14441903002, 15411963700).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con protocolli sperimentali approvati dal Comitato per le risorse animali della Shanghai Jiao Tong University.
1. Perfusione dell'aorta del topo
<ol><li>In breve, anestesizzare 12 settimane-vecchio C57BL/ 6 topi con iniezioni intraperitoneali di sodio pentobarbital (50 mg/kg peso corporeo). Confermare l'anestesizzazione corretta pizzicando delicatamente la coda. NOTA: Se non si osserva alcun movimento, l'animale è suf...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

L'endotelio è esposto a numerosi fattori proatherogenici, tra cui lipidi, mediatori infiammatori e stress da taglio fluido1,11,12. L'osservazione diretta delle cellule endoteliali in situ fornisce i vantaggi speciali per analizzare i cambiamenti nella morfologia cellulare, nelle giunzioni intercellulari e nei modelli di espressione molecolare in risposta agli stimoli da lesione.
Studi precedenti hann...

I primi cambiamenti nella vascolatura iniziano principalmente nell'endotelio, che funziona come una barriera selettiva tra il sangue e la parete del vaso con i suoi complessi giunzionali stretti intercellulari1. Prove sostanziali indicano un ruolo critico per gli effetti meccanici del flusso sanguigno nella modulazione della funzione endoteliale2. Lo stress da taglio fluido, una forza d'attrito generata dal flusso sanguigno, modella in modo differenziale la morfologia e la funzione delle cellule endoteliali, a seconda dei paradigmi di flusso specifici nei diversi siti vascolari2,3. Le lesioni aterosclerotiche si verificano preferibilmente in siti di flusso sanguigno disturbato (d-flow), come le curve dei vasi, i divisori di flusso e i punti di diramazione, rispetto alle regioni di flusso costante (flusso di s), come il segmento retto dell'arteria. Pertanto, l'osservazione diretta dei modelli di morfologia endoteliale e di espressione molecolare dovrebbe fornire importanti informazioni sui fenotipi strutturali e funzionali delle cellule endoteliali sotto diversi paradigmi di flusso.
Le cellule endoteliali coltivate non possono esprimere il fenotipo effettivo come fanno in vivo in parte a causa della perdita di impatto dello stress di taglio fluido, delle citochine circostanti e delle interazioni tra cellule o cellule extracellulari. Per aiutare questo, il monostrato di cellule endoteliali intatte può essere studiato su sezioni trasversali utilizzando l'immunohistochimica classica. Tuttavia, il monostrato endoteliale è così sottile e fragile che di solito non può essere osservato chiaramente. En viso immunohistochimica è stato utilizzato per osservare la superficie interna dell'endotelio, ma è sia complicato o irregolare nei suoi risultati perché l'endotelio è facilmente spogliato dal tessuto sottostante, o solo una parte della parete arteriosa di ratti o conigli, le cui pareti sono spesse, è montato4,5.
I modelli murini hanno notevoli vantaggi rispetto agli altri animali sotto molti aspetti. Qui, impieghiamo una tecnica di immunofluorescenza en face modificata per analizzare le cellule endoteliali dell'arco aortico e dell'aorta toracica nel topo C57BL/6. Tale tecnica è stata ampiamente utilizzata per studiare la fisiofisiologia endoteliale in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell'aterosclerosi6,7,8,9,10. Questo metodo consente agli scienziati di osservare chiaramente l'intera superficie dell'endotelio e di confrontare i modelli di espressione di una determinata proteina in regioni sotto stress da taglio fluido diverso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

I cambiamenti aberranti nel fenotipo endoteliale e nella morfologia sono considerati eventi iniziali nella patogenesi dell'aterosclerosi. L'osservazione diretta dell'endotelio intatto fornirà preziose informazioni per comprendere gli eventi cellulari e molecolari nelle cellule endoteliali disfunzionali. Qui, descriviamo una tecnica di colorazione dell'immunofluorescenza modificata che consente agli scienziati di ottenere immagini chiare della superficie endoteliale intatta e analizzare i modelli di espressione molecolare in situ. Il metodo è semplice e affidabile per osservare l'intero mostrato endoteliale in diversi siti dell'aorta. Questa tecnica può essere uno strumento promettente per comprendere la fisiopatologia dell'aterosclerosi, soprattutto in una fase precoce.

Un topo C57BL/6 di 12 settimane è stato eutanasia e perfuso con normale salina contenente 40 unità/mL di eparina e, quindi, precellato 4% paraformaldeide. L'aorta del topo è stato esposto al microscopio dissezioso (Figura 1), sezionato e aperto longitudinalmente (Figura 2). La colorazione dell'immunofluorescenza integrale delle cellule endoteliali vascolari è stata eseguita come illustrato nella Figura 3<...

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Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Qui, presentiamo un protocollo per l'immunofluorescenza colorazione per osservare direttamente le cellule endoteliali dell'aorta del topo. Questa tecnica è utile quando si studia il fenotipo cellulare e molecolare delle cellule endoteliali in diversi modelli di flusso e nello sviluppo dell'aterosclerosi.

Uso dell'immunofluorescenza en faccia per osservare direttamente le cellule endoteliali vascolari

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Questo protocollo aiuta le persone ad analizzare la morfologia delle cellule endoteliali e l'espressione delle molecole nelle regioni, sotto diverse sollecitazioni di taglio dei fluidi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una valutazione diretta delle cellule endoteliali vascolari sotto diverse sollecitazioni di taglio del fluido. Quando si esegue questa procedura, i passaggi chiave sono utilizzare paraformaldeide preparata al momento e eseguire una buona perfusione.Iniziare questa procedura con l'anestesia di un mouse C57BL/6 di 12 settimane, come descritto nel protocollo di testo. Confermare la corretta anestetizzazione pizzicando delicatamente la coda. Rastremi le zampe del mouse su una pila di tovaglioli di carta, con nastro adesivo.Tenere la pelle del topo con le forcep e tagliare la pelle con un paio di forbici dall'addome alla parte superiore del torace. Aprire la cavità addominale, sotto la gabbia toracica, con un paio di forbici affilate. Sollevare lo sterno con le forcep e tagliare il diaframma.Quindi tagliare la gabbia toracica per esporre la cavità toracica. Tagliare la vena cava appena sopra il fegato con le forbici. La pressione perfonde l'albero arterioso per cinque minuti, con soluzione salina normale pre-refrigerata contenente 40 unità per millilitro eparina, attraverso il ventricolo sinistro, fino a quando i polmoni e il fegato diventano pallidi.Quindi perfondere con paraformaldeide pre-refrigerata al 4% in PBS per quattro minuti. Rimuovere tutti i muscoli, gli organi e il grasso, fino a quando l'aorta non è esposta. Posizionare il mouse al microscopio di sezionamento.Utilizzare forcelle delicate e un paio di delicate forbici per esporre chiaramente l'aorta sotto un microscopio sezionante e rimuovere il tessuto connettivo lungo l'aorta, nel modo più pulito possibile. Sezionare l'aorta toracica dal cuore al tronco celiaco con un paio di delicate forbici. Posizionare l'aorta in un piatto di coltura cellulare di sei centimetri, con PBS.Tagliare l'aorta longitudinalmente, prima lungo la curva minore, quindi utilizzare i microscissori per aprire i tre rami dell'arco aortico, incluso l'innominato, la carotide comune sinistra e l'arteria succlavia sinistra lungo la curva maggiore fino a quando il segmento rettilineo non viene soddisfatto. Permeabilizzare l'aorta con 1%poossietilene ottilfenile etere, in PBS per 10 minuti. Quindi bloccare l'aorta con siero di capra normale al 10% in soluzione salina tamponata con tris contenente il 2,5% di polisorbato 20 per un'ora a temperatura ambiente, in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzi.Successivamente incubare l'aorta nel tampone di blocco contenente cinque grammi per millilitro coniglio anti-VCAM1 e cinque grammi per millilitro ratto anti-VE-Cadherin, durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver risciacquato il campione tre volte con la soluzione di lavaggio, applicare gli anticorpi secondari coniugati a fluorescenza per un'ora a temperatura ambiente, mantenendosi in un luogo buio. Risciacquare altre tre volte nella soluzione di lavaggio.Controsostenere l'aorta con DAPI per 10 minuti, mantenendosi in un luogo buio. Quindi sciacquare l'aorta macchiata tre volte in soluzione di lavaggio. Posizionare l'aorta su un coperchio scivolare con la superficie lumenale verso il basso e spostarla lentamente in una soluzione di montaggio antifade che è stata precedentemente lasciata cadere sullo scivolo di copertura.Allungare delicatamente l'aorta per mantenere piatto il campione. Invertire lo scivolo di copertura e metterlo sullo scivolo di vetro. Fare attenzione a evitare bolle d'aria tra il campione e il vetro.Esaminare l'aorta con un microscopio confocale a scansione laser. Analizza le intensità di colore di diversi canali dalla regione desiderata nelle immagini en face, con il software Image-Pro Plus. Sono mostrate immagini di colorazione dell'immunofluorescenza delle cellule endoteliali vascolari dell'aorta del topo.L'immunofluorescenza della proteina di adesione delle cellule vascolari e l'espressione con ve-cadherina come marcatore endoteliale sono mostrate sotto diversi modelli di flusso provenienti da diverse regioni dell'aorta del topo. Dapi è stato anche controsostenibile per mostrare i nuclei cellulari per una migliore visualizzazione. Quando si guardano attraverso le pile Z al microscopio, le cellule muscolari endoteliali e lisce possono essere facilmente distinte per la loro morfologia dei nuclei cellulari.I nuclei cellulari endoteliali sono di forma ovale e più grandi dei nuclei cellulari lisci a forma di mandrino. L'espressione del VCAM-1 era più abbondante nelle regioni sotto flusso disturbato, a curvatura minore dell'arco di aorta, rispetto alle regioni sotto flusso costante, a una maggiore curvatura dell'arco di aorta e all'aorta toracica. Qui le aree di curvatura minore di un aorta del topo sono indicate come aree di flusso d, e la maggiore curvatura e toracica.Con la giusta modifica, questa tecnica può essere applicata anche all'analisi della permeabilità vascolare e alla posizione delle macromolecole nell'intima cellulare endoteliale.

Research

JoVE Journal

Biology

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