Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star-programmet (Grant no. 17QA1403000), og Science Technology Committee av Shanghai Municipal Government (Grant no. 14441903002, 15411963700).

Alle dyr eksperimenter ble gjennomført i samsvar med eksperimentelle protokoller godkjent av komiteen for Animal Resources av Shanghai Jiao Tong University.
1. å ha en mus aorta
<ol><li>Kort, bedøve 12-ukers-gamle C57BL/6 mus med intraperitoneal injeksjoner av natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvekt). Bekreft riktig bedøvelsen ved å knipe halen forsiktig. Merk: Hvis ingen bevegelse er observert, er dyret tilstrekkelig anesthetized for å starte eksperimentene.</li>
	<li>Tape musen...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

Endotelet utsettes for mange proatherogenic faktorer, inkludert lipider, inflammatoriske meglere og væske skjær stress1,11,12. Direkte observasjon av endothelial celler i situ gir de spesielle fordelene til å analysere endringer i celle morfologi, intercellulære kryss og molekyl uttrykks mønstre som svar på skaden stimuli.
Tidligere studier har gitt to forskjellige en Face immunhistokjemiske tek...

Den tidlige endringer i blodkar primært initiere i endotelet, som fungerer som en selektiv barriere mellom blod og fartøyet veggen med sine intercellulære stramt junctional komplekser1. Vesentlige bevis peker på en kritisk rolle for de mekaniske virkningene av blodstrømmen i modulerende endothelial funksjon2. Fluid skjær stress, en friksjons kraft generert av blodstrøm, differensielt former endothelial celle morfologi og funksjon, avhengig av den spesifikke flyten paradigmer på ulike vaskulære nettsteder2,3. Aterosklerotiske lesjoner fortrinnsvis oppstå på områder av forstyrret blodstrøm (d-flow), for eksempel fartøy kurvaturer, flyt skillevegger og gren poeng, i forhold til regioner av jevn flyt (s-flow), for eksempel rett segmentet av arterien. Derfor bør direkte observasjon av endothelial morfologi og molekyl uttrykk mønstre gi viktig innsikt i den strukturelle og funksjonelle fenotyper av endothelial celler under varierende flyt paradigmer.
Kultivert endothelial celler kan ikke uttrykke den faktiske fenotype som de gjør i vivo delvis på grunn av tap av virkningen av væske skjær stress, omkringliggende cytokiner, og celle-celle eller celle-ekstracellulære matrise interaksjoner. For å hjelpe dette, kan den intakte endothelial celle monolag bli studert på tverrgående seksjoner ved hjelp av klassisk immunhistokjemi. Men den endothelial monolag er så tynn og skjør at den vanligvis ikke kan observeres tydelig. En ansikt immunhistokjemi har blitt brukt til å observere den indre overflaten av endotelet, men er enten komplisert eller uberegnelig i sine resultater fordi endotelet er lett strippet fra underliggende vev, eller bare en del av arterieveggen av rotter eller kaniner, Hvis veggene er tykke, er montert4,5.
Mouse modeller har store fordeler fremfor andre dyr på mange måter. Her bruker vi en modifisert en ansikt immunofluorescence teknikk for å analysere endothelial celler av aorta buen og bryst aorta i C57BL/6 mus. En slik teknikk har blitt mye brukt til å studere endothelial patofysiologi i ulike strømnings mønstre og i utviklingen av aterosklerose6, 7,8,9,10. Denne metoden gjør det mulig for forskere å observere hele overflaten av endotelet klart og å sammenligne uttrykket mønstre av et gitt protein i regioner under forskjellige Fluid skjær stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

Avvikende endringer i endothelial fenotype og morfologi anses å være innledende hendelser i patogenesen av aterosklerose. Direkte observasjon av intakt endotelet vil gi verdifull informasjon for å forstå mobilnettet og molekylære hendelser i dysfunksjonelle endothelial celler. Her beskriver vi en modifisert en ansikts immunofluorescence farge teknikk som gjør det mulig for forskere å få klare bilder av den intakte endothelial overflaten og analysere molekyl uttrykks mønstrene in situ. Metoden er enkel og pålitelig for å observere hele endothelial monolag på ulike steder i aorta. Denne teknikken kan være et lovende verktøy for å forstå patofysiologi av aterosklerose, spesielt på et tidlig stadium.

En 12-ukers-gammel C57BL/6-mus ble euthanized og perfusert med normal saltvann inneholdende 40 enheter/mL heparin, og deretter prechilled 4% paraformaldehyde. Musen aorta ble eksponert under et dissekere mikroskop (figur 1), dissekert, og kuttet åpen lengderetningen (figur 2). En ansikt immunofluorescence farging av vaskulære endothelial celler ble utført som illustrert i Figur 3 og tabell...

Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Her presenterer vi en protokoll for immunofluorescence farging for å observere de endothelial cellene i muse aorta direkte. Denne teknikken er nyttig når du studerer mobilnettet og molekylær fenotype av endothelial celler i ulike strømnings mønstre og i utviklingen av aterosklerose.

