Name: identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry
Uploaded: 2019-06-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry at JoVE.com

De auteurs erkennen Dr. Barbara K. Felber en Dr. George N. PAVLAKIS voor de HLfB-aanhankelijke cultuur van de National Institutes of Health (NIH) AIDS onderzoek en referentie-reagens programma, afdeling AIDS, Nationaal Instituut voor allergie en infectieuze Ziekten (NIAID), NIH. De auteurs erkennen ook financiële bronnen verstrekt door de NIH, Grants AI042552 en AI029329.

1. celcultuur
<ol><li>Handhaaf hlfb in het gemodificeerde eagle's medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mm L-glutamine en 1 mm natrium pyruvaat binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen. Houd de celculturen bij 37 °C in een bevoficeerde incubator die wordt geleverd met 5% CO2. Passage confluente cellen naar een celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Gooi de celkweek media weg. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutop...

<ol>
	<li>Arizala, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+Localization+of+HIV-1+Rev+Is+Required,+Yet+Insufficient+for+Production+of+Infectious+Viral+Particles.">Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).</li><li>Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+B23+is+an+important+human+factor+for+the+nucleolar+localization+of+the+human+immunodeficiency+virus+protein+Tat.">Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat.</a> Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).</li><li>Szebeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+stimulates+nuclear+import+of+the+HIV-1+Rev+protein+and+NLS-conjugated+albumin.">Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin.</a> Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).</li><li>Truant, R., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arginine-rich+domains+present+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+Tat+and+Rev+function+as+direct+importin+beta-dependent+nuclear+localization+signals.">The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).</li><li>Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+and+functional+diversification+in+the+members+of+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Genetics. 173, 1835-1850 (2006).</li><li>Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> BioEssays. 29, 49-59 (2007).</li><li>Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+nucleophosmin/B23,+a+nucleolar+acidic+protein,+as+a+histone+chaperone.">Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone.</a> FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).</li><li>Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+has+molecular+chaperone+activities.">Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities.</a> Protein Science. 8, 905-912 (1999).</li><li>Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+functional+domains+of+nucleolar+protein+B23.">Mapping the functional domains of nucleolar protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).</li><li>Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+nucleolar+proteins+shuttle+between+nucleus+and+cytoplasm.">Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.</a> Cell. 56, 379-390 (1989).</li><li>Yun, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23+is+a+proliferate+shuttle+protein+associated+with+nuclear+matrix.">Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).</li><li>Savkur, R. S., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+cleavage+in+pre-ribosomal+RNA+byprotein+B23+endoribonuclease.">Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).</li><li>Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+activity+of+nucleolar+protein+B23.">The ribonuclease activity of nucleolar protein B23.</a> Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).</li><li>Grisendi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nucleophosmin+in+embryonic+development+and+tumorigenesis.">Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis.</a> Nature. 437, 147-153 (2005).</li><li>Itahana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+ARF+degrades+B23,+a+nucleolar+protein+involved+in+ribosome+biogenesis+and+cell+proliferation.">Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation.</a> Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).</li><li>Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23,+a+multifunctional+protein+that+can+regulate+apoptosis.">Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 4, 918-923 (2005).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+polyubiquitination+and+degradation+of+the+Arf+tumor+suppressor.">N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor.</a> Genes &amp; Development. 18, 1862-1874 (2004).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf-induced+turnover+of+the+nucleolar+nucleophosmin-associated+SUMO-2/3+protease+Senp3.">Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3.</a> Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).</li><li>Horn, H. F., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer:+guarding+the+guardian.">Cancer: guarding the guardian.</a> Nature. 427, 110-111 (2004).</li><li>Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+and+cancer.">Nucleophosmin and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).</li><li>Dingwall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+cDNA+sequence+reveals+polyglutamic+acid+tracts+and+a+cluster+of+sequences+homologous+to+putative+nuclear+localization+signals.">Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals.</a> The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).</li><li>Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+complex+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+rev+and+nucleolar+B23+proteins:+dissociation+by+the+Rev+response+element.">Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element.</a> Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).</li><li>Valdez, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+of+the+protein+p120.+Interaction+with+translocation+protein+B23.">Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).</li><li>Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C23+interacts+with+B23,+a+putative+nucleolar-localization-signal-binding+protein.">C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein.</a> European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).</li><li>Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+targeting+signal+of+Rex+protein+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+I+specifically+binds+to+nucleolar+shuttle+protein+B-23.">Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).</li><li>Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleolar+protein+B23+with+peptides+related+to+nuclear+localization+signals.">Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals.</a> Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).</li><li>Tsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+interacts+with+Japanese+encephalitis+virus+core+protein+and+participates+in+viral+replication.">Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication.</a> Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).</li><li>Ning, B., Shih, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+localization+of+human+hepatitis+B+virus+capsid+protein.">Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein.</a> Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).</li><li>Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+core+interacts+with+the+host+cell+nucleolar+protein,+nucleophosmin+1.">Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1.</a> Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).</li><li>Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolar+phosphoprotein+B23+interacts+with+hepatitis+delta+antigens+and+modulates+the+hepatitis+delta+virus+RNA+replication.">The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).</li><li>Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+replication+of+hepatitis+delta+virus:+genomic+and+antigenomic+RNAs+associate+with+different+nuclear+bodies.">RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).</li><li>Yang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+nucleolin+and+its+identification+as+a+transcription+repressor.">Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).</li><li>Sarek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+phosphorylation+by+v-cyclin-CDK6+controls+KSHV+latency.">Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).</li></ol>

