Name: identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry
Uploaded: 2019-06-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry at JoVE.com

המחברים מכירים את ד ר ברברה ק. פלבר וד ר ג'ורג ' נ. פאוולקיס עבור התרבות החסיד של ה-HLfB שמספקת המכון הלאומי לבריאות (NIH) מחקר והתייחסות תוכנית מגיב, חטיבת האיידס, המכון הלאומי לאלרגיה וזיהומיות מחלות (NIAID), NIH. המחברים מכירים גם במקורות פיננסיים המסופקים על ידי NIH, מענקים AI042552 ו-AI029329.

1. תרבית תאים
<ol><li>לשמור HLfB ב בינונית שונה של מדיום הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום העובר העוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 1 mM נתרן פירובט בתוך רקמות-תרבות מטופלים 100 מ"מ לוחות. לשמור על תרביות תאים ב 37 ° c בתוך מחולל לחות שסופקו עם 5% CO2. המעבר מקשר תאים לצפיפות תאים של 1 x 106 תאים/mL.</li>
	<li>מחק את מד?...

<ol>
	<li>Arizala, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+Localization+of+HIV-1+Rev+Is+Required,+Yet+Insufficient+for+Production+of+Infectious+Viral+Particles.">Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).</li><li>Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+B23+is+an+important+human+factor+for+the+nucleolar+localization+of+the+human+immunodeficiency+virus+protein+Tat.">Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat.</a> Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).</li><li>Szebeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+stimulates+nuclear+import+of+the+HIV-1+Rev+protein+and+NLS-conjugated+albumin.">Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin.</a> Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).</li><li>Truant, R., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arginine-rich+domains+present+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+Tat+and+Rev+function+as+direct+importin+beta-dependent+nuclear+localization+signals.">The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).</li><li>Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+and+functional+diversification+in+the+members+of+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Genetics. 173, 1835-1850 (2006).</li><li>Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> BioEssays. 29, 49-59 (2007).</li><li>Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+nucleophosmin/B23,+a+nucleolar+acidic+protein,+as+a+histone+chaperone.">Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone.</a> FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).</li><li>Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+has+molecular+chaperone+activities.">Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities.</a> Protein Science. 8, 905-912 (1999).</li><li>Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+functional+domains+of+nucleolar+protein+B23.">Mapping the functional domains of nucleolar protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).</li><li>Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+nucleolar+proteins+shuttle+between+nucleus+and+cytoplasm.">Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.</a> Cell. 56, 379-390 (1989).</li><li>Yun, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23+is+a+proliferate+shuttle+protein+associated+with+nuclear+matrix.">Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).</li><li>Savkur, R. S., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+cleavage+in+pre-ribosomal+RNA+byprotein+B23+endoribonuclease.">Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).</li><li>Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+activity+of+nucleolar+protein+B23.">The ribonuclease activity of nucleolar protein B23.</a> Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).</li><li>Grisendi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nucleophosmin+in+embryonic+development+and+tumorigenesis.">Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis.</a> Nature. 437, 147-153 (2005).</li><li>Itahana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+ARF+degrades+B23,+a+nucleolar+protein+involved+in+ribosome+biogenesis+and+cell+proliferation.">Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation.</a> Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).</li><li>Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23,+a+multifunctional+protein+that+can+regulate+apoptosis.">Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 4, 918-923 (2005).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+polyubiquitination+and+degradation+of+the+Arf+tumor+suppressor.">N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor.</a> Genes &amp; Development. 18, 1862-1874 (2004).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf-induced+turnover+of+the+nucleolar+nucleophosmin-associated+SUMO-2/3+protease+Senp3.">Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3.</a> Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).</li><li>Horn, H. F., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer:+guarding+the+guardian.">Cancer: guarding the guardian.</a> Nature. 427, 110-111 (2004).</li><li>Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+and+cancer.">Nucleophosmin and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).</li><li>Dingwall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+cDNA+sequence+reveals+polyglutamic+acid+tracts+and+a+cluster+of+sequences+homologous+to+putative+nuclear+localization+signals.">Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals.</a> The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).</li><li>Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+complex+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+rev+and+nucleolar+B23+proteins:+dissociation+by+the+Rev+response+element.">Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element.</a> Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).</li><li>Valdez, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+of+the+protein+p120.+Interaction+with+translocation+protein+B23.">Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).</li><li>Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C23+interacts+with+B23,+a+putative+nucleolar-localization-signal-binding+protein.">C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein.</a> European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).</li><li>Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+targeting+signal+of+Rex+protein+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+I+specifically+binds+to+nucleolar+shuttle+protein+B-23.">Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).</li><li>Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleolar+protein+B23+with+peptides+related+to+nuclear+localization+signals.">Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals.</a> Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).</li><li>Tsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+interacts+with+Japanese+encephalitis+virus+core+protein+and+participates+in+viral+replication.">Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication.</a> Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).</li><li>Ning, B., Shih, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+localization+of+human+hepatitis+B+virus+capsid+protein.">Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein.</a> Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).</li><li>Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+core+interacts+with+the+host+cell+nucleolar+protein,+nucleophosmin+1.">Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1.</a> Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).</li><li>Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolar+phosphoprotein+B23+interacts+with+hepatitis+delta+antigens+and+modulates+the+hepatitis+delta+virus+RNA+replication.">The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).</li><li>Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+replication+of+hepatitis+delta+virus:+genomic+and+antigenomic+RNAs+associate+with+different+nuclear+bodies.">RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).</li><li>Yang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+nucleolin+and+its+identification+as+a+transcription+repressor.">Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).</li><li>Sarek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+phosphorylation+by+v-cyclin-CDK6+controls+KSHV+latency.">Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).</li></ol>

