Name: using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly
Uploaded: 2019-08-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star program (Grant No. 17QA1403000), och Science Technology kommittén för Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).

Alla djurförsök utfördes i enlighet med experimentella protokoll som godkänts av kommittén för djur resurser i Shanghai Jiao Tong University.
1. perfusion av musens aorta
<ol><li>Kortfattat, söva 12-veckors-gamla C57BL/6 möss med intraperitoneala injektioner av natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvikt). Bekräfta ordentlig bedövningsmedel genom att försiktigt klämmande svansen. Anmärkning: om ingen rörelse observeras, djuret är tillräckligt sövda för att starta experime...

<ol>
	<li>Gimbrone, M. A., Garcia-Cardena, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Dysfunction+and+the+Pathobiology+of+Atherosclerosis.">Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).</li><li>Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress-initiated+signaling+and+its+regulation+of+endothelial+function.">Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).</li><li>Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+the+endothelial+transport+barrier.">Shear stress and the endothelial transport barrier.</a> Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).</li><li>Warren, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+production+of+&amp;#34;en+face&amp;#34;+preparations+one+cell+in+thickness.">A method for the production of &amp;#34;en face&amp;#34; preparations one cell in thickness.</a> Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).</li><li>Azuma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+En+face+method+is+useful+to+quantitate+endothelial+damage+in+vivo.">A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Go, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbed+flow+enhances+inflammatory+signaling+and+atherogenesis+by+increasing+thioredoxin-1+level+in+endothelial+cell+nuclei.">Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei.</a> PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).</li><li>Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E., Rao, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=12/15-Lipoxygenase+mediates+high-fat+diet-induced+endothelial+tight+junction+disruption+and+monocyte+transmigration:+a+new+role+for+15(S)-hydroxyeicosatetraenoic+acid+in+endothelial+cell+dysfunction.">12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).</li><li>Liu, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C1q/TNF-related+protein+1+promotes+endothelial+barrier+dysfunction+under+disturbed+flow.">C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).</li><li>Wang, X. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+interacting+protein+promotes+endothelial+cell+inflammation+in+response+to+disturbed+flow+by+increasing+leukocyte+adhesion+and+repressing+Kruppel-like+factor+2.">Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2.</a> Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).</li><li>Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidized+low-density+lipoprotein+and+atherosclerosis+implications+in+antioxidant+therapy.">Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy.</a> The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).</li><li>Stancel, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+CRP,+Atherogenic+LDL,+and+LOX-1+and+Its+Potential+Role+in+the+Pathogenesis+of+Atherosclerosis.">Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis.</a> Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).</li><li>Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Morphology+as+an+Indicator+of+the+Pattern+of+Blood+Flow.">Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).</li></ol>

Endotelet utsätts för många proatherogenic faktorer, inklusive lipider, inflammatoriska mediatorer, och Fluid skjuvning stress1,11,12. Direkt observation av endotelceller på plats ger speciella fördelar för att analysera förändringar i cellmorfologi, intercellulära korsningar, och molekyler uttrycksmönster som svar på skadan stimuli.
Tidigare studier har gett två olika en ansikte immunohis...

De tidiga förändringarna i vasulaturen initieras främst i endotelet, som fungerar som en selektiv barriär mellan blodet och kärlväggen med dess intercellulära snäva av komplex1. Betydande bevis pekar på en kritisk roll för de mekaniska effekterna av blodflödet i modulerande endotelfunktion2. Fluid skjuvning stress, en friktionskraft som genereras av blodflödet, differentially former endotelceller morfologi och funktion, beroende på de specifika flödesparadigmer på olika vaskulära platser2,3. Aterosklerotiska lesioner förekommer företrädesvis på platser av störd blodflöde (d-Flow), såsom fartyg krökningar, flödes avdelare, och gren punkter, jämfört med regioner med stadigt flöde (s-flöde), såsom den raka segment av artären. Därför bör direkt observation av endotelmorfologi och molekyl uttrycksmönster ge viktiga insikter i de strukturella och funktionella fenotyperna av endotelceller under varierande flödes paradigm.
Odlade endotelceller kan inte uttrycka den faktiska fenotyp som de gör in vivo delvis på grund av förlust av påverkan av vätska skjuvning stress, omgivande cytokiner, och cell-cell eller cell-extracellulära matris interaktioner. För att underlätta detta kan den intakt endotelcellmonolayer studeras på tvärgående sektioner med hjälp av klassisk immunohistokemi. Emellertid, den endotelceller enskiktslager är så tunn och bräcklig att det vanligtvis inte kan observeras tydligt. En Face immunohistokemi har använts för att observera den inre ytan av endotelet, men är antingen komplicerat eller oberäkneligt i dess resultat eftersom endotelet är lätt strippad från den underliggande vävnaden, eller bara en del av arteriell vägg av råttor eller kaniner, vars väggar är tjocka, är monterad4,5.
Musmodeller har stora fördelar jämfört med andra djur i många avseenden. Här använder vi en modifierad en Face immunofluorescensteknik för att analysera endotelceller i aortabågen och bröstkorg aorta i C57BL/6 mus. En sådan teknik har använts i stor utsträckning för att studera endotelial patofysiologi i olika flödesmönster och i utvecklingen av åderförkalkning6,7,8,9,10. Denna metod gör det möjligt för forskare att observera hela ytan av endotelet tydligt och att jämföra uttrycksmönster av ett givet protein i regioner under olika vätska skjuvning stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Antifade mountant</td>
			<td style="width:126px;">Servicebio</td>
			<td style="width:134px;">G1401</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F11001-11</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Delicate Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S12003-09</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">F12005-10</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Mciro Spring Scissors</td>
			<td style="width:126px;">RWD Life Science</td>
			<td style="width:134px;">S11001-08</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">M143</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Polysorbate 20 (Tween 20)</td>
			<td style="width:126px;">Amresco</td>
			<td style="width:134px;">0777</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VCAM-1 antibody</td>
			<td style="width:126px;">Abcam</td>
			<td style="width:134px;">ab134047</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">VE-Cadherin antibody</td>
			<td style="width:126px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:134px;">555289</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-31572</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:223px;">Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG</td>
			<td style="width:126px;">invitrogen</td>
			<td style="width:134px;">A-21208</td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laser Scanning Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:134px;"></td>
			<td style="width:174px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using en face immunofluorescence staining to observe vascular endothelial cells directly

Avvikande förändringar i endotelial fenotyp och morfologi anses vara initiala händelser i patogenesen av åderförkalkning. Direkt observation av intakt endotelet kommer att ge värdefull information för att förstå cellulära och molekylära händelser i dysfunktionella endotelceller. Här beskriver vi en modifierad immunofluorescensfärgningsteknik som ger forskarna möjlighet att få tydliga bilder av intakt endotelyta och analysera molekyl uttrycks mönstren på plats. Metoden är enkel och tillförlitlig för att observera hela endotelceller enskiktslager på olika platser i aorta. Denna teknik kan vara ett lovande verktyg för att förstå patofysiologi av åderförkalkning, särskilt i ett tidigt skede.

En 12-veckors gammal C57BL/6 mus var euthanized och parfymera med normal saltlösning som innehåller 40 enheter/mL heparin och sedan, förkyld 4% PARAFORMALDEHYD. Musen aorta exponerades under en dissekera Mikroskop (figur 1), dissekeras, och skära öppna longitudinellt (figur 2). Sv ansikte immunofluorescensfärgning av de vaskulära endotelcellerna utfördes enligt illustrationen i figur 3 och <s...

Watch this Scientific Journal Video about Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly at JoVE.com

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Här presenterar vi ett protokoll för immunofluorescensfärgning att observera endotelcellerna i musens aorta direkt. Denna teknik är användbar när man studerar cellulära och molekylära fenotyp av endotelceller i olika flödesmönster och i utvecklingen av åderförkalkning.

Använda en Face immunofluorescensteknik för att observera vaskulära endotelceller direkt