Massaspectrometrische analyses met vergelijking van Rev-NoLS-mutaties en WT Rev in de aanwezigheid van HIV-1 werden beoordeeld om te begrijpen welke nucleollaire factoren betrokken waren bij de virale replicatiecyclus. Dit zou nucleollaire componenten identificeren die nodig zijn voor virale infectiviteit. Nucleollaire B23 heeft een hoge affiniteit met Rev-NoLS en functies in de nucleollaire lokalisatie van Rev3 en nucleocytoplasmorische transport van Rev-gebonden HIV mRNAs22</su...

De Nucleolus wordt gepostuleerd als de interactie grond van verschillende cellulaire host en virale factoren die nodig zijn voor virale replicatie. De Nucleolus is een complexe structuur onderverdeeld in drie verschillende compartimenten: het fibrillar compartiment, het dichte fibrillar compartiment en het granulaire compartiment. Het HIV-1 rev-eiwit lokaliseert specifiek binnen korrelvormige compartimenten; echter, de reden voor dit lokalisatie patroon is onbekend. In aanwezigheid van éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev mutaties 4, 5 en 6), handhaaft Rev een nucleolar patroon en is eerder aangetoond dat het HIV-1HXB2 replicatie moet redden, maar met een verminderde efficiëntie vergeleken met WT Rev1 . Alle éénpuntmutaties zijn niet in staat om de HIV-1NL4-3 infectieuze cyclus te ondersteunen. In de aanwezigheid van meerdere éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev-NoLS mutaties 2 en 9), is Rev waargenomen om te dispergeren in de Nucleus en het cytoplasma en heeft het niet kunnen redden van HIV-1HXB2 replicatie1. Het doel van deze proteomica studie is het ontcijferen van nucleollaire en niet-nucleollaire cellulaire factoren die betrokken zijn bij de Rev-mediated HIV-1 infectieuze pathway. Rev immunoprecipitatie voorwaarden worden geoptimaliseerd door interactie met de nucleolar B23 fosfoproteïne, die eerder is aangetoond dat het verliezen van interactie met Rev in de aanwezigheid van nucleollaire mutaties.
Rev cellulaire factoren zijn uitgebreid bestudeerd in het verleden; Dit is echter gebeurd bij afwezigheid van virale pathogenese. Een eiwit, in het bijzonder, dat wordt gekenmerkt in deze studie door middel van Rev interactie tijdens HIV-1 replicatie is de nucleolar fosfoprotein B23-ook wel nucleophosmin (NPM), numatrin, of NO38 in amfibieën2,3, 4. B23 wordt uitgedrukt als drie isovormen (NPM1, NPM2, en NPM3)-alle leden van de nucleophosmin/nucleoplasmin nucleaire chaperonne familie5,6. De NPM1 moleculaire chaperonne functies in de juiste assemblage van nucleosomes, in de vorming van eiwitten/nucleïnezuur complexen die betrokken zijn bij chromatine hogere orde structuren7,8, en in de preventie van aggregatie en het verkeerd vouwen van doel eiwitten via een N-terminaal kern domein (residuen 1-120)9. NPM1 functionaliteit strekt zich uit tot ribosoom Genesis door het transport van preribosomale deeltjes tussen de Nucleus en cytoplasma10,11, de verwerking van preribosomale RNA in de interne getranscribeerde spacer sequentie 12,13, en het arresteren van de nucleollaire aggregatie van eiwitten tijdens de ribosomale assemblage14,15. NPM1 is betrokken bij de remming van apoptosis16 en in de stabilisatie van tumor suppressors ARF17,18 en p5319, onthullen zijn dubbele rol als een oncogene factor en tumor suppressor. NPM1 neemt deel aan de cellulaire activiteiten van genoom stabiliteit, centrosoom replicatie, en transcriptie. NPM1 is gevonden in nucleoli tijdens celcyclus Interphase, langs de chromosomale periferie tijdens mitose, en in prenucleolar lichamen (PNB) aan het einde van de mitose. NPM2 en NPM3 zijn niet zo goed bestudeerd als NPM1, die ondergaat veranderde expressieniveaus tijdens maligniteiten20.
NPM1 is gedocumenteerd in de nucleocytoplasmische pendelen van verschillende nucleaire/nucleollaire eiwitten via een interne NES en nls9,21 en werd eerder gerapporteerd aan de nucleaire import van HIV-1 tat en Rev eiwitten rijden. In aanwezigheid van B23-bindende-Domain-β-galactosidase fusie eiwitten, TAT mislocaliseert binnen het cytoplasma en verliest trans activatie activiteit; Dit toont een sterke affiniteit van TAT voor B232. Een andere studie vestigde een Rev/B23 stabiel complex in de afwezigheid van RRE-bevattende Mrna's. In aanwezigheid van RRE mRNA, Rev dissocieert van B23 en bindt bij voorkeur aan de HIV RRE, wat leidt tot de verplaatsing van B2322. Het is niet bekend waar, op het subnucleaire niveau, TAT trans activatie en de Rev Exchange process van B23 voor HIV mRNA plaatsvinden. Beide eiwitten zijn gepostuleerd om gelijktijdig via B23-interactie de Nucleolus binnen te gaan. De betrokkenheid van andere cellulaire eiwitten van de host in de HIV-nucleollaire pathway wordt verwacht. De in dit Proteomica-onderzoek beschreven methoden zullen helpen om het samenspel van de Nucleolus met gastheer cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1-pathogenese te verhelden.