מנתח ספקטרומטר המסה השוואת מוטציות Rev-NoLS ו-WT Rev בנוכחות HIV-1 העריכו להבין גורמים נוקלאוולאר מעורב מחזור שכפול נגיפי. זה יזהה את רכיבי הנוקלאוולאר הדרושים לנגועים בנגיף. הנוקלאוולאר B23 יש זיקה גבוהה Rev-NoLS ופונקציות בלוקליזציה נוקלאואוליאר של Rev3 והובלה נוקלאוציטוטופלסמטי של מאוג...

הנוקלאוולוס שוכן כשטח האינטראקציה של מגוון מארח הסלולר והגורמים הנגיפים הדרושים לשכפול נגיפי. הנוקלאוולוס הוא מבנה מורכב החולק לשלושה תאים שונים: תא fibrillar, תא fibrillar צפוף, והתא הגרגירים. החלבון HIV-1 הפוך מכיל במיוחד בתוך תאים גרגירים; עם זאת, הסיבה לתבנית הלוקליזציה אינה ידועה. בנוכחות של מוטציות חד הנקודה בתוך רצף NoLS (מוטציות Rev 4, 5, ו 6), Rev שומר על דפוס נוקלאוולאר והוכח בעבר להציל HIV-1HXB2 שכפול, עם זאת, עם יעילות מופחתת לעומת WT Rev1 . כל המוטציות של נקודה אחת אינן מאפשרות לקיים את המחזור הזיהומיות של HIV-1NL4-3 . בנוכחות מוטציות מרובות נקודה אחת בתוך הרצף NoLS (מוטציות Rev-NoLS 2 ו -9), Rev כבר נצפתה להתפזר לאורך הגרעין הציטופלסמה ולא הצליח להציל HIV-1HXB2 שכפול1. המטרה של מחקר זה פרוטאומניקס היא לפענח נוקלאוולאר, כמו גם גורמים סלולריים nonnucleolar מעורב במסלול Rev-מתווך HIV-1 מדבקת. התנאים Rev immunoprecipitation ממוטבים באמצעות אינטראקציה עם נוקלאוולאר B23 פוספופפרוטאין, אשר בעבר הוכח לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות נוקלאוקולאר.
Rev הגורמים הסלולריים נחקרו בהרחבה בעבר; עם זאת, זה נעשה בהעדר פתוגנזה נגיפית. חלבון אחד, במיוחד, כי הוא מאופיין במחקר זה באמצעות הפוך אינטראקציה במהלך שכפול HIV-1 הוא נוקלאוולאר פוספהוופפרוטאין B23-נקרא גם נואופהוסמרין (npm), numatrin, או NO38 דו חיים2,3, 4. B23 מתבטא כשלוש איזוforms (NPM1, NPM2 וNPM3)-כל חברי המשפחה הגרעינית/נואופלמיסמין משפחת מלווה בנשק גרעיני5,6. המלווה המולקולרי NPM1 פונקציות בהרכבה נאותה של נוקלאוטיזומים, בהקמת מתחמי חומצות חלבון/גרעין המעורבים במבנים מסדר גבוה כרומטין7,8, ובמניעת צבירה ו קיפול חלבונים של יעד דרך מתחם ליבה N-terminal (שאריות 1-120)9. NPM1 פונקציונליות מרחיב הריבוכמה בראשית דרך התחבורה של חלקיקים preriboזומתיים בין הגרעין לציטופלסמה10,11, עיבוד של preriboזומא ברצף החלל הפנימי של מועתק 12,13, ומעצר את צבירת הנוקלאוולאר של חלבונים במהלך מכלול הריבוזומיום14,15. NPM1 הוא מעורב עיכוב של אפופטוזיס16 ו בייצוב של הגידול דכאי arf17,18 ו p5319, חשיפת תפקידה הכפול כגורם אונגניים ומדכא הגידול. NPM1 משתתפת בפעילות התאית של יציבות הגנום, שכפול הסנטרוכמה ותמלול. NPM1 נמצא נוקלאופולי במהלך המחזור הפנימי של מחזור התא, לאורך הפריפריה הרומוזומלית במהלך mitosis, ו ב prenucleolar גופים (PNB) בתום מיטוזיס. NPM2 ו NPM3 אינם למדו כמו NPM1, אשר עובר רמות ביטוי משתנה במהלך ממאירות20.
NPM1 מתועדת המעבר נוקלאוציטופטומיק של חלבונים גרעיניים/נוקלאוולאר שונים דרך נס פנימי ו-NLS9,21 בעבר דווחה לכונן את היבוא הגרעיני של HIV-1 תאת והפוך חלבונים. בנוכחות של B23-הדומיין-β-גלטוסידאז היתוך חלבונים, תאת מאחרבתוך הציטופלסמה ומאבדת פעילות הפעלה; זה מדגים אהדה חזקה של תאת עבור B232. מחקר נוסף הקים מתחם יציב Rev/B23 בהעדר של mRNAs המכיל את הקובץ. בנוכחות של בעל mRNA, Rev הנתק מ B23 ונקשר בעדיפות ל-HIV עם, המוביל לעקירה של B2322. זה לא ידוע איפה, ברמה הגרעינית תת, תאת ההפעלה ואת תהליך המרת Rev של B23 עבור HIV mRNA להתרחש. שני החלבונים מוצדדים להיכנס לנוקלאוולוס בו זמנית באמצעות B23 אינטראקציה. מעורבות של חלבונים סלולריים אחרים מארחים בנתיב הנוקלאוולאר של HIV צפוי. השיטות המתוארות בחקירה הפרוטסטנטית הזאת תסייע להבהיר את הגומלין של הנוקלאוולוס עם גורמים סלולאריים מארחים המעורבים במהלך הפתוגנזה HIV-1.
החקירה פרוטאומיקס הופעל באמצעות הביטוי של Rev nols מוטציות חד הנקודה (M4, M5, ו M6) והחלפות ארגינין מרובים (M2 ו-M9) עבור HIV-1HXB2 הייצור. במודל זה, קו של תא של הלה ביטוי באופן מופתי Rev-1HXB2 (hlfb) הוא מנוכר עם WT rev ומוטציות הפוך הכולל תג דגל בסוף 3 '. הנוכחות של WT Rev יאפשר שכפול ויראלי להתרחש בתרבות HLfB, בהשוואה מוטציות Rev-NoLS כי לא להציל מחסור Rev (M2 ו M9), או לאפשר שכפול נגיפי להתרחש אבל לא ביעילות כמו WT Rev (M4, M5, ו M6)1. ליפוסט התא נאסף 48 h מאוחר יותר לאחר התפשטות ויראלי בנוכחות Rev הבעה ונתון immunoprecipitation עם מאגר לפירוק ממוטב עבור האינטראקציה Rev/B23. מיטוב מאגר לליזה באמצעות ריכוזי מלח משתנה מתואר, ושיטות החלבון של HIV-1 Rev מושווים ונותחו בכסף מוכתם או Coomassie מוכתם SDS-דף ג ' לים. הגישה