Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
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Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81670451, 81770430), el Programa Shanghai Rising-Star (Grant No. 17QA1403000), y el Comité de Tecnología Científica del Gobierno Municipal de Shanghai (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Recursos Animales de la Universidad Jiao Tong de Shanghái.
1. Perfusión del ratón aorta
<ol><li>Brevemente, anestesia ratones C57BL/6 de 12 semanas de edad con inyecciones intraperitoneales de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal). Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente la cola. NOTA: Si no se observa ningún movimiento, el animal es...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

El endotelio está expuesto a numerosos factores proaterogénicos, incluyendo lípidos, mediadores inflamatorios, y tensión de cizallamiento fluido1,11,12. La observación directa de las células endoteliales in situ proporciona las ventajas especiales para analizar los cambios en la morfología celular, las uniones intercelulares y los patrones de expresión de moléculas en respuesta a los estímulos de lesión.
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Los primeros cambios en la vasculatura se inician principalmente en el endotelio, que funciona como una barrera selectiva entre la sangre y la pared del vaso con sus complejos de unión hermética intercelular1. La evidencia sustancial apunta a un papel crítico para los efectos mecánicos del flujo sanguíneo en la modulación de la función endotelial2. Tensión de cizallamiento fluido, fuerza de fricción generada por el flujo sanguíneo, da forma diferencial a lamorfología y función celular endotelial, dependiendo de los paradigmas de flujo específicos en diferentes sitios vasculares 2,3. Las lesiones ateroscleróticas ocurren preferentemente en sitios de flujo sanguíneo alterado (flujo d), como curvaturas de vasos, divisores de flujo y puntos de rama, en comparación con regiones de flujo constante (flujo s), como el segmento recto de la arteria. Por lo tanto, la observación directa de la morfología endotelial y los patrones de expresión de moléculas debe proporcionar información importante sobre los fenotipos estructurales y funcionales de las células endoteliales bajo diferentes paradigmas de flujo.
Las células endoteliales cultivadas pueden no expresar el fenotipo real como lo hacen in vivo en parte debido a la pérdida de impacto de tensión de cizallamiento de líquido, citoquinas circundantes e interacciones de matriz celular o celular-extracelular. Para ayudar a esto, la monocapa de células endoteliales intacta se puede estudiar en secciones transversales utilizando inmunohistoquímica clásica. Sin embargo, la monocapa endotelial es tan delgada y frágil que por lo general no se puede observar claramente. En face inmunohistochemistry se ha utilizado para observar la superficie interna del endotelio, pero es complicado o errático en sus resultados porque el endotelio se despoja fácilmente del tejido subyacente, o sólo parte de la pared arterial de ratas o conejos, cuyas paredes son gruesas, está montada4,5.
Los modelos de ratón tienen considerables ventajas sobre otros animales en muchos aspectos. Aquí, empleamos una técnica de inmunofluorescencia en la cara modificada para analizar las células endoteliales del arco aórtico y la aorta torácica en el ratón C57BL/6. Tal técnica ha sido ampliamente utilizada para estudiar la fisiopatología endotelial en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis6,7,8,9,10. Este método permite a los científicos observar claramente toda la superficie del endotelio y comparar los patrones de expresión de una proteína dada en regiones bajo diferentes tensiones de cizallamiento de fluidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

Los cambios aberrantes en el fenotipo endotelial y la morfología se consideran eventos iniciales en la patogénesis de la aterosclerosis. La observación directa del endotelio intacto proporcionará información valiosa para comprender los eventos celulares y moleculares en las células endoteliales disfuncionales. Aquí, describimos una técnica de tinción de inmunofluorescencia en la cara modificada que permite a los científicos obtener imágenes claras de la superficie endotelial intacta y analizar los patrones de expresión de moléculas in situ. El método es simple y confiable para observar toda la monocapa endotelial en diferentes sitios de la aorta. Esta técnica puede ser una herramienta prometedora para entender la fisiopatología de la aterosclerosis, especialmente en una etapa temprana.

Un ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad fue eutanasiado y perfundido con salina normal que contenía 40 unidades/ml de heparina y, entonces, preenfriado 4% paraformaldehyde. La aorta del ratón se expuso bajo un microscopio de disección (Figura1), diseccionada y cortada longitudinalmente (Figura2). En face la tinción de inmunofluorescencia de las células endoteliales vasculares se realizó como se ilustra en <strong class="xfi...

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Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aquí, presentamos un protocolo para la tinción de inmunofluorescencia para observar las células endoteliales de la aorta del ratón directamente. Esta técnica es útil cuando se estudia el fenotipo celular y molecular de las células endoteliales en diferentes patrones de flujo y en el desarrollo de la aterosclerosis.