Het Proteomica onderzoek werd geïnitieerd door de uitdrukking van Rev nols single-point mutaties (M4, M5 en M6) en meerdere arginine substituties (m2 en M9) voor HIV-1HXB2 productie. In dit model is een HeLa-cellijn dat stabiel de Rev-deficiënte HIV-1HXB2 (hlfb) UITDRUKT met WT rev en Rev nucleolar mutaties met een flag tag op het 3 ' einde. De aanwezigheid van WT Rev zorgt ervoor dat virale replicatie plaatsvindt in de HLfB-cultuur, in vergelijking met Rev-NoLS-mutaties die geen Rev-deficiëntie (m2 en M9) redden, of toestaan dat virale replicatie plaatsvindt, maar niet zo efficiënt als WT Rev (M4, M5 en M6)1. Het celllysaat wordt 48 h later verzameld na virale proliferatie in aanwezigheid van Rev expressie en onderworpen aan immunoprecipitatie met een lysisbuffer geoptimaliseerd voor rev/B23 interactie. Lysis buffer optimalisatie met behulp van variërende zoutconcentraties wordt beschreven, en eiwit elutie methoden voor HIV-1 rev worden vergeleken en geanalyseerd in zilver gebeitst of Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gels. De eerste proteomica-benadering omvat de directe analyse van een geeluteerde steekproef van geuite WT Rev, m2, M6 en M9 door massaspectrometrie met tandem. Een tweede benadering waarbij de eluaten van WT Rev, M4, M5 en M6 een gel-extractieproces onderging, wordt vergeleken met de eerste benadering. Peptide affiniteit met Rev-NoLS mutaties in vergelijking met WT Rev wordt geanalyseerd en de eiwit identificatie waarschijnlijkheid weergegeven. Deze benaderingen onthullen mogelijke factoren (nucleolar en nonnucleolar) die deelnemen aan HIV-1 mRNA transport en splicing met Rev tijdens HIV-1 replicatie. In het algemeen zijn de beschreven cellysis, IP-en elutie-omstandigheden van toepassing op virale eiwitten die van belang zijn voor het begrijpen van cellulaire factoren van de host die infectieuze trajecten activeren en reguleren. Dit is ook van toepassing op de studie van cellulaire gastheerfactoren die nodig zijn voor de persistentie van verschillende ziekte modellen. In dit proteomica-model is HIV-1 rev-IP geoptimaliseerd voor B23-interactie om nucleollaire factoren te verhelden die betrokken zijn bij nucleocytoplasmorische pendelen activiteit en HIV-1 mRNA-binding. Bovendien kunnen cellijnen die stabiel zijn voor infectieuze ziekte modellen die een tekort hebben aan belangrijke eiwitten van belang, worden ontwikkeld, vergelijkbaar met de HLfB-cellijn, om infectieuze trajecten van belang te bestuderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A38S-212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acrylamide:Bisacrylamide</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ANTI-Flag M2 affinity gel</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BioMax MS film</td>
			<td style="width:321px;">Carestream</td>
			<td style="width:119px;">8294985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL</td>
			<td style="width:321px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">B23 mouse monoclonal IgG</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-47725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Carnation non-fat powdered milk</td>
			<td style="width:321px;">Nestle</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">179693PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">C18IonKey nanoTile column</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td>186003763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 100-mm TC-treated culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1539714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">1 x DPBS</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-030-CVRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ECL Estern blotting substrate</td>
			<td style="width:321px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A409-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FBS</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">GelCode blue stain reagent</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glycerol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">goat-anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:321px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">KimWipe delicate task wiper</td>
			<td style="width:321px;">Kimberly Clark Professional</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Methanol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">NanoAcuity UPLC</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24600df</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">15-mL Polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:321px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Purified BSA</td>
			<td style="width:321px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PVDF&#160; Western blotting membrane</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">10 x TBS</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2471500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TEMED</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610880edu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Triton X-100 detergent solution</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizaic source</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-051-CIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Tween 20</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Synapt G2 mass spectrometer</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:321px;">Tisch Scientific</td>
			<td>10427813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry