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Detta protokoll hjälper människor att analysera endotel cell morfologi, och uttrycket av molekyler i regioner, under olika vätska skjuvning stress. Den största fördelen med denna teknik är att det ger en direkt bedömning av vaskulära endotelceller under olika vätskeskjuvning stress. När du utför denna procedur, nyckel steg är att använda nyberedda paraformaldehyd och att utföra en bra perfusion.Börja den här proceduren med anesthetisering av en 12 veckor gammal C57BL/6-mus, som beskrivs i textprotokollet. Bekräfta korrekt anesthetisering genom att försiktigt nypa svansen. Tejpa fast musens tassar på en bunt pappershanddukar, med tejp.Håll upp huden på musen med tuten och skär huden med en sax från buken till toppen av bröstkorgen. Öppna bukhålan, under bröstkorgen, med en vass sax. Lyft bröstbenet med tärnor, och skär membranet.Skär sedan bort bröstkorgen för att exponera brösthålan. Skär av vena cava strax ovanför levern med en sax. Tryck genomsyrar artärträdet i fem minuter, med förkyld normal saltlösning som innehåller 40 enheter per milliliter heparin, genom den vänstra ventrikeln, tills lungorna och levern blir blek.Sedan genomsyras med prekyld 4%paraformaldehyd i PBS i fyra minuter. Ta bort alla muskler, organ, och fett, tills stora kroppspulsådern är utsatt. Placera musen under ett dissekerande mikroskop.Använd känsliga tång och en par delikata saxar för att exponera aorta tydligt under en dissekera mikroskop, och ta bort bindväv längs aorta, så rent som möjligt. Dissekera bröst aorta från hjärtat till celiaki stammen med en par delikat sax. Placera aortan i en sex centimeter cellkultur skålen, med PBS.Skär upp aorta longitudinellt, först längs den mindre kurvan, och använd sedan mikroscissirerna för att skära upp aortabågens tre grenar, inklusive innominate, vänster gemensamma halspulsådern, och den vänstra subklavera artären längs den större kurvan tills det raka segmentet är uppfyllt. Permeabilisera stora stora medel med 1%polyoxyetyloktylfenyleter, i PBS i 10 minuter. Sedan blockera stora kroppspulsådern med 10%normal get serum i tris-buffrad saltlösning som innehåller 2,5%polysorbat 20 under en timme vid rumstemperatur, i en 12 väl cellodling tallrik.Nästa inkubera aorta i den blockerande bufferten som innehåller fem gram per milliliter kanin anti-VCAM1, och fem gram per milliliter råtta anti-VE-Cadherin, över natten vid fyra grader Celsius. Efter sköljning provet tre gånger med tvättlösning, applicera fluorescenskonjugerade sekundära antikroppar i en timme vid rumstemperatur, hålla i en mörk plats. Skölj ytterligare tre gånger i tvättlösningen.Counterstain aorta med DAPI i 10 minuter, hålla i en mörk plats. Skölj sedan den färgade aortan tre gånger i tvättlösning. Placera aorta på en täcksli med lumenalytan nedåt, och flytta den långsamt till antifade monteringslösning som tidigare har tappats på täckslien.Sträck försiktigt aortan för att hålla preparatet plant. Invertera luckan och lägg den på glasglaset. Var noga med att undvika eventuella luftbubblor mellan preparatet och glaset.Undersök aorta med en laser scanning confocal mikroskop. Analysera färgintensiteter av olika kanaler från önskad region i en ansiktsbilderna, med Image-Pro Plus-programvara. En ansikte immunofluorescens färgning bilder av vaskulära endotelceller från musen stora kroppspulsådern visas.En ansikte immunofluorescens av kärlcellen adhesion protein en, och uttryck med VE-Cadherin som en endotel markör, visas under varierande flöde mönster från olika regioner av musen stora kroppspulsådern. DAPI var också counterstained att visa cellen kärnor för bättre visualisering. När du tittar genom Z-stackarna under mikroskopet kan de endotel- och glattmuskelcellerna lätt särskiljas genom sin cellkärnormorfologi.Den endotelcellkärnor är ovala formad, och större än spindeln formade, glatt muskel cell kärnor. Uttryck för VCAM-1 var mer riklig i regioner under störda flöde, vid mindre krökning av aorta bågen, jämfört med regioner under stadigt flöde, vid större krökning av aorta bågen, och vid bröst aorta. Här områden av mindre krökning av en mus aorta anges som d-flöde områden, och den större krökning och bröstkorg.Med rätt modifiering kan denna teknik tillämpas också på analys av vaskulär permeabilitet, och placeringen av makromolekyler i endoteliala cellen intima.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolering av valvulär endotelceller

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Transplantation av celler direkt in i njuren för vuxna Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolering och differentiering av stromal vaskulära celler till beige / Brite celler

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

Robust 3D DNA FISK Använda Direkt märkta prober

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering av murint Ventil Endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirekt immunofluorescens på frysta sektioner av Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection av kväveoxid och superoxid i endotelskiktet intakt artärer

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

En enkel Bioanalys för utvärdering av Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

En ansiktsberedning av musblodfartyg

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...