Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
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Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81670451, 81770430), o programa de Xangai Rising-Star (Grant no. 17QA1403000), e o Comitê de tecnologia da ciência do governo municipal de Xangai (Grant no. 14441903002, 15411963700).

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pela Comissão de recursos animais da Universidade Shanghai Jiao Tong.
1. perfusão da aorta do rato
<ol><li>Momentaneamente, anestesiam os ratos 12 week-old C57BL/6 com injeções intraperitoneal do pentobarbital do sódio (50 mgs/quilograma de peso de corpo). Confirme a anestesia apropriada delicadamente beliscando a cauda. Nota: se não for observado nenhum movimento, o animal é suficie...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

O endotélio é exposto a inúmeros fatores pró-aterogênicos, incluindo lipídios, mediadores inflamatórios e estresse de cisalhamento fluido1,11,12. A observação direta de células endoteliais in situ fornece as vantagens especiais para analisar alterações na morfologia celular, junções intercelulares e padrões de expressão de moléculas em resposta aos estímulos de lesão.
Estudos prévi...

As primeiras alterações na vasculatura iniciam-se primariamente no endotélio, que funciona como uma barreira seletiva entre o sangue e a parede do vaso com seus complexos juncionais apertados intercelulares1. Evidências substanciais apontam para um papel crítico para os efeitos mecânicos do fluxo sanguíneo na função endotelial moduladora2. O estresse de cisalhamento fluido, uma força de atrito gerada pelo fluxo sanguíneo, diferencia diferencialmente a morfologia e a função da célula endotelial, dependendo dos paradigmas de fluxo específicos em diferentes sítios vasculares2,3. As lesões ateroscleróticas ocorrem preferencialmente em sítios de fluxo sanguíneo perturbado (d-Flow), como curvaturas de vasos, divisores de fluxo e pontos de ramificação, em comparação às regiões de fluxo constante (s-Flow), como o segmento reto da artéria. Portanto, a observação direta da morfologia endotelial e dos padrões de expressão da molécula deve fornecer insights importantes sobre os fenótipos estruturais e funcionais das células endoteliais diferentes paradigmas de fluxo.
As pilhas endothelial cultivadas não podem expressar o phenotype real como fazem in vivo em parte devido à perda de impacto do esforço de tesoura fluido, das citocinas circunvizinhas, e das interações Cell-Cell ou Cell-extracellular da matriz. Para ajudar a isso, a monocamada de células endoteliais intactas pode ser estudada em seções transversais usando imunohistoquímica clássica. No entanto, a monocamada endotelial é tão fina e frágil que geralmente não pode ser observada claramente. A immunohistochemistry do en da cara foi usada para observar a superfície interna do endotélio mas é complicada ou errático em seus resultados porque o endotélio é descascado fàcilmente do tecido subjacente, ou apenas parte da parede arterial dos ratos ou dos coelhos, cujas paredes são grossas, é montado4,5.
Modelos de mouse têm vantagens consideráveis sobre outros animais em muitos aspectos. Aqui, nós empregamos uma técnica modificada da imunofluorescência do en-cara para analisar pilhas endothelial do arco aórtico e da aorta torácica no rato de C57BL/6. Essa técnica tem sido amplamente utilizada para estudar a fisiopatologia endotelial em diferentes padrões de fluxo e no desenvolvimento da aterosclerose6,7,8,9,10. Este método permite que os cientistas observem a superfície inteira do endotélio claramente e comparem os testes padrões da expressão de uma proteína dada nas regiões o esforço de cisalhamento fluido diferente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

As mudanças aberrantes no phenotype e na morfologia endothelial são consideradas ser eventos iniciais na patogénese da aterosclerose. A observação direta do endotélio intacto fornecerá informações valiosas para a compreensão dos eventos celulares e moleculares nas células endoteliais disfuncionais. Aqui, nós descrevemos uma técnica modificada da mancha da imunofluorescência do en-cara que permita que os cientistas obtenham imagens desobstruídas da superfície endothelial intacta e analisem os testes padrões da expressão da molécula in situ. O método é simples e confiável para observar toda a monocamada endotelial em diferentes sítios da aorta. Esta técnica pode ser uma ferramenta promissora para a compreensão da fisiopatologia da aterosclerose, especialmente em um estágio inicial.

Um rato de 12 semanas de idade C57Bl/6 foi eutanasiado e perfundidos com soro fisiológico normal contendo 40 unidades/ml de heparina e, em seguida, pré-refrigerados 4% paraformaldeído. A aorta do camundongo foi exposta um microscópio de dissecação (Figura 1), dissecada e cortada longitudinalmente (Figura 2). A coloração da imunofluorescência da face do en das pilhas endothelial vasculares foi executada como ilustrado na ...

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Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aqui, nós apresentamos um protocolo para a coloração da imunofluorescência para observar diretamente as pilhas endothelial da aorta do rato. Esta técnica é útil ao estudar o phenotype celular e molecular de pilhas endothelial em testes padrões de fluxo diferentes e no desenvolvimento da aterosclerose.

