Name: identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry
Uploaded: 2019-06-26T12:30:00
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Gli autori riconoscono Dr. Barbara K. Felber e Dr. George N. Pavlakis per la cultura aderente HLfB fornito dal National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Infectious Malattie (NIAID), NIH. Gli autori riconoscono anche le fonti finanziarie fornite dal NIH, Grants AI042552 e AI029329.

1. Cultura cellulare
<ol><li>Mantenere l'HLfB nel mezzo modificato di Dulbecco Eagle's Aquila (DMEM) integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamine e pirvate di sodio da 1 mM all'interno di piastre da 100 mm trattate con coltura tissutale. Mantenere le colture cellulari a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata fornita con 5% di CO2. Passare le cellule confluenti a una densità di cellule di 1 x 106 cellule / mL.</li>
	<li>Eliminare i supporti di coltura cellulare. Scia...

<ol>
	<li>Arizala, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+Localization+of+HIV-1+Rev+Is+Required,+Yet+Insufficient+for+Production+of+Infectious+Viral+Particles.">Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).</li><li>Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+B23+is+an+important+human+factor+for+the+nucleolar+localization+of+the+human+immunodeficiency+virus+protein+Tat.">Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat.</a> Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).</li><li>Szebeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+stimulates+nuclear+import+of+the+HIV-1+Rev+protein+and+NLS-conjugated+albumin.">Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin.</a> Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).</li><li>Truant, R., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arginine-rich+domains+present+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+Tat+and+Rev+function+as+direct+importin+beta-dependent+nuclear+localization+signals.">The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).</li><li>Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+and+functional+diversification+in+the+members+of+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Genetics. 173, 1835-1850 (2006).</li><li>Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> BioEssays. 29, 49-59 (2007).</li><li>Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+nucleophosmin/B23,+a+nucleolar+acidic+protein,+as+a+histone+chaperone.">Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone.</a> FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).</li><li>Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+has+molecular+chaperone+activities.">Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities.</a> Protein Science. 8, 905-912 (1999).</li><li>Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+functional+domains+of+nucleolar+protein+B23.">Mapping the functional domains of nucleolar protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).</li><li>Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+nucleolar+proteins+shuttle+between+nucleus+and+cytoplasm.">Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.</a> Cell. 56, 379-390 (1989).</li><li>Yun, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23+is+a+proliferate+shuttle+protein+associated+with+nuclear+matrix.">Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).</li><li>Savkur, R. S., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+cleavage+in+pre-ribosomal+RNA+byprotein+B23+endoribonuclease.">Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).</li><li>Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+activity+of+nucleolar+protein+B23.">The ribonuclease activity of nucleolar protein B23.</a> Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).</li><li>Grisendi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nucleophosmin+in+embryonic+development+and+tumorigenesis.">Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis.</a> Nature. 437, 147-153 (2005).</li><li>Itahana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+ARF+degrades+B23,+a+nucleolar+protein+involved+in+ribosome+biogenesis+and+cell+proliferation.">Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation.</a> Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).</li><li>Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23,+a+multifunctional+protein+that+can+regulate+apoptosis.">Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 4, 918-923 (2005).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+polyubiquitination+and+degradation+of+the+Arf+tumor+suppressor.">N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor.</a> Genes &amp; Development. 18, 1862-1874 (2004).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf-induced+turnover+of+the+nucleolar+nucleophosmin-associated+SUMO-2/3+protease+Senp3.">Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3.</a> Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).</li><li>Horn, H. F., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer:+guarding+the+guardian.">Cancer: guarding the guardian.</a> Nature. 427, 110-111 (2004).</li><li>Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+and+cancer.">Nucleophosmin and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).</li><li>Dingwall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+cDNA+sequence+reveals+polyglutamic+acid+tracts+and+a+cluster+of+sequences+homologous+to+putative+nuclear+localization+signals.">Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals.</a> The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).</li><li>Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+complex+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+rev+and+nucleolar+B23+proteins:+dissociation+by+the+Rev+response+element.">Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element.</a> Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).</li><li>Valdez, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+of+the+protein+p120.+Interaction+with+translocation+protein+B23.">Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).