Bruke en Face Immunofluorescence farging å observere vaskulær endothelial celler direkte

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Denne protokollen hjelper folk med å analysere endotelcellemorfologi, og uttrykket av molekyler i regioner, under forskjellig væskeskjærstress. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir en direkte vurdering av vaskulære endotelceller under forskjellig væskeskjærstress. Når du utfører denne prosedyren, er viktige trinn å bruke nylaget paraformaldehyd og å utføre en god perfusjon.Start denne prosedyren med bedøvelse av en 12 uker gammel C57BL/6-mus, som beskrevet i tekstprotokollen. Bekreft riktig bedøvelse ved å klemme halen forsiktig. Tape musens poter til en stabel med papirhåndklær, med tape.Hold opp musens hud med tang, og kutt huden med en saks fra magen til toppen av thoraxen. Åpne bukhulen, under brystkassen, med en skarp saks. Løft brystbenet med tang, og kutt membranen.Klipp deretter bort brystkassen for å eksponere thoraxhulen. Klipp av vena cava like over leveren med saks. Trykk perfuse arteriell treet i fem minutter, med pre-kjølt normal saltvann som inneholder 40 enheter per milliliter heparin, gjennom venstre ventrikkel, til lungene og leveren blir bleke.Deretter perfuse med pre-kjølt 4% paraformaldehyd i PBS i fire minutter. Fjern alle muskler, organer og fett, til aorta er utsatt. Plasser musen under et dissekerende mikroskop.Bruk delikate tang og et par delikate sakser for å eksponere aorta tydelig under et dissekerende mikroskop, og fjern bindevevet langs aorta, så rent som mulig. Disseker thorax aorta fra hjertet til cøliakistammen med et par delikate saks. Legg aorta i en seks centimeter celle kultur rett, med PBS.Klipp opp aorta langsgående, først langs den mindre kurven, og bruk deretter mikroscissorene til å kutte åpne de tre grenene av aortabuen, inkludert den innotiske, venstre vanlige halsen og venstre subklavisk arterie langs den større kurven til det rette segmentet er oppfylt. Gjennomsyre aorta med 1% polyoksyetylenokylfenylfenyleter, i PBS i 10 minutter. Deretter blokkerer aorta med 10% normal geit serum i tris-bufret saltvann som inneholder 2,5% polysorbat 20 i en time ved romtemperatur, i en 12 brønncellekulturplate.Deretter inkuber aorta i blokkeringsbufferen som inneholder fem gram per milliliter kanin anti-VCAM1, og fem gram per milliliter rotte anti-VE-Cadherin, over natten på fire grader Celsius. Etter skylling av prøven tre ganger med vaskeløsning, bruk fluorescenskonjugert sekundære antistoffer i en time ved romtemperatur, og hold på et mørkt sted. Skyll ytterligere tre ganger i vaskeoppløsningen.Motvirke aorta med DAPI i 10 minutter, holde på et mørkt sted. Skyll deretter den beisede aortaen tre ganger i vaskeoppløsning. Plasser aorta på en dekselslipp med lumenaloverflaten nedover, og flytt den sakte til antifademonteringsløsning som tidligere har blitt sluppet på dekselslipp.Strekk forsiktig aortaen for å holde prøven flat. Inverter dekselet slip og sette den på glasssklien. Vær forsiktig så du unngår luftbobler mellom prøven og glasset.Undersøk aorta med et konfokalt laserskanning. Analyser fargeintensiteten til forskjellige kanaler fra ønsket område i en ansiktsbilde, med Image-Pro Plus programvare. En face immunofluorescence flekker bilder av vaskulære endotelceller fra musen aorta vises.En ansikt immunofluorescence av vaskulær celle vedheft protein en, og uttrykk med VE-Cadherin som en endotelmarkør, er vist under varierende strømningsmønstre fra ulike områder av musen aorta. DAPI ble også motarbeidet for å vise cellekjernene for bedre visualisering. Når du ser gjennom Z-stablene under mikroskopet, kan endotel- og glatte muskelceller lett skilles ut av deres cellekjernermorfologi.Endotelcellekjernene er ovale formet, og større enn spindelformede, glatte muskelcellekjerner. Uttrykk for VCAM-1 var mer rikelig i regioner under forstyrret flyt, ved mindre krumning av aortabuen, sammenlignet med regioner under jevn flyt, ved større krumning av aortabuen, og ved thorax aorta. Her er områder med mindre krumning av en mus aorta angitt som d-flow områder, og større krumning og thorax.Med riktig modifikasjon kan denne teknikken også brukes til analyse av vaskulær permeabilitet, og plasseringen av makromolekyler i endotelcellen intima.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolasjon og differensiering av stromale Vaskulær Cells til beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISH Bruke Direkte merkede prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av Murint Valve endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirekte Immunfluorescens på Frosne Deler av Mouse melkekjertler

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection av nitrogenoksid og Superoxide i endothelial lag av intakte Arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En enkel Bioassay for Evaluering av vaskulær endotelial vekstfaktorer

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En ansiktsbehandling av museblodfartøy

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...