Usando a mancha da imunofluorescência da cara do en para observar diretamente pilhas endothelial vasculares

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Este protocolo ajuda as pessoas a analisar a morfologia celular endotelial, e a expressão de moléculas em regiões, sob diferentes estresses de tesoura de fluidos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma avaliação direta das células endoteliais vasculares sob diferentes estresses de tesoura de fluidos. Ao realizar este procedimento, os principais passos são usar paraformaldeído recém-preparado e realizar uma boa perfusão.Inicie este procedimento com a anestesia de um mouse C57BL/6 de 12 semanas de idade, conforme descrito no protocolo de texto. Confirme a anestesia adequada apertando suavemente a cauda. Tape as patas do mouse em uma pilha de toalhas de papel, com fita adesiva.Segure a pele do rato com fórceps, e corte a pele com uma tesoura do abdômen até o topo do tórax. Abra a cavidade abdominal, abaixo da caixa torácica, com uma tesoura afiada. Levante o esterno com fórceps e corte o diafragma.Em seguida, corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica. Corte a veia cava logo acima do fígado com uma tesoura. Pressão perprendo a árvore arterial por cinco minutos, com soro fisiológico normal pré-refrigerado contendo 40 unidades por heparina mililitro, através do ventrículo esquerdo, até que os pulmões e fígado fiquem pálidos.Em seguida, perfuse com pré-refrigerado 4% paraformaldeído em PBS por quatro minutos. Remova todos os músculos, órgãos e gordura, até que a aorta seja exposta. Coloque o mouse sob um microscópio de dissecação.Use fórceps delicados e um par de tesouras delicadas para expor a aorta claramente sob um microscópio dissecando, e remover o tecido conjuntivo ao longo da aorta, o mais limpo possível. Disseque a aorta torácica do coração até o tronco celíaco com um par de tesouras delicadas. Coloque a aorta em um prato de cultura celular de seis centímetros, com PBS.Corte a aorta longitudinalmente, primeiro ao longo da curva menor, e depois use os microscissores para cortar os três ramos do arco aórtico, incluindo o innominado, deixado carótida comum, e a artéria subclávia esquerda ao longo da curva maior até que o segmento reto seja atendido. Permeabilize a aorta com 1%de polioximetil de fenil éter, em PBS por 10 minutos. Em seguida, bloqueie a aorta com soro de cabra 10% normal em soro fisiológico tris-tamponado contendo 2,5% de polisorbato 20 por uma hora à temperatura ambiente, em uma placa de cultura de 12 poços.Em seguida, incubar a aorta no tampão de bloqueio contendo cinco gramas por mililitro de coelho anti-VCAM1, e cinco gramas por mililitro de rato anti-VE-Cadherin, durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de enxaguar a amostra três vezes com solução de lavagem, aplique os anticorpos secundários conjugados de fluorescência durante uma hora em temperatura ambiente, mantendo-se em um lugar escuro. Enxágüe mais três vezes na solução de lavagem.Contra-mantenha a aorta com DAPI por 10 minutos, mantendo-se em um lugar escuro. Em seguida, enxágue a aorta manchada três vezes na solução de lavagem. Coloque a aorta em um deslizamento de cobertura com a superfície lumenal para baixo, e mova-a lentamente para a solução de montagem antifade que foi anteriormente descartada no deslizamento da tampa.Estique suavemente a aorta para manter o espécime plano. Inverta o deslizamento da tampa e coloque-o no escorregador de vidro. Tome cuidado para evitar bolhas de ar entre o espécime e o vidro.Examine a aorta com um microscópio confocal de varredura a laser. Analise as intensidades de cores de diferentes canais da região desejada nas imagens presenciais, com o software Image-Pro Plus. Imagens de coloração de imunofluorescência en de células endoteliais vasculares da aorta do rato são mostradas.A imunofluorescência facial da proteína de adesão celular vascular uma, e a expressão com VE-Cadherin como um marcador endotelial, são mostradas sob padrões de fluxo variados de diferentes regiões da aorta do rato. O DAPI também foi contra-identificado para mostrar aos núcleos celulares uma melhor visualização. Ao olhar através das pilhas Z sob o microscópio, as células musculares endoteliais e lisas podem ser facilmente distinguidas por sua morfologia de núcleos celulares.Os núcleos de células endoteliais têm forma oval, e maiores que os núcleos de células musculares suaves em forma de fuso. A expressão do VCAM-1 foi mais abundante em regiões sob fluxo perturbado, em menor curvatura do arco da aorta, em comparação com regiões sob fluxo constante, em maior curvatura do arco da aorta, e na aorta torácica. Aqui áreas de menor curvatura de uma aorta de rato são indicadas como áreas de fluxo D, e a maior curvatura e torácica.Com a modificação correta, essa técnica também pode ser aplicada à análise da permeabilidade vascular, e a posição das macromoléculas na intima celular endotelial.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologia

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