</li><li>Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C23+interacts+with+B23,+a+putative+nucleolar-localization-signal-binding+protein.">C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein.</a> European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).</li><li>Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+targeting+signal+of+Rex+protein+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+I+specifically+binds+to+nucleolar+shuttle+protein+B-23.">Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).</li><li>Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleolar+protein+B23+with+peptides+related+to+nuclear+localization+signals.">Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals.</a> Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).</li><li>Tsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+interacts+with+Japanese+encephalitis+virus+core+protein+and+participates+in+viral+replication.">Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication.</a> Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).</li><li>Ning, B., Shih, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+localization+of+human+hepatitis+B+virus+capsid+protein.">Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein.</a> Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).</li><li>Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+core+interacts+with+the+host+cell+nucleolar+protein,+nucleophosmin+1.">Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1.</a> Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).</li><li>Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolar+phosphoprotein+B23+interacts+with+hepatitis+delta+antigens+and+modulates+the+hepatitis+delta+virus+RNA+replication.">The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).</li><li>Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+replication+of+hepatitis+delta+virus:+genomic+and+antigenomic+RNAs+associate+with+different+nuclear+bodies.">RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).</li><li>Yang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+nucleolin+and+its+identification+as+a+transcription+repressor.">Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).</li><li>Sarek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+phosphorylation+by+v-cyclin-CDK6+controls+KSHV+latency.">Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).</li></ol>

Sono state valutate le analisi spettrometriche di massa che confrontano le mutazioni Rev-NoLS e WT Rev in presenza di HIV-1 per comprendere i fattori nucleolari coinvolti nel ciclo di replicazione virale. Ciò identificherebbe i componenti nucleolari necessari per l'infettività virale. Nucleolar B23 ha un'alta affinità con Rev-NoLS e funziona nella localizzazione nucleolare del Rev3 e del trasporto nucleocitoplasmatico di mRNA HIV legati al Rev222. L'affinità di B23 con ...

Il nucleolo è postulato come il terreno di interazione di vari fattori cellulari e virali necessari per la replicazione virale. Il nucleolo è una struttura complessa suddivisa in tre diversi comparti: il compartimento fibrillare, il compartimento fibrillare denso e il compartimento granulare. La proteina HIV-1 Rev si localizza specificamente all'interno di compartimenti granulari; Tuttavia, il motivo di questo modello di localizzazione è sconosciuto. In presenza di mutazioni a punto singolo all'interno della sequenza NoLS (mutazioni Rev 4, 5 e 6), Rev mantiene un modello nucleolare e in precedenza ha dimostrato di salvare la replica HIV-1HXB2, tuttavia, con una minore efficienza rispetto al WT Rev1 . Tutte le mutazioni monopunto non sono in grado di sostenere il ciclo infettivo dell'HIV-1NL4-3. In presenza di più mutazioni monopunto all'interno della sequenza NoLS (mutazioni Rev-NoLS 2 e 9), Rev è stato osservato per disperdersi in tutto il nucleo e il citoplasma e non è stato in grado di salvare la replica HIV-1HXB2 1. L'obiettivo di questo studio proteomica è quello di decifrare i fattori nucleolari e cellulari non nucleolari coinvolti nella via infettiva HIV-1 mediata da Rev. Le condizioni di immunoprecipitazioni del rev sono ottimizzate attraverso l'interazione con il nucleolare B23 fosforproteina, che in precedenza ha dimostrato di perdere l'interazione con Rev in presenza di mutazioni nucleolare.
I fattori cellulari Rev sono stati ampiamente studiati in passato; tuttavia, questo è stato fatto in assenza di patogenesi virale. Una proteina, in particolare, che è caratterizzata in questo studio attraverso l'interazione del rev durante la replicazione HIV-1 è la fosforproteina nucleolare B23 - chiamata anche nucleofosmina (NPM), numatrina o NO38 negli anfibi2,3, 4. B23 è espresso come tre isoformi (NPM1, NPM2 e NPM3) - tutti membri della famiglia chaperone nucleare nucleophosmin/nucleoplasmin5,6. Lo chaperone molecolare NPM1 funziona nell'assemblaggio corretto dei nucleosomi, nella formazione di complessi di acido proteico/nucleico coinvolti nelle strutture di ordine superiore della cromatina7,8,e nella prevenzione dell'aggregazione e misfolding delle proteine bersaglio attraverso un dominio di base N-terminale (residui 1-120)9. La funzionalità NPM1 si estende alla genesi del ribosoma attraverso il trasporto di particelle preribosomiche tra il nucleo e il citoplasma10,11, l'elaborazione dell'RNA preribosomico nella sequenza distanziale trascritto internamente 12,13, e arrestando l'aggregazione nucleolare delle proteine durante l'assemblaggio ribosomiale14,15. NPM1 è implicato nell'inibizione dell'apoptosi16 e nella stabilizzazione dei soppressori tumorali ARF17,18 e p5319, rivelando il suo duplice ruolo come fattore oncogenico e soppressore tumorale. NPM1 partecipa alle attività cellulari di stabilità del genoma, replicazione centrosome e trascrizione. NPM1 si trova nei nucleoli durante l'interfase del ciclo cellulare, lungo la periferia cromosomica durante la mitosi, e nei corpi prenucleolari (PNB) alla conclusione della mitosi. NPM2 e NPM3 non sono ben studiati come NPM1, che subisce livelli di espressione alterati durante la malignità20.
