Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 81670451, 81770430), Шанхайской программой восходящих звезд (Грант No 17-A1403000), а также Комитетом по науке науки Шанхайского муниципального правительства (Грант No. 14441903002, 15411963700).

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с экспериментальными протоколами, утвержденными Комитетом по ресурсам животных Шанхайского университета Цзяо Тонг.
1. Перфузия аорты мыши
<ol><li>Кратко, анестезируйте 12-недельных мышей C57BL/6 с интраперитонеальными ?...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

Эндотелий подвергается воздействию многочисленных проатерогенных факторов, включая липиды, воспалительные посредники, и жидкость сдвига стресс1,11,12. Прямое наблюдение эндотелиальных клеток на месте дает особые преимущества для анал?...

Ранние изменения в сосуде в первую очередь инициируются в эндотелии, который функционирует как селективный барьер между кровью и стенкой сосуда с ее межклеточными узкими стыковочными комплексами1. Существенные данные указывают на важную роль для механических эффектов кровотока в модуляции эндотелиальной функции2. Напряжение сдвига жидкости, фрикционная сила, порожденная кровотоком, дифференциально формы эндотелиальной морфологии клеток и функции, в зависимости от конкретных парадигм потока в различных сосудистых участках2,3. Атеросклеротические поражения преимущественно происходят в местах нарушения кровотока (d-потока), таких как кривизны сосудов, разделители потока и ветви точек, по сравнению с регионами постоянного потока (s-flow), такими как прямой сегмент артерии. Таким образом, прямое наблюдение эндотелиальной морфологии и моделей молекулярной экспрессии должно обеспечить важное понимание структурных и функциональных фенотипов эндотелиальных клеток при различных парадигмах потока.
Культурные эндотелиальные клетки не могут выразить фактический фенотип, как они делают in vivo отчасти из-за потери воздействия жидкости сдвига стресс, окружающие цитокинов, и клеток или клеток экстраклеточной матрицы взаимодействий. Чтобы помочь этому, нетронутый эндотелиальный монослой клеток может быть изучен на поперечных участках с использованием классической иммуногистохимии. Однако эндотелиальный монослой настолько тонкий и хрупкий, что его обычно не удается четко наблюдать. Эн лицо иммуногистохимии был использован для наблюдения за внутренней поверхности эндотелия, но является либо сложным или неустойчивым в его результатах, потому что эндотелий легко раздели из основной ткани, или только часть артериальной стенки крыс или кроликов, чьи стены толстые, установлен оснащается4,5.
Мышимодели имеют значительные преимущества перед другими животными во многих отношениях. Здесь мы используем модифицированный метод иммунофлуоресценции для анализа эндотелиальных клеток аортальной арки и грудной аорты в мыши C57BL/6. Такая методика широко используется для изучения эндотелиальной патофизиологии в различных структурах потока и в развитииатеросклероза 6,7,8,9,10. Этот метод позволяет ученым четко наблюдать за всей поверхностью эндотелия и сравнивать экспрессионные модели данного белка в регионах под различными сдвигами жидкости.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

Аномальные изменения в эндотелиальном фенотипе и морфологии считаются первоначальными событиями при патогенезае атеросклероза. Прямое наблюдение за нетронутым инее эндотелием даст ценную информацию для понимания клеточных и молекулярных событий в дисфункциональных эндотелиальных клетках. Здесь мы описываем модифицированную технику окрашивания иммунофлуоресценции en face, которая позволяет ученым получить четкие изображения нетронутой эндотелиальной поверхности и проанализировать модели экспрессии молекул на месте. Метод прост и надежен для наблюдения за всем эндотелиальным монослойом на разных участках аорты. Этот метод может быть перспективным инструментом для понимания патофизиологии атеросклероза, особенно на ранней стадии.

12-недельная мышь C57BL/6 была усыплена и проникнута нормальным сольным раствором, содержащим 40 единиц/мл гепарина, а затем прехиллированной 4% параформида. Мышь аорта была выставлена под рассекающим микроскопом(рисунок1), расчленена и разрезана продольно (...

Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Здесь мы представляем протокол для иммунофлуоресценции окрашивания наблюдать эндотелиальных клеток аорты мыши непосредственно. Этот метод полезен при изучении клеточного и молекулярного фенотипа эндотелиальных клеток в различных структурах потока и в развитии атеросклероза.

