Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
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이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81670451, 81770430), 상하이 라이징 스타 프로그램 (그랜트 번호 17QA140300), 상하이 시 정부의 과학 기술위원회 (그랜트 번호)에 의해 지원되었다. 14441903002, 15411963700).

모든 동물 실험은 상하이 자오퉁 대학의 동물 자원위원회가 승인한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 마우스 대류의 관류
<ol><li>간단히, 12 주 된 C57BL/6 쥐 나트륨 pentobarbital의 복 강 주사와 쥐를 마 사 (50 mg/kg 체중). 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 참고: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 충분히 마취되어 실험을 시작합니다.</li>
	<li>마우스의 ?...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

내피는 지질, 염증성 매개체 및 유체 전단 응력1,11,12를포함하는 수많은 프로테로겐성 인자에 노출된다. 이 소동에서 내피 세포를 직접 관찰하는 것은 부상 자극에 반응하여 세포 형태, 세포 간 접합부 및 분자 발현 패턴의 변화를 분석하는 특별한 이점을 제공한다.
이전 연구는 동맥 벽의 내피를 관찰하기 ...

혈관 구조의 초기 변화는 주로 내피에서 시작되며, 이는 세포 간 단단한 접합 복합체와 함께 혈액과 혈관 벽 사이의선택적 장벽으로 기능합니다 1. 실질적인 증거는 내피 기능 조절에 혈류의 기계적 효과에 대한 중요한역할을 가리킵니다 2. 유체 전단 응력, 혈류에 의해 생성되는 마찰력, 상이한 혈관 부위의 특정 흐름 패러다임에 따라내피 세포 형태 및 기능을 차별화하여 형성한다 2,3. 죽상 경화성 병변은 동맥의 직선 세그먼트와 같은 꾸준한 흐름 (s-flow)의 영역과 비교하여 혈관 곡률, 흐름 분배기 및 분기 점과 같은 방해 된 혈류 (d-flow)의 부위에서 우선적으로 발생합니다. 따라서, 내피 형태와 분자 발현 패턴의 직접적인 관찰은 다양한 흐름 패러다임하에서 내피 세포의 구조적 및 기능적 표현형에 대한 중요한 통찰력을 제공해야합니다.
배양된 내피 세포는 유체 전단 스트레스, 주변 사이토카인, 세포 세포 또는 세포 외 매트릭스 상호작용의 충격의 손실로 인해 생체 내에서 부분적으로 수행되는 것처럼 실제 표현형을 발현하지 않을 수 있다. 이를 돕기 위해, 본래 내피 세포 단층은 고전적인 면역 조직 화학을 사용하여 횡절편에서 연구 될 수있다. 그러나, 내피 단층은 일반적으로 명확하게 관찰될 수 없을 정도로 얇고 깨지기 쉽습니다. En face 면역조직화학은 내피의 내벽을 관찰하는데 사용되어 왔지만, 내피가 쥐 나 토끼의 동맥 벽의 일부 또는 기본 조직에서 쉽게 벗겨지기 때문에 그 결과에 복잡하거나 불규칙합니다. 그 벽은 두꺼운,4,5를 장착됩니다 .
마우스 모델은 여러 면에서 다른 동물에 비해 상당한 장점을 갖는다. 여기에서, 우리는 C57BL/6 마우스에 있는 대동맥 아치 및 흉부 대동맥의 내피 세포를 분석하기 위하여 수정된 en face 면역 형광 기술을 채택합니다. 이러한 기술은 상이한 흐름 패턴의 내피 병리생리학을 연구하고 동맥경화증6,7,8,9,10의발달에 널리 사용되어 왔다. 이 방법을 통해 과학자들은 내피의 전체 표면을 명확하게 관찰하고 다른 유체 전단 응력 하에서 주어진 단백질의 발현 패턴을 비교할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

내피형및 형태학에 있는 비정상적인 변경은 동맥 경화증의 병인에 있는 초기 사건으로 여겨져. 본래 내피의 직접적인 관찰은 기능 장애 내피 세포에서 세포 및 분자 사건을 이해하는 귀중한 정보를 제공 할 것이다. 여기에서, 우리는 과학자들이 손상되지 않은 내피 표면의 명확한 심상을 얻고 그 자리에서 분자 발현 패턴을 분석하는 것을 가능하게 하는 변형된 en face 면역형광 염색 기술을 기술합니다. 이 방법은 대공의 다른 부위에서 전체 내피 단층을 관찰하기위한 간단하고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술은 특히 초기 단계에서 동맥 경화증의 병리생리학을 이해하는 유망한 도구가 될 수 있습니다.

12주 된 C57BL/6 마우스를 안락사시키고 40 단위/mL 헤파린을 함유한 일반 식염수로 주입한 다음, 4% 파라포름알데히드를 미리 냉각시켰습니다. 마우스 대공은 해부 현미경(도 1)에노출되었고, 해부하고, 세로로 절단하였다(도2). 혈관 내피 세포의 En 얼굴 면역형광 염색은 도 3 및 표1에 예시된 바와...