NPM1 è documentato nell'shuttling nucleocitoplasmatica di varie proteine nucleari/nucleolare attraverso un NES interno e NLS9,21 ed è stato precedentemente segnalato per guidare l'importazione nucleare di HIV-1 Tat e Rev proteine. In presenza di proteine di fusione B23-binding-dominio-z-galactosidasi, Tat si smarrisce all'interno del citoplasma e perde l'attività di trasattivazione; questo dimostra una forte affinità di Tat per B232. Un altro studio ha stabilito un complesso stabile Rev/B23 in assenza di mRNA contenenti RRE. In presenza di mRNA RRE, Rev dissocia da B23 e si lega preferibilmente all'HIV RRE, portando allo spostamento di B2322. Non è noto dove, a livello subnucleare, si verificano la trasattivazione tat e il processo di scambio rev di B23 per l'HIV mRNA. Entrambe le proteine sono postulate per entrare contemporaneamente nel nucleolo attraverso l'interazione B23. Si prevede il coinvolgimento di altre proteine cellulari ospiti nella via nucleolare dell'HIV. I metodi descritti in questa indagine proteomica aiuteranno a chiarire l'interazione del nucleolo con i fattori cellulari ospiti coinvolti durante la patogenesi HIV-1.
L'indagine proteomica è stata avviata attraverso l'espressione delle mutazioni a punto singolo del Rev NoLS (M4, M5 e M6) e delle sostituzioni multiple di arginine (M2 e M9) per la produzione HIV-1hXB2. In questo modello, una linea cellulare HeLa che esprime stabilmente HIV-1HXB2 (HLfB) carente di Rev viene trasinata da mutazioni nucleolari WT Rev e Rev contenenti un tag flag alla fine del 3'. La presenza di WT Rev permetterà la replicazione virale nella cultura HLfB, rispetto alle mutazioni Rev-NoLS che non salvano la carenza di Rev (M2 e M9), o consentirà la replicazione virale, ma non in modo efficiente come WT Rev (M4, M5 e M6)1. Il lisato cellulare viene raccolto 48 h più tardi dopo la proliferazione virale in presenza di espressione Rev e sottoposto a immunoprecipitazioni con un buffer di lissi è ottimizzato per l'interazione Rev/B23. Viene descritta l'ottimizzazione del buffer di lisi utilizzando concentrazioni di sale variabili e i metodi di eluizione delle proteine per HIV-1 Rev vengono confrontati e analizzati in gel SDS-PAGE macchiati d'argento o macchiati di Coomassie. Il primo approccio proteomico prevede l'analisi diretta di un campione eluito da Espressi WT Rev, M2, M6, e M9 da spettrometria di massa tandem. Un secondo approccio con il quale gli eluati di WT Rev, M4, M5 e M6 sono stati sottoposti a un processo di estrazione gel viene confrontato con il primo approccio. Viene analizzata l'affinità peptide alle mutazioni Rev-NoLS rispetto a WT Rev e viene visualizzata la probabilità di identificazione delle proteine. Questi approcci rivelano potenziali fattori (nucleolari e nonnucleolari) che partecipano al trasporto e giunzione di mRNA HIV-1 con Rev durante la replicazione dell'HIV-1. Nel complesso, le condizioni di lisi cellulare, IP, e di eluizione descritte sono applicabili alle proteine virali di interesse per la comprensione dei fattori cellulari ospiti che attivano e regolano le vie infettive. Questo è applicabile anche allo studio dei fattori dell'ospite cellulare necessari per la persistenza di vari modelli di malattia. In questo modello proteomico, HIV-1 Rev IP è ottimizzato per l'interazione B23 per chiarire i fattori nucleolari coinvolti nell'attività di shuttling nucleocitoplasmatica e nell'attacco mRNA HIV-1. Inoltre, possono essere sviluppate linee cellulari che esprimano stabilmente modelli di malattie infettive che sono carenti per le proteine chiave di interesse, simile alla linea cellulare HLfB, per studiare le vie infettive di interesse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A38S-212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acrylamide:Bisacrylamide</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ANTI-Flag M2 affinity gel</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BioMax MS film</td>
			<td style="width:321px;">Carestream</td>
			<td style="width:119px;">8294985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL</td>
			<td style="width:321px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">B23 mouse monoclonal IgG</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-47725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Carnation non-fat powdered milk</td>
			<td style="width:321px;">Nestle</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">179693PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">C18IonKey nanoTile column</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td>186003763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 100-mm TC-treated culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1539714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">1 x DPBS</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-030-CVRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ECL Estern blotting substrate</td>