De HIV-1 infectieuze cyclus vereist virale eiwit interacties met gastheerfactoren om virale replicatie te vergemakkelijken, verpakking, en vrijlating. De infectieuze cyclus verder vereist de vorming van virale/gastheer eiwitcomplexen met HIV-1-RNA te reguleren van de splicing en het inschakelen van nucleocytoplasmorische transport. Het HIV-1 rev-eiwit bereikt de nucleaire export van HIV-1 Mrna's door middel van multimerisatie met intronic CIS-acteer doelen-het Rev Response element (RRE). Een nucleolar lokalisatie signaal (NoLS) bestaat binnen het COOH-eindpunt van de Rev arginine-Rich motief (ARM), waardoor de accumulatie van Rev/RRE complexen in de Nucleolus. Nucleollaire factoren worden gespeculeerd ter ondersteuning van de HIV-1-infectieuze cyclus door middel van verschillende andere functies naast het bemedieren van mRNA-onafhankelijke nucleaire export en splicing. We beschrijven een immunoprecipitatie methode van wild-type (WT) Rev in vergelijking met Rev nucleolar mutaties (deletie en single-point Rev-NoLS mutaties) in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. Nucleollaire factoren die betrokken zijn bij het nucleocytoplasminezuur transport (nucleophosmin B23 en nucleolin C23), evenals cellulaire splicing factoren, verliezen interactie met Rev in de aanwezigheid van Rev-NoLS mutaties. Verschillende andere nucleollaire factoren, zoals snoRNA C/D Box 58, zijn geïdentificeerd om interactie met Rev-mutaties te verliezen, maar hun functie in de HIV-1-replicatiecyclus blijft onbekend. De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van deze aanpak voor de identificatie van virale/host-nucleollaire factoren die de HIV-1-infectieuze cyclus behouden. De begrippen die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziekte modellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen.

Rev-NoLS single-en multiple-Point arginine mutaties, overeenkomend met een verscheidenheid van subcellulaire lokalisatie patronen, werden onderzocht in hun vermogen om te communiceren met cellulaire host factoren in vergelijking met WT Rev. WT Rev-3'vlag en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de HLfB-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit het totale cellysaat en gekleurd met Zilvervlek reagens. Rev-NoLS-3'flag is detecteerbaar (ongeveer 18 kDa) in drie verschillende lysisbuffer condities met verschillend...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Hier beschrijven we Rev immunoprecipitatie in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor de identificatie van nucleollaire factoren die betrokken zijn bij de HIV-1-infectieuze cyclus en zijn van toepassing op andere ziekte modellen voor de karakterisering van onderbestudeerde trajecten.

Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Ons protocol biedt alternatieve methoden voor de identificatie en karakterisering van virale, nucleolar, en niet-nucleolar host factoren die de HIV-1 infectieuze cyclus te handhaven. De concepten die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziektemodellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen. Probleemoplossingstechnieken worden beschreven voor wijziging van andere eiwitmodellen.Het aantonen van de procedure zal worden Haitang Li en Pritsana Chomchan, wetenschappers in de moleculaire en cellulaire biologie afdeling van het Beckman Research Institute in de stad van de hoop, en Roger Moore, leden van de Stad van Hoop Proteomics Core en de afdeling Moleculaire Immunologie. Begin met het kweken van een HLfB stabiel uitdrukken HeLa cellijn cultuur in drie, 100-millimeter cultuur platen om een twee-keer-10-to-the-six-cells-per-milliliter dichtheid. Wanneer de cellen de juiste concentratie bereiken, meng 20 microgram plasmide met de Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag mutatie van belang met 1,76 milliliter TE 79/10 in een 15-milliliter buis, gevolgd door de toevoeging van 240 microliter van twee-molaire calciumchloride, met grondige mengen.Breng vervolgens de inhoud van de buis dropwise over in een nieuwe buis van 15 milliliter met twee milliliter 2x HBS, gevolgd door het mengen op een vortexmachine. Na 30 minuten bij kamertemperatuur, vortex de neerslag. Voeg een milliliter van de suspensie dropwise aan elk van de drie, 100-millimeter HLfB cultuurplaten, terwijl zachtjes wervelen het medium.Na een incubatie van zes uur in de celkweek incubator, vervang het transfectiemengsel door 10 milliliter vers kweekmedium en breng de cellen nog 42 uur terug naar de couveuse. 48 uur na de transfectie, plaats elke plaat op een bed van ijs binnen een biohazard niveau twee weefsel cultuur kap. Verwijder de celkweekmedia en spoel de cellen voorzichtig af met 10 milliliter gepehed PBS, zonder de cellagen te verstoren.Gooi de PBS na het spoelen van de cellen weg. Behandel vervolgens de cellen met één milliliter lysebuffer, aangevuld met proteaseremmercocktail, per bord. Het kantelen van de platen om de cellen te verzamelen in een zwembad, gebruik maken van een cel schraper om handmatig verstoren van de lagen.Met behulp van een micropipet van 1.000 microliter, pool het lysaat van elke plaat in een geprefroerde, 15-milliliter buis voor een 15 minuten durende incubatie op ijs, met vortexing om de vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, aliquot de lysates in drie, 1,5-milliliter microcentrifuge buizen, en het verzamelen van de lysates door centrifugatie. Breng de supernatant over in een nieuwe buis van 15 milliliter en verkrijg de virale eiwitlysaatconcentratie, zoals beschreven in het manuscript.Voor co-immuunsylistatie van de Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag, spoel 25 microliters van M2 affiniteit gel kralen drie keer met 500 microliters van verse lyse buffer, aangevuld met proteaseremmer cocktail, per wasbeurt. Voer deze stappen uit in een koude kamer of met de reagentia op ijs. Voeg na de laatste spoeling een concentratie van één milligram per milliliter van viraal eiwitlysaat toe aan de gespoelde kralen in een eindvolume van vijf milliliter lysisbuffer.Broed de reactie drie uur lang bij vier graden Celsius met rotatie. Aan het einde van de incubatie, pellet de virale eiwit lysaat-geconjugated kralen door centrifugatie. Verzamel de supernatant voor het meten van de post-immunoprecipitatie lysaat eiwitconcentratie.Zie het manuscript voor de instructies voor de opslag van monsters. Voeg 750 microliter lysebuffer toe aan de virale eiwitgeconjugeerde kraalkorrel, breng de kralen over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en was de kralen vijf minuten op een rotator bij vier graden Celsius. Verzamel de kralen door centrifugatie voor nog eens twee wasbeurten op de rotator, zoals net aangetoond.Gebruik na de laatste wasbeurt een beknelde, lange gelbelastingtip om eventuele sporen van lysebuffer uit het kraal-coimmununoprecipitatiecomplex te verwijderen. Resuspend de kralen in 55 microliter van 2x laadbuffer. Kook vervolgens het monster 10 minuten op 95 graden Celsius.Laad 25 microliter eluate op een westerse vlek gel en een Coomassie vlekken SDS-PAGE gel. Na voltooiing van SDS-PAGE gel elektroforese, spoel de gel drie keer in 25 milliliter ultrazuiver water gedurende 15 minuten. Voeg na de laatste wasbeurt 100 milliliter Coomassie vlekreagens toe aan de gel.Zie het manuscript