הראשונה פרוטקוממיקס כרוכה בניתוח ישיר של דגימת שלווה מבוטא WT הפוך, M2, M6, ו M9 על-ידי טנדם ספקטרומטר מסה. הגישה השנייה שבה האלוטים של WT Rev, M4, M5, ו M6 עברו תהליך החילוץ ג'ל הוא לעומת הגישה הראשונה. פפטיד זיקה כדי Rev-NoLS מוטציות בהשוואה WT Rev מנותח ואת ההסתברות זיהוי חלבון מוצג. גישות אלה חושפים גורמים פוטנציאליים (נוקלאוקולאר ו-nonnucleolar) המשתתפים בתחבורה HIV-1 mRNA ושחבור עם Rev במהלך שכפול HIV-1. באופן כללי, פירוק התא, IP, ותנאי הימנעות מתוארים חלים על חלבונים ויראלי של עניין להבנת גורמים סלולריים מארחים המפעילים ומווסת מסלולים זיהומיות. הדבר חל גם על חקר גורמי מארח סלולריים הנדרשים להתמדה של דגמי מחלות שונות. במודל זה פרוטאומניקס, HIV-1 Rev IP ממוטב עבור B23 אינטראקציה כדי להבהיר גורמים נוקלאואוליאר מעורב בפעילות שיוט נוקלאוצילסמטי ו-HIV-1 mRNA מחייב. בנוסף, קווי התא המבטא באופן בלתי נשכח דגמי מחלות זיהומיות כי הם חסרים חלבונים מפתח של עניין ניתן לפתח, בדומה לקו התאים HLfB, כדי ללמוד מסלולים זיהומיות של עניין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A38S-212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acrylamide:Bisacrylamide</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ANTI-Flag M2 affinity gel</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BioMax MS film</td>
			<td style="width:321px;">Carestream</td>
			<td style="width:119px;">8294985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL</td>
			<td style="width:321px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">B23 mouse monoclonal IgG</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-47725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Carnation non-fat powdered milk</td>
			<td style="width:321px;">Nestle</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">179693PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">C18IonKey nanoTile column</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td>186003763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 100-mm TC-treated culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1539714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">1 x DPBS</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-030-CVRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ECL Estern blotting substrate</td>
			<td style="width:321px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A409-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FBS</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">GelCode blue stain reagent</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glycerol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">goat-anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:321px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">KimWipe delicate task wiper</td>
			<td style="width:321px;">Kimberly Clark Professional</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Methanol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">NanoAcuity UPLC</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24600df</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">15-mL Polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:321px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Purified BSA</td>
			<td style="width:321px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PVDF&#160; Western blotting membrane</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">10 x TBS</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2471500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TEMED</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610880edu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Triton X-100 detergent solution</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizaic source</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-051-CIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Tween 20</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Synapt G2 mass spectrometer</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:321px;">Tisch Scientific</td>
			<td>10427813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry

מחזור הזיהומיות HIV-1 דורש אינטראקציות חלבון ויראליות עם גורמים מארחים כדי להקל על שכפול נגיפי, אריזה ושחרור. המחזור הזיהומיות מצריך היווצרות של מכלולי חלבון מארח ויראלי עם ה-HIV-1 RNA כדי לווסת את החבור ולאפשר הובלה באמצעות נוקלאוציטוטופלסמטי. ה-HIV-1 הפוך חלבון משיגה את היצוא הגרעיני של HIV-1 mRNAs באמצעות multimerization עם מטרות משחק של האחים הנוטרוניים-אלמנט התגובה Rev (בלבד). אות הלוקליזציה של נוקלאוולאר (NoLS) קיים בתוך COOH-הטרמינוס של הrev arginine עשיר מוטיב (זרוע), המאפשר הצטברות של מתחמי Rev/בעלי-מערכות בנוקלאוולוס. גורמי הנוקלאוולאר הם העריכו לתמוך מחזור זיהומיות HIV-1 באמצעות פונקציות אחרות שונות בנוסף ל-mRNA-עצמאי היצוא הגרעיני שחבור. אנו מתארים שיטה immunoprecipitation של פראי-סוג (WT) Rev בהשוואה מוטציות הפוך נוקלאוולאר (מחיקה ונקודה אחת Rev-NoLS מוטציות) בנוכחות של HIV-1 שכפול עבור ספקטרומטריה המסה. הגורמים הנוקלאופילים מעורבים בתחבורה הנוקלאוציטוטופלסמטי (נוקלאואופלסין B23 ונוקלאוולין C23), כמו גם גורמי שחבור סלולריים, לאבד אינטראקציה עם Rev בנוכחות של מוטציות Rev-NoLS. גורמים שונים של נוקלאוולאר, כגון מ58, מזוהים לאבד אינטראקציה עם מוטציות Rev, אך תפקידם במחזור השכפול של HIV-1 נותרו לא ידועים. התוצאות המוצגות כאן להפגין את השימוש בגישה זו לזיהוי של נגיפי/מארח הגורמים הנוקלאוולמאר השומרים על מחזור זיהומיות HIV-1. המושגים המשמשים בגישה זו חלים על מודלים ויראליות ומחלות אחרים המחייבים אפיון של מסלולים בעלי מחקר חסר.