			<td style="width:321px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A409-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FBS</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">GelCode blue stain reagent</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glycerol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">goat-anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:321px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">KimWipe delicate task wiper</td>
			<td style="width:321px;">Kimberly Clark Professional</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Methanol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">NanoAcuity UPLC</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24600df</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">15-mL Polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:321px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Purified BSA</td>
			<td style="width:321px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PVDF&#160; Western blotting membrane</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">10 x TBS</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2471500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TEMED</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610880edu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Triton X-100 detergent solution</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizaic source</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-051-CIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Tween 20</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Synapt G2 mass spectrometer</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:321px;">Tisch Scientific</td>
			<td>10427813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry

Il ciclo infettivo HIV-1 richiede interazioni virali delle proteine con i fattori dell'ospite per facilitare la replicazione, l'imballaggio e il rilascio virali. Il ciclo infettivo richiede ulteriormente la formazione di complessi proteici virali/ospiti con RNA HIV-1 per regolare lo splicing e consentire il trasporto nucleocitoplasmatico. La proteina HIV-1 Rev realizza l'esportazione nucleare di mRNA HIV-1 attraverso la multimerizzazione con obiettivi cis-recidivi intronici - l'elemento di risposta Rev (RRE). Un segnale di localizzazione nucleolare (NoLS) esiste all'interno del COOH-terminus del motivo ricco di arginina Rev (ARM), permettendo l'accumulo di complessi Rev/RRE nel nucleolo. I fattori nucleolari sono ipotizzati per sostenere il ciclo infettivo dell'HIV-1 attraverso varie altre funzioni oltre a mediare l'esportazione nucleare indipendente dall'mRNA e lo splicing. Descriviamo un metodo di immunoprecipitazioni del Rev di tipo selvaggio (WT) rispetto alle mutazioni nucleolare Rev (mutazioni Rev nucleolari e Rev-NoLS) in presenza di replicazione HIV-1 per la spettrometria di massa. Fattori nucleolari implicati nel trasporto nucleocitoplasmatico (nucleophosmin B23 e nucleolin C23), così come i fattori di giunzione cellulare, perdono l'interazione con Rev in presenza di mutazioni Rev-NoLS. Vari altri fattori nucleolari, come la casella SnoRNA C/D 58, sono identificati per perdere l'interazione con le mutazioni Rev, ma la loro funzione nel ciclo di replicazione dell'HIV-1 rimane sconosciuta. I risultati qui presentati dimostrano l'uso di questo approccio per l'identificazione di fattori nucleolari virali/ospiti che mantengono il ciclo infettivo dell'HIV-1. I concetti utilizzati in questo approccio sono applicabili ad altri modelli di malattie e virali che richiedono la caratterizzazione di percorsi poco studiati.

Le mutazioni di arginina monopunto e multipunto Rev-NoLS, corrispondenti a una varietà di modelli di localizzazione subcellulare, sono state esaminate nellaloro capacità di interagire con i fattori dell'host cellulare rispetto a WT Rev. vettore sono stati espressi nella cultura HLfB. I complessi proteici sono stati elaborati dal lisa totale delle cellule e macchiati con reagente di macchie d'argento. Rev-NoLS-3'flag è rilevabile (circa 18 kDa) in tre diverse condizioni del buffer di lisi contenenti varie conc...

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Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Qui descriviamo l'immunoprecipitazioni Rev in presenza di replicazione HIV-1 per la spettrometria di massa. I metodi descritti possono essere utilizzati per l'identificazione dei fattori nucleolari coinvolti nel ciclo infettivo dell'HIV-1 e sono applicabili ad altri modelli di malattia per la caratterizzazione di percorsi poco studiati.