voor het volledige kleuringsprotocol. Voor de vertering van de gelbanden gebruikt u eerst een schoon scheermesje om de gelbanden van de gehele baan van de gel, die elke mutatie vertegenwoordigt, in ongeveer 5 millimeter kubussen te snijden. Plaats elke band in een schone, 0,5-milliliter microcentrifuge buis.Bedek de banden twee keer met 100 millimolar ammoniumbicarbonaat in een één-op-één acetonitrile-naar-water oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten per wasbeurt. Droog vervolgens de gelstukken gedurende vijf minuten in een vacuümcentrifuge. Om de eiwitten te verminderen, bedek de gedroogde gelstukken met 10-millimolar dithiothreitol in 100-millimolar ammoniumbicarbonaat voor een incubatie van een uur bij 56 graden Celsius, gevolgd door alkylation in 100-millimolar iododoacetamide in water gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker.Vervolgens krimpen en reswell de gel stukken twee keer met acetonitril, gevolgd door 100-millimolar ammonium bicarbonaat, beide met zachte schudden bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na de tweede reswelling, droog de gel stukken gedurende vijf minuten in een vacuüm centrifuge. Zwellen de gel stukken met 50 nanogram per microliter van sequencing-grade gemodificeerde trypsine in 100-millimolar ammonium bicarbonaat.Bedek na vijf minuten de gelstukken met 100 millimolar ammoniumbicarbonaat en laat ze volledig weer goed zwellen, waardoor extra 100-millimolar ammonium bicarbonaat wordt toegevoegd, zodat de gezwollen gelstukken volledig bedekt zijn. Vervolgens, incubeer de gel stukken 's nachts op 37 graden Celsius, het stoppen van de reactie met 1/10 van het volume van de monsters met 10% mierenzuur in water de volgende ochtend, en het verzamelen van de supernatant van elke buis. Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag is detecteerbaar onder drie verschillende lyse buffer voorwaarden die verschillende concentraties natriumchloride.B23 is ook detecteerbaar in lysisbuffer met de lagere zoutconcentratie, nauwelijks detecteerbaar in lysisbuffer met de medium zoutconcentratie en niet detecteerbaar in lysebuffer met een hoge zoutconcentratie. B23 detectie is optimaal in lysis buffer met de lage natriumchloride concentratie met wild-type Rev drie-prime vlag en verliest affiniteit met Rev nucleolar lokalisatie signaal M1 drie-prime vlag. B23 affiniteit met wild-type Rev drie-prime vlag neemt ook af met een hogere zoutconcentratie, en de pcDNA negatieve controle levert geen niet-specifieke immunodetetie na immunoprecipitatie onder beide lyse buffer voorwaarden.Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag is het meest detecteerbaar na elutie door het koken in 2x monster laden buffer, terwijl B23 is detecteerbaar onder zowel de 37-en 95-graden Celsius monster buffer incubatie voorwaarden. Na immunoprecipitatie en zilvervlekken, zoals aangetoond, zijn de wild-type Rev en Rev nucleolar lokalisatiesignalen M2, M6 en M9 detecteerbaar bij 18 kilodaltons. Banden die overeenkomen met B23-eiwit worden ook waargenomen bij de 37-kilodaltonmarker.Kleuring met Coomassie reagens toont verder de detecteerbaarheid van Rev nucleolar lokalisatie signaal drie-prime vlag in de aanwezigheid en afwezigheid van mutaties op 18 kilodaltons. Gebruik zoveel mogelijk controles, zowel positief als negatief, als nodig is voor verwijzingen die betrekking hebben op uw ziektemodel tijdens het probleemoplossings- en screeningsproces voor mogelijke bindende factoren. Alle verwijdering en single-point mutaties kunnen worden onderzocht op dominant-negatieve activiteit door middel van multimerisatie met wild-type Rev en gebruikt bij de arrestatie van HIV-1 replicatie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Specifieke markering van de HIV-1 positieve cellen met behulp van een Rev-afhankelijke lentivirale vector uitdrukken van de Green Fluorescent Protein

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro uncoating van HIV-1 Kernen

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nieuwe tools om regulatoire T-cellen van HIV-1-geïnfecteerde individuen Expand

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Conformationele Evaluatie van HIV-1 Trimere envelop glycoproteïnen met een cel-gebaseerde ELISA test

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Elektroforese (NAAM) Assay Hiermee kan de snelle identificatie van HIV-1 nucleocapsid Remmers

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolatie van exosomen uit het plasma van HIV-1 positieve personen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...