Rev-nols יחיד ומספר נקודות מוטציות ארגינין, המתאים למגוון דפוסי לוקליזציה subcellular, נבדקו ביכולתם לתקשר עם גורמים מארחים סלולריים לעומת wt rev. wt rev-3דגל pcdna-דגל וקטור הביעו ביטוי בתרבות HLfB. מכלולי חלבון עובדו מפני התאים האולטימטיביים ומוכתמים בצבע כסף מגיב. Rev-NoLS-3דגל הוא לזיהוי (כ 18 kDa) בשלושה תנ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry at JoVE.com

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

כאן אנו מתארים Rev immunoprecipitation בנוכחות של שכפול HIV-1 עבור ספקטרומטריה המסה. ניתן להשתמש בשיטות המתוארות לזיהוי גורמי נוקלאוולאר המעורבים במחזור הזיהומיות של HIV-1, וחלים על מודלים אחרים של מחלות לאפיון מסלולים בעלי מחקר.

זיהוי של גורמי הנוקלאוולאר במהלך שכפול HIV-1 באמצעות Rev Immunoprecipitation וספקטרומטר מסה

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

הפרוטוקול שלנו מספק שיטות חלופיות לזיהוי ואפיון של גורמים מארחים ויראליים, גרעינים ולא גרעיניים המשמורים על מחזור הזיהום HIV-1. המושגים המשמשים בגישה זו חלים על מודלים ויראליים ומחלות אחרים הדורשים אפיון מסלולים לא מוצהרים. טכניקות לפתרון בעיות מתוארות לשינוי במודלים אחרים של חלבונים.הדגמת ההליך תהיה Haitang Li ו Pritsana Chomchan, מדענים במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית במכון המחקר בקמן בעיר התקווה, ורוג'ר מור, חברי ליבת פרוטומיקה עיר התקווה והמחלקה לאימונולוגיה מולקולרית. התחל בגידול HLfB המבטא באופן הדוק את תרבות קו התאים של HeLa בשלושה, 100 מילימטרים של צלחות תרבות לצפיפות כפולה של 10 עד שישה תאים למיליליטר. כאשר התאים מגיעים לריכוז המתאים, מערבבים 20 מיקרוגרם של פלסמיד המכילים את לוקליזציה נוקליולרית Rev אות מוטציה דגל שלוש ראשי של עניין עם 1.76 מיליליטר של TE 79/10 בצינור 15 מיליליטר, ואחריו תוספת של 240 microliters של סידן טוחנת, עם ערבוב יסודי.לאחר מכן, להעביר את התוכן של הצינור dropwise לתוך צינור חדש 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של 2x HBS, ואחריו ערבוב על מכונת מערבולת. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, מערבולת המשקעים. מוסיפים מיליליטר אחד של ההשעיה dropwise לכל אחד משלושת, 100 מילימטר HLfB צלחות תרבות תוך מערבולת בעדינות את המדיום.לאחר אינקובציה של שש שעות באינקובטור תרבות התא, החלף את תערובת ההמרה ב-10 מיליליטר של מדיום תרבות טרי, והחזר את התאים לחממה למשך 42 שעות נוספות. 48 שעות לאחר ההטעה, מניחים כל צלחת על מצע קרח בתוך מכסה המנוע של תרבות הרקמות ברמה 2. הסר את מדיית תא התרבות, ולשטוף בעדינות את התאים עם 10 מיליליטר של PBS prechilled, מבלי לשבש את שכבות התא.השלך את ה- PBS לאחר שטיפה של התאים. לאחר מכן, לטפל בתאים עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה, בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז, לכל צלחת. הטיית הלוחות כדי לאסוף את התאים לתוך בריכה, להשתמש מגרד תא לשבש באופן ידני את השכבות.