Использование En Face иммунофлуоресценции окрашивания для наблюдения сосудистых эндотелиальных клеток непосредственно

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Этот протокол помогает людям анализировать эндотелиальной морфологии клеток, и выражение молекул в регионах, под различными жидкости стрижки стресса. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает прямую оценку сосудистых эндотелиальных клеток при различном стрессе стрижки жидкости. При выполнении этой процедуры ключевыми шагами являются использование свежеприготовленного параформальдегида и выполнение хорошей перфузии.Начните эту процедуру с анестезии 12-недельной мыши C57BL/6, как описано в текстовом протоколе. Подтвердите правильную анестезию, аккуратно щипав хвост. Лента лапы мыши к стопке бумажных полотенец, с клейкой лентой.Поддерживайте кожу мыши типсами и вырежьте кожу ножницами от живота до верхней части грудной клетки. Откройте брюшную полость, ниже грудной клетки, острыми ножницами. Поднимите грудину типсами и разрежьте диафрагму.Затем отрежьте грудную клетку, чтобы разоблачить грудную полость. Отрежьте вена кавы чуть выше печени с ножницами. Давление пронизывает артериальное дерево в течение пяти минут, с предварительно охлажденным нормальным солевым раствором, содержащим 40 единиц на миллилитр гепарина, через левый желудочек, пока легкие и печень не побледнели.Затем пролизавиться с предварительно охлажденным 4%paraformaldehyde в PBS в течение четырех минут. Удалить все мышцы, органы и жир, пока аорта подвергается. Поместите мышь под рассечение микроскопа.Используйте тонкие типсы и пару тонких ножниц, чтобы разоблачить аорту четко под рассекающим микроскопом, и удалить соединительной ткани вдоль аорты, как можно более чисто. Рассекают грудную аорту от сердца до целиакии ствола с помощью тонких ножниц. Поместите аорту в шестициметровую клеточную культуру с помощью PBS.Разрежьте аорту продольно, сначала вдоль меньшей кривой, а затем используйте микросцисоры, чтобы разрезать три ветви аортальной арки, включая инноту, левую общую сонную артерию, и левую подклавианскую артерию вдоль большей кривой до тех пор, пока не будет выполнен прямой сегмент. Permeabilize аорты с 1%polyoxyethylene октил фенил эфир, в PBS в течение 10 минут. Затем блокируйте аорту с 10%нормальной сывороткой козы в трис-буферном солевом растворе, содержащем 2,5%полисорбат 20 в течение одного часа при комнатной температуре, в 12 хорошо клеточной культуре пластины.Далее инкубировать аорту в блокирующий буфер, содержащий пять граммов на миллилитр кролика анти-VCAM1, и пять граммов на миллилитр крысы анти-VE-кадхерин, на ночь при четырех градусах по Цельсию. После полоскания образца три раза с стиральным раствором, применять флуоресценции конъюгированных вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре, сохраняя в темном месте. Промыть еще три раза в стиральном растворе.Counterstain аорты с DAPI в течение 10 минут, сохраняя в темном месте. Затем промыть окрашенные аорты три раза в стиральный раствор. Поместите аорту на крышку скольжения с люменальной поверхности вниз, и переместить его медленно, чтобы антифада монтажа раствор, который ранее был сброшен на крышку скольжения.Аккуратно растянуть аорту, чтобы сохранить образец плоским. Инвертировать крышку скольжения и положить его на стеклянную горку. Позаботьтесь, чтобы избежать пузырьков воздуха между образцом и стеклом.Изучите аорту с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Анализ интенсивности цвета различных каналов из нужной области на изображениях en face, с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus. En лица иммунофторесценции окрашивания изображения сосудистых эндотелиальных клеток из мыши аорты показаны.En лицо иммунофлуоресценции сосудистой клеточной адгезии белка один, и выражение с VE-кадерин в качестве эндотелиального маркера, показаны при различных моделей потока из разных областей мыши аорты. DAPI был также counterstained, чтобы показать ядра клеток для лучшей визуализации. При просмотре стеков под микроскопом эндотелиальные и гладкие мышечные клетки легко отличить по морфологии ядер клеток.Ядра эндотелиальных клеток имеют овальную форму и больше, чем ядра клеток в форме шпинделя. Выражение ВКАМ-1 было более обильным в регионах с нарушенным потоком, при меньшей кривизны арки аорты, по сравнению с регионами под устойчивым потоком, при большей кривизны арки аорты и на грудной аорте. Здесь области меньшей кривизны аорты мыши обозначены как области d-потока, и большая кривизна и грудной клетки.При правильной модификации этот метод может быть также применен к анализу проницаемости сосудов, а также к положению макромолекул в эндотелиальной инима клетке.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Выделение клапанные эндотелиальных клеток

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Трансплантация клеток непосредственно в почках взрослых данио рерио

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Выделение и дифференциация стромальные клетки сосудов в бежевый / Brite клетки

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Прочная 3D рыбу ДНК с использованием меченых зондов непосредственно

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Выделение Мышиный клапана эндотелиальных клеток

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Непрямой иммунофлюоресценции на замороженные Разделы молочной железы мыши

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection оксида азота и супероксид в эндотелиальный слой малонарушенных артериях

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

Простой биопроб для оценки факторов роста эндотелия сосудов

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

Подготовка к зачатию кровеносных сосудов мыши

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...