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Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

이 프로토콜은 사람들이 다른 유체 전단 응력 하에서 내피 세포 형태와 영역에서 분자의 발현을 분석하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 상이한 유체 전단 응력 하에서 혈관 내피 세포의 직접적인 평가를 제공한다는 것입니다. 이 절차를 수행 할 때, 주요 단계는 갓 준비 파라 포름 알데히드를 사용하고 좋은 관류를 수행하는 것입니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 12주 된 C57BL/6 마우스의 마취로 이 절차를 시작합니다. 꼬리를 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마우스의 발을 접착제 테이프로 종이 타월 더미에 테이프로 테이프로 놓습니다.마우스의 피부를 집게로 잡고 복부에서 흉부 꼭대기까지 가위로 피부를 자른다. 날카로운 가위로 흉곽 아래복을 엽니다. 흉골을 집게로 들어 올리고 다이어프램을 자른다.그런 다음 흉곽을 잘라 흉부 구멍을 노출합니다. 가위로 간 바로 위에 있는 베나 카바를 잘라냅니다. 압력은 5 분 동안 동맥 나무를 pererle, 폐와 간 창백해질 때까지, 왼쪽 심실을 통해, 밀리리터 헤파린 당 40 단위를 포함하는 미리 차가운 정상 식염수와.그런 다음 PBS에서 4 분 동안 미리 냉각 된 4 % 파라 포름 알데히드와 함께 퍼퓨즈하십시오. 대자가 노출 될 때까지 모든 근육, 장기 및 지방을 제거하십시오. 해부 현미경 아래에 마우스를 놓습니다.섬세한 집게와 섬세한 가위를 사용하여 해부 현미경으로 대어타를 명확하게 노출시키고 대어타를 따라 결합 조직을 가능한 한 깨끗하게 제거하십시오. 심혼에서 체강 트렁크에 섬세한 가위를 매치하여 흉부 대어를 해부합니다. 대마를 PBS와 함께 6센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.대동맥을 세로로 길게 잘라서 먼저 작은 곡선을 따라 잘라낸 다음 마이크로시저를 사용하여 오리지움, 왼쪽 공통 경동맥 및 왼쪽 서브클라비아 동맥을 포함하여 대동맥 아치의 세 가지를 잘라내어 직선 세그먼트가 충족될 때까지 더 큰 곡선을 따라 절단합니다. 10 분 동안 PBS에서 1 % 폴리옥시에틸렌 옥실 페닐 에테르로 대어를 페메아빌화하십시오. 그런 다음 12웰 세포 배양 판에서 실온에서 1시간 동안 2.5%의 폴리소르바테 20을 함유한 트리스 버퍼링 식염수로 10%의 일반 염소 세럼으로 대어타를 차단한다.다음으로 밀리리터 토끼 안티 VCAM1 당 5 그램을 포함하는 차단 버퍼에서 대어타를 배양하고, 밀리리터 쥐 안티 VE-Cadherin 당 5 그램, 섭씨 4도에서 하룻밤. 세척 용액으로 샘플을 세 번 헹구고, 실온에서 1 시간 동안 형광 컨쥬게이징 이차 항체를 적용하여 어두운 곳에 보관하십시오. 세탁 용액에 세 번 더 헹도 라.대어테아를 DAPI로 10분 동안 카운터스테인하여 어두운 곳에 보관합니다. 그런 다음 스테인드 대어를 세정용으로 세 번 헹구는 다. 대어타를 곡선 면이 아래쪽으로 덮개 슬립에 놓고, 이전에 커버 슬립에 떨어뜨린 안티페이드 장착 용액으로 천천히 이동합니다.대마를 부드럽게 펴서 시편을 평평하게 유지합니다. 커버 슬립을 반전시키고 유리 슬라이드에 놓습니다. 시편과 유리 사이의 기포를 피하십시오.레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 대어타를 검사합니다. 이미지-프로 플러스 소프트웨어를 통해 원한 영역에서 원하는 영역과 다른 채널의 색상 강도를 분석합니다. 마우스 대동맥으로부터 혈관 내피 세포의 종양 염색 이미지가 표시된다.En face 면역형화 단백질 하나, 내피 마커로서 VE-Cadherin을 통한 발현은 마우스 대동맥의 상이한 영역에서 다양한 유동 패턴으로 도시된다. DAPI는 또한 더 나은 시각화를 위한 세포 핵을 보여주기 위하여 반성되었다. 현미경의 밑에 Z 스택을 통해 볼 때, 내피 및 매끄러운 근육 세포는 그들의 세포 핵 형태에 의해 쉽게 구별될 수 있습니다.내피 세포 핵은 타원형모양이며, 스핀들 모양의 부드러운 근육 세포 핵보다 더 크다. VCAM-1의 발현은 대오르타 아치의 낮은 곡률, 꾸준한 흐름 아래, 대나타 아치의 더 큰 곡률, 그리고 흉부 대역에서 의 방해된 흐름 아래 영역에서 더 풍부했다. 여기서 마우스 대자의 곡률이 적고 곡률이 적고 곡률과 흉부가 커진다.올바른 수정을 통해, 이 기술은 또한 내피 세포 내동성 에서 혈관 투과성, 및 거대 분자의 위치의 분석에 적용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

판막병 내피 세포의 분리

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

연구

생물학

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

마우스 혈관의 얼굴 준비

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...