Uso de la tinción de inmunofluorescencia en la cara para observar directamente las células endoteliales vasculares

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Este protocolo ayuda a las personas a analizar la morfología celular endotelial, y la expresión de moléculas en regiones, bajo diferentes estrés de cizallamiento de fluidos. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una evaluación directa de las células endoteliales vasculares bajo diferentes tensiones de cizallamiento de fluidos. Al realizar este procedimiento, los pasos clave son utilizar paraformaldehído recién preparado y realizar una buena perfusión.Comience este procedimiento con la anestesia de un ratón C57BL/6 de 12 semanas de edad, como se describe en el protocolo de texto. Confirme la anestesia adecuada pellizcando suavemente la cola. Pegue las patas del ratón en una pila de toallas de papel, con cinta adhesiva.Sostenga la piel del ratón con fórceps, y corte la piel con un par de tijeras desde el abdomen hasta la parte superior del tórax. Abra la cavidad abdominal, debajo de la caja torácica, con un par de tijeras afiladas. Levante el esternón con fórceps y corte el diafragma.Luego corte la caja torácica para exponer la cavidad torácica. Corta la vena cava justo encima del hígado con tijeras. Presión perfunde el árbol arterial durante cinco minutos, con solución salina normal pre-enfriada que contiene 40 unidades por mililitro de heparina, a través del ventrículo izquierdo, hasta que los pulmones y el hígado se vuelvan pálidos.Luego perfunda con 4%paraformaldehído pre-enfriado en PBS durante cuatro minutos. Retire todos los músculos, órganos y grasa, hasta que la aorta esté expuesta. Coloque el ratón bajo un microscopio de disección.Utilice fórceps delicados y un par de tijeras delicadas para exponer la aorta claramente bajo un microscopio diseccionador, y retire el tejido conectivo a lo largo de la aorta, de la manera más limpia posible. Diseccionar la aorta torácica del corazón al tronco celíaco con un par de tijeras delicadas. Coloque la aorta en un plato de cultivo celular de seis centímetros, con PBS.Abra la aorta longitudinalmente, primero a lo largo de la curva menor, y luego utilice los microscisores para cortar las tres ramas del arco aórtico, incluyendo el innominado, la carótida común izquierda, y la arteria subclavia izquierda a lo largo de la curva mayor hasta que se cumpla el segmento recto. Permeabilizar la aorta con 1%éter de fenilo de octilo de polioxietileno, en PBS durante 10 minutos. A continuación, bloquee la aorta con un 10% de suero de cabra normal en solución salina tampón que contenga 2,5%polisorbato 20 durante una hora a temperatura ambiente, en una placa de cultivo celular de 12 pozos.A continuación, incubar la aorta en el tampón de bloqueo que contiene cinco gramos por mililitro de conejo anti-VCAM1, y cinco gramos por mililitro rata anti-VE-Cadherin, durante la noche a cuatro grados Celsius. Después de enjuagar la muestra tres veces con solución de lavado, aplicar los anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia durante una hora a temperatura ambiente, manteniéndose en un lugar oscuro. Enjuague otras tres veces en la solución de lavado.Contraataque la aorta con DAPI durante 10 minutos, manteniéndose en un lugar oscuro. A continuación, enjuague la aorta manchada tres veces en la solución de lavado. Coloque la aorta en un resbalón de cubierta con la superficie lumenal hacia abajo, y muévala lentamente a la solución de montaje antifada que se ha caído previamente en el resbalón de la cubierta.Estire suavemente la aorta para mantener la muestra plana. Invierta el resbalón de la cubierta y colótelo en el portaobjetos de vidrio. Tenga cuidado de evitar cualquier burbuja de aire entre la muestra y el vidrio.Examine la aorta con un microscopio confocal de escaneo láser. Analice las intensidades de color de diferentes canales de la región deseada en las imágenes en face, con el software Image-Pro Plus. En la cara se muestran imágenes de tinción de inmunofluorescencia de células endoteliales vasculares de la aorta del ratón.En la inmunofluorescencia facial de la proteína de adhesión de células vasculares uno, y la expresión con VE-Cadherin como un marcador endotelial, se muestran bajo diferentes patrones de flujo de diferentes regiones de la aorta del ratón. DAPI también se contrarrestó para mostrar los núcleos celulares para una mejor visualización. Al mirar a través de las pilas Z bajo el microscopio, las células musculares endoteliales y lisas se pueden distinguir fácilmente por su morfología de núcleos celulares.Los núcleos de células endoteliales tienen forma ovalada, y más grandes que los núcleos de células musculares lisas con forma de husillo. La expresión del VCAM-1 fue más abundante en regiones bajo flujo perturbado, con menor curvatura del arco de la aorta, en comparación con las regiones bajo flujo constante, con mayor curvatura del arco de la aorta, y en la aorta torácica. Aquí las áreas de menor curvatura de una aorta de ratón se indican como áreas de flujo d, y la mayor curvatura y torácica.Con la modificación correcta, esta técnica también se puede aplicar al análisis de la permeabilidad vascular, y la posición de las macromoléculas en la célula endotelial intima.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

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Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Investigación

Biología

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