Identificazione dei fattori nucleolari durante la replicazione dell'HIV-1 attraverso l'immunoprecipitazioni del rev e la spettrometria di massa

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Il nostro protocollo fornisce metodi alternativi per l'identificazione e la caratterizzazione di fattori ospiti virali, nucleolari e non nucleolari che mantengono il ciclo infettivo dell'HIV-1. I concetti utilizzati in questo approccio sono applicabili ad altri modelli virali e di malattia che richiedono la caratterizzazione di percorsi sottostudiati. Le tecniche di risoluzione dei problemi sono descritte per la modifica ad altri modelli proteici.A dimostrare la procedura saranno Haitang Li e Pritsana Chomchan, scienziati del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare del Beckman Research Institute presso la Città della Speranza, e Roger Moore, membri del Centro proteomica della città della speranza e del Dipartimento di Immunologia Molecolare. Inizia coltivando un HLfB che esprime stabilmente la coltura della linea cellulare HeLa in tre lastre di coltura di 100 millimetri a una densità due volte 10-to-the-six-cells-per-millilitro. Quando le cellule raggiungono la concentrazione appropriata, mescolare 20 microgrammi di plasmide contenente il segnale di localizzazione nucleolare Rev mutazione a tre bandiere di interesse con 1,76 millilitri di TE 79/10 in un tubo da 15 millilitri, seguito dall'aggiunta di 240 microlitri di cloruro di calcio bimolare, con miscelazione accurata.Successivamente, trasferire il contenuto del tubo dropwise in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente due millilitri di 2x HBS, seguito dalla miscelazione su una macchina a vortice. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, vortice le precipitazioni. Aggiungere un millilitro della sospensione dropwise a ciascuna delle tre piastre di coltura HLfB da 100 millimetri mentre si ruota delicatamente il mezzo.Dopo un'incubazione di sei ore nell'incubatore di coltura cellulare, sostituire la miscela di trasfezione con 10 millilitri di terreno di coltura fresco e riportare le cellule nell'incubatrice per altre 42 ore. 48 ore dopo la trasfezione, posizionare ogni piatto su un letto di ghiaccio all'interno di una cappa di coltura tissutale di livello due a rischio biologico. Rimuovere il supporto di coltura cellulare e sciacquare delicatamente le cellule con 10 millilitri di PBS prechilled, senza interrompere gli strati cellulari.Scartare il PBS dopo aver risciacquato le cellule. Successivamente, trattare le cellule con un millilitro di tampone di lisi, integrato con cocktail inibitore della proteasi, per piatto. Inclinando le piastre per raccogliere le celle in una piscina, utilizzare un raschietto per interrompere manualmente gli strati.Utilizzando una micropipetta da 1.000 microlitri, mettere in comune il lisato da ogni piastra in un tubo prechilled da 15 millilitri per un'incubazione di 15 minuti sul ghiaccio, con vortice ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, l'aliquota lista in tre tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri e raccoglie i lisati mediante centrifugazione. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 15 millilitri e ottenere la concentrazione di lisato proteico virale, come descritto nel manoscritto.Per la coimmunoprecipitazione del segnale di localizzazione nucleolare Rev bandiera a tre numeri primi, sciacquare tre volte 25 microlitri di perline di gel di affinità M2 con 500 microlitri di tampone di lysis fresco, integrati con cocktail inibitore della proteasi, per lavaggio. Eseguire questi passaggi in una stanza fredda o con i reagenti sul ghiaccio. Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere una concentrazione di un milligrammo per millilitro di glisato proteico virale alle perline risciacquate in un volume finale di cinque millilitri di tampone di lysis.Incubare la reazione per tre ore a quattro gradi Celsius con rotazione. Al termine dell'incubazione, pellettare le perline di lisato proteico virale coniugate per centrifugazione. Raccogliere il supernatante per la misurazione della concentrazione proteica del lisato post-immunoprecipitazione.Vedi il manoscritto per istruzioni per la conservazione dei campioni. Aggiungere 750 microlitri di tampone di lysis al pellet di perline coniugato con proteine virali, trasferire le perline in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e lavare le perline su un rotatore per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere le perline per centrifugazione per altri due lavaggi sul rotatore, come appena dimostrato.Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una punta pizzicata, lunga e gel-caricamento per rimuovere eventuali tracce di tampone di lisi dal complesso di precipizione di perline-coimmununo. Rimossare le perline in 55 microlitri di tampone di carico 2x. Quindi, far bollire il campione a 95 gradi Celsius per 10 minuti.Caricare 25 microlitri di eluito su un gel macchia occidentale e un gel Coomassie che macchia il gel SDS-PAGE. Dopo aver completato l'elettroforesi del gel SDS-PAGE, sciacquare il gel tre volte in 25 millilitri di acqua ultrapura per 15 minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 100 millilitri di reagente di macchia Coomassie sul gel.Vedi il manoscritto per il protocollo di colorazione completo. Per la digestione delle fasce di gel, utilizzare prima una lama di rasoio pulita per tagliare le fasce di gel dall'intera corsia del gel, rappresentando ogni mutazione, in cubi di circa cinque millimetri. Posizionare ogni banda in un tubo di microcentrifugo pulito da 0,5 millilitri.Coprire le bande due volte con bicarbonato di ammonio da 100 millimolare in una soluzione di acetonitrile-to-water uno-a-uno a temperatura ambiente per 15 minuti per lavaggio. Quindi, asciugare i pezzi di gel per cinque minuti in una centrifuga sottovuoto. Per ridurre le proteine, coprire i pezzi di gel essiccato con ditiotriolo 10 millimolare in bicarbonato di ammonio da 100 millimolare per un'incubazione di un'ora a 56 gradi Celsius, seguita da alchilazione in iodoacetamide da 100 millimolare in acqua per un'ora a temperatura ambiente al buio.Successivamente, ridurre e rigonfiare i pezzi di gel due volte con acetonitrile, seguito da bicarbonato di ammonio 100 millimolare, entrambi con tremori delicati a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo il secondo rigonfiamento, asciugare i pezzi di gel per cinque minuti in una centrifuga sottovuoto. Gonfiare i pezzi di gel con 50 nanogrammi per microlitro di tripside modificata di grado sequenziante in bicarbonato di ammonio da 100 millimolare.Dopo cinque minuti, coprire i pezzi di gel con bicarbonato di ammonio 100 millimolare e lasciare che si gonfino completamente, aggiungendo bicarbonato di ammonio 100 millimolare aggiuntivo in modo che i pezzi di gel gonfio siano completamente coperti. Quindi, incubare i pezzi di gel durante la notte a 37 gradi Celsius, fermando la reazione con 1/10 del volume dei campioni con il 10% di acido formico in acqua la mattina successiva, e raccogliere il supernatante da ogni tubo. Il segnale di localizzazione nucleolare del rev bandiera a tre numeri primi è rilevabile in tre diverse condizioni tampone di lisi contenenti varie concentrazioni di cloruro di sodio.B23 è rilevabile anche in tampone di lisi contenente la minore concentrazione di sale, appena rilevabile in tampone di lisi contenente la concentrazione media di sale, e non rilevabile in tampone di lisi contenente un'alta concentrazione di sale. Il rilevamento B23 è ottimale nel tampone di lisi contenente la bassa concentrazione di cloruro di sodio con bandiera a tre primi Rev di tipo selvaggio e perde affinità con il segnale di localizzazione nucleolare Rev M1 bandiera tri-primo. Anche l'affinità B23 con la bandiera a tre primi Rev di tipo selvaggio diminuisce con una maggiore concentrazione di sale e il controllo negativo del pcDNA non produce immunodetezione non specifica dopo l'immunoprecipitazione in entrambe le condizioni tampone di lysis.Il segnale di localizzazione nucleolare rev tri-prime è più rilevabile dopo l'eluizione attraverso l'ebollizione nel buffer di caricamento del campione 2x, mentre B23 è rilevabile sia in condizioni di incubazione del tampone campione di 37 che di 95 gradi Celsius. Dopo l'immunoprecipitazione e la colorazione dell'argento, come dimostrato, i segnali di localizzazione nucleolari Rev e Rev di tipo selvaggio M2, M6 e M9 sono rilevabili a 18 kilodalton. Bande corrispondenti alla proteina B23 sono osservate anche con il marcatore di 37 kilodalton.La colorazione con reagente Coomassie dimostra ulteriormente la rilevabilità del segnale di localizzazione nucleolare Rev a tre primi in presenza e assenza di mutazioni a 18 kilodaltoni. Utilizzare tutti i controlli, sia positivi che negativi, necessari per i riferimenti relativi al modello di malