Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(助成金第81670451号、81770430)、上海ライジングスタープログラム(助成金第17QA1403000)、上海市科学技術委員会(助成金第17号)の支援を受けた。14441903002, 15411963700).

すべての動物実験は、上海Jiao Tong大学の動物資源委員会によって承認された実験プロトコルに従って行われました。
1. マウス大器の灌流
<ol><li>簡単に言えば、ペントバルビタールナトリウム(50mg/kg体重)の食後注射で12週齢のC57BL/6マウスを麻酔する。尾をそっとつまんで適切な麻酔を確認します。 注:動きが観察されない場合、動物は実験を開始するのに十分な麻酔を?...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

内皮は、脂質、炎症メディエーター、および流体せん断ストレス1、11、12を含む多数の前因性因子にさらされている。その場で内皮細胞を直接観察することは、傷害刺激に応じて細胞形態、細胞間接合、および分子発現パターンの変化を分析する特別な利点を提供する。
以前の研究は、動脈壁4、5の内...

血管系の初期の変化は、主に内皮で始まり、細胞間接合複合体1を有する血液と血管壁との間の選択的障壁として機能する。実質的な証拠は、内皮機能2を調節する上で血流の機械的影響に対する重要な役割を指摘する。流体せん断応力は、血流によって発生する摩擦力を、内皮細胞形態および機能を差別的に形作り、異なる血管部位2、3における特定の流れパラダイムに応じて形成する。アテローム硬化性病変は、血管曲率、流れ分周器、分岐点などの乱れた血流(d-flow)の部位で優先的に発生し、動脈の直線セグメントなどの安定した流れ(s-flow)の領域と比較して起こる。したがって、内皮形態と分子発現パターンを直接観察すると、様々な流れパラダイム下の内皮細胞の構造的および機能的表現型に関する重要な洞察を提供する必要があります。
培養された内皮細胞は、流体せん断ストレス、周囲のサイトカイン、細胞外または細胞外マトリックス相互作用の影響の損失のために、生体内で行われるように実際の表現型を発現しない場合があります。これを助けるために、無傷の内皮細胞単層は、古典的な免疫組織化学を用いて横断的なセクションで研究することができる。しかし、内皮単層は非常に薄く壊れやすいので、通常ははっきりと観察することができません。エンフェイス免疫組織化学は、内皮の内面を観察するために使用されてきたが、内皮が下層組織から容易に取り除かれるか、またはラットまたはウサギの動脈壁の一部だけであるので、その結果は複雑または不安定である。その壁は厚く、4、5に取り付けられています。
マウスモデルは、多くの点で他の動物よりもかなりの利点を持っています。ここでは、C57BL/6マウスにおける大動脈アーチと胸部大動脈の内皮細胞を解析するために、改変された顔免疫蛍光技術を用いる。このような技術は、異なる流れパターンおよびアテローム性動脈硬化症6、7、8、9、10の発達において内皮病態生理学を研究するために広く使用されている。この方法により、科学者は内皮の表面全体を明確に観察し、異なる流体せん断応力下の領域における特定のタンパク質の発現パターンを比較することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

内皮表現型および形態の異常な変化は、アテローム性動脈硬化症の病因における初期事象であると考えられる。無傷の内皮を直接観察することは、機能不全の内皮細胞における細胞および分子事象を理解するための貴重な情報を提供する。ここでは、無傷の内皮表面の鮮明な画像を得て、その場で分子発現パターンを解析することを可能にする改変された顔免疫蛍光染色技術について述べる。この方法は、大器の異なる部位で内皮単層全体を観察するためのシンプルで信頼性が高い。この技術は、特に初期段階で、アテローム性動脈硬化症の病態生理学を理解するための有望なツールでありうる。

12週齢のC57BL/6マウスを安楽死させ、40単位/mLヘパリンを含む正常な生理食生を浸通し、次いで、4%のパラホルムアルデヒドを予冷させた。マウス大横を解剖顕微鏡下に露出し(図1)、解剖し、縦方向に切開した(図2)。血管内皮細胞のエンフェイス免疫蛍光染色は、図3および表1に示すように?...

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Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

ここでは、マウス大様の内皮細胞を直接観察する免疫蛍光染色のためのプロトコルを提示する。この技術は、異なる流れパターンでの内皮細胞の細胞および分子表現型を研究し、アテローム性動脈硬化症の発症に有用である。

血管内皮細胞を直接観察するためにエンフェイス免疫蛍光染色を用いて

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

このプロトコルは、人々が異なる流体せん断応力の下で、内皮細胞形態、および領域における分子の発現を分析するのに役立ちます。この技術の主な利点は、異なる流体せん断応力下で血管内皮細胞の直接評価を提供することです。この手順を実行する場合、重要なステップは、作りたてのパラホルムアルデヒドを使用し、良好な灌流を行うことである。テキスト プロトコルで説明されているように、12 週齢の C57BL/6 マウスの麻酔を使用して、この手順を開始します。尾を軽くつまんで適切な麻酔を確認します。マウスの足を粘着テープでペーパータオルの積み重ねにテープで貼ります。マウスの皮膚を鉗子で持ち上げ、腹部から胸郭の上部まではさみで皮膚を切ります。腹腔を開き、胸部の下に鋭いハサミで開きます。胸骨を鉗子で持ち上げ、横隔膜を切ります。その後、胸部を切り取って胸腔を露出します。肝臓のすぐ上の大静脈をはさみで切り落とします。圧力は動脈樹を5分間浸透させ、肺と肝臓が青白くなるまで、1ミリリットルのヘパリン当たり40単位を含む冷やされた正常な生理食塩水を左心室を通り抜ける。その後、PBSで4%パラホルムアルデヒドを4分間冷やして4%パーフューズします。大器官が露出するまで、すべての筋肉、器官、脂肪を取り除きます。マウスを解剖顕微鏡の下に置きます。繊細な鉗子と繊細なはさみを使用して、解剖顕微鏡の下で大オルタをはっきりと露出させ、大オルタに沿って結合組織をできるだけきれいに取り除きます。胸部大分を心臓からセリアックトランクまで繊細なはさみで解剖する。大大ターをPBSで6センチメートルの細胞培養皿に入れます。大動脈を縦方向に切り開き、最初に小さな曲線に沿って切り開き、次にマイクロシザーを使用して、結節、左共通頸動脈、および左鎖骨動脈を含む大動脈アーチの3つの枝を切断し、直線セグメントが満たされるまで大きな曲線に沿って切断する。1%ポリオキシエチレンオチルフェニルエーテルで大オルタを透過し、PBSで10分間透過させる。次に、2.5%ポリソルベート20を含むトリス緩衝生理食類で10%正常ヤギ血清を12ウェルセル培養プレートで1時間ブロックします。次に、1ミリリットルウサギの抗VCAM1あたり5グラム、1ミリリットルラット抗VEカドヘリン当たり5グラムを含むブロッキングバッファーに大オルタを4°Cで一晩インキュベートする。洗浄液で試料を3回洗浄した後、蛍光コンジュゲート二次抗体を室温で1時間塗布し、暗所に保管する。洗浄液に3回洗い流す。DAPIで大オルタに対抗し、暗い場所に保管します。次に、染色した大オルタを洗浄液中で3回洗い流します。大間は、内腔表面を下方に覆われたスリップに置き、以前にカバースリップに落とされたアンチフェード実装溶液にゆっくりと動かします。大大離を軽く伸ばして標本を平らに保ちます。カバースリップを反転し、ガラススライドの上に置きます。試料とガラスの間の気泡を避けるように注意してください。レーザー走査共焦点顕微鏡で大オルタを調べます。enフェイス画像の目的の領域から異なるチャンネルの色強度を、Image-Pro Plusソフトウェアで解析します。マウス大動脈からの血管内皮細胞の蛍光エン顔免疫蛍光染色画像が示されている。血管細胞接着タンパク質1の顔面蛍光、およびVE-カドヘリンを内皮マーカーとして発現し、マウス大動脈の異なる領域からの様々なフローパターンの下で示されている。DAPIはまた、より良い視覚化のために細胞核を示すために対抗した。顕微鏡下でZスタックを見ると、内皮細胞と平滑筋細胞は、細胞核形態によって容易に区別することができる。内皮細胞核は楕円形であり、紡錘形の平滑筋細胞核よりも大きい。VCAM-1の発現は、大大小アーチの曲率が小さい領域、安定した流れの下の領域、大大門アーチのより大きな曲率、および胸部大オルタの領域において、より豊富であった。ここでは、マウス大オルタの湾曲率が小さい領域は、d流れ領域、および大きな湾曲および胸部として示される。適切な修飾により、この技術は血管透過性の分析、および内皮細胞内の高分子の位置の分析にも適用することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

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Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

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A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

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Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...