באמצעות מיקרופיפט 1,000 מיקרוליטר, בריכת lysate מכל צלחת לתוך צינור prechilled, 15 מיליליטר עבור דגירה של 15 דקות על קרח, עם מערבולת כל חמש דקות. בסוף הדגירה, aliquot את lysates לתוך שלושה, 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, ולאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה. מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש של 15 מיליליטר, ומשיגים את ריכוז החלבון הוויראלי, כמתואר בכתב היד.עבור coimmunoprecipitation של לוקליזציה נוקליולר Rev אות שלושה ראשים דגל, לשטוף 25 microliters של חנוזי ג'ל זיקה M2 שלוש פעמים עם 500 microliters של חיץ תיזה טרי, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז, לכל לשטוף. בצע שלבים אלה בחדר קר או עם reagents על קרח. לאחר שטיפה האחרונה, מוסיפים ריכוז של מיליגרם למיליליטר של חלבון ויראלי ליסנט לחרוזים שטוף בנפח סופי של חמישה מיליליטר של חיץ תיזה.הדגירה את התגובה במשך שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב. בסוף הדגירה, גלולה את החלבון הנגיפי lysate-נדנוד חרוזים על ידי צנטריפוגה. לאסוף את supernatant למדידה של ריכוז חלבון lysate לאחר immunoprecipitation.עיין בכתב היד לקבלת הוראות אחסון לדוגמה. מוסיפים 750 מיקרוליטרים של חיץ תמוגה לכדור חרוזים ססיד ליסנט חלבון ויראלי, מעבירים את חרוזים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ולשטוף את חרוזים על מסובב במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאסוף את חרוזים על ידי צנטריפוגה עבור שתי שטיפות נוספות על המסובב, כפי שהוכח רק.לאחר הכביסה האחרונה, השתמשו בקצה צבט, ארוך וטעון ג'ל כדי להסיר עקבות של מאגר תמיסת תמיסה ממתחם חרוז-coimmununoprecipitation. תן שימוש חוזר ב-55 מיקרוליטרים של חיץ טעינה של פי 2. לאחר מכן, להרתיח את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.טען 25 מיקרוליטרים של eluate על ג'ל כתם מערבי אחד וג'ל SDS-PAGE מכתים קומאסי אחד. לאחר השלמת אלקטרופורזה ג'ל SDS-PAGE, לשטוף את הג'ל שלוש פעמים ב 25 מיליליטר של מים אולטרה-חוץ במשך 15 דקות. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים 100 מיליליטר של רגנט כתם קומאסי על הג'ל.ראה את כתב היד לפרוטוקול הכתמים המלא. לעיכול רצועות הג'ל, יש להשתמש תחילה בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את רצועות הג'ל מכל נתיב הג'ל, המייצג כל מוטציה, לקוביות של כחמישה מילימטרים. מניחים כל רצועה בצינור מיקרוצנטריפוג נקי של 0.5 מיליליטר.מכסים את הרצועות פעמיים עם 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט בתסומה של אחד לאחד אצטוניטריל למים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לכל שטיפה. לאחר מכן, לייבש את חתיכות ג'ל במשך חמש דקות בצנטריפוגה ואקום. כדי להפחית את החלבונים, לכסות את חתיכות ג'ל מיובש עם 10-מילימול dithiothreitol ב 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט עבור דגירה של שעה אחת ב 56 מעלות צלזיוס, ואחריו אלקילציה ב 100 מילימולאר iodoacetamide במים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר מכן, לכווץ מחדש את חתיכות ג'ל פעמיים עם אצטוניטריל, ואחריו 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט, שניהם עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר ההתייבשות השנייה, ייבשו את חתיכות הג'ל במשך חמש דקות בצנטריפוגה ואקום. להתנפח חתיכות ג'ל עם 50 ננוגרם למיקרוליטר של טריפסין שונה כיתה רצף ב 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט.לאחר חמש דקות, מכסים את חתיכות הג'ל עם 100 מילימולר אמוניום ביקרבונט, ולאפשר להם לחזור לחלוטין, הוספת 100 מילימולר נוסף אמוניום ביקרבונט כך חתיכות ג'ל נפוח מכוסים לחלוטין. לאחר מכן, הדגירה חתיכות ג'ל לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לעצור את התגובה עם 1/10 של נפח הדגימות עם 10% חומצה formic במים למחרת בבוקר, ולאסוף את supernatant מכל צינור. אות לוקליזציה של נוקליולרית של Rev ניתן לגילוי תחת שלושה תנאי מאגר תיזה שונים המכילים ריכוזים שונים של נתרן כלורי.B23 ניתן לגילוי גם במאגר תזה המכיל את ריכוז המלח התחתון, בקושי ניתן לגילוי במאגר תזה המכיל את ריכוז המלח הבינוני, ובלתי ניתן לגילוי במאגר תזה המכיל ריכוז מלח גבוה. זיהוי B23 הוא אופטימלי במאגר תיזה המכיל את ריכוז נתרן כלוריד נמוך עם סוג פראי Rev שלושה ראש דגל ומאבד זיקה עם אות לוקליזציה נוקליולר Rev M1 שלושה ראשים דגל. זיקה B23 עם סוג פראי Rev שלושה ראש הדגל גם פוחתת עם ריכוז מלח גבוה יותר, ואת השליטה השלילית pcDNA אינו מניב immunodetection לא ספציפי לאחר immunoprecipitation בשני תנאי מאגר תזה.אות לוקליזציה של נוקליולר של Rev דגל תלת-ראשי ניתן לגילוי ביותר לאחר אלוטציה באמצעות רתיחה במאגר טעינה לדוגמה של 2x, בעוד ש- B23 ניתן לזיהוי הן בתנאי הדגירה של מאגר מדגם 37 ו- 95 מעלות צלזיוס. לאחר immunoprecipitation וכתמי כסף, כפי שהוכח, סוג פראי Rev ו Rev לוקליזציה אותות M2, M6, ו M9 ניתנים לגילוי ב 18 קילודלטונים. להקות המתאימות לחלבון B23 נצפו גם בסמן 37 קילודלטון.כתמים עם רגנט קומאסי מדגים עוד יותר את יכולת האיתור של לוקליזציה נוקליולרית Rev אות דגל שלושה ראש בנוכחות והיעדר מוטציות ב 18 קילודלטונים. השתמש בפקדים רבים, חיוביים ושליליים, לפי הצורך עבור הפניות הנוגעות למודל המחלה שלך במהלך תהליך פתרון הבעיות וההקרנה עבור גורמים מחייבים פוטנציאליים. כל מוטציות מחיקה ונקודה אחת ניתן לבחון עבור פעילות דומיננטית שלילית באמצעות multimerization עם Rev מסוג פראי מנוצל במעצר של HIV-1 שכפול.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

ב Uncoating במבחנה של HIV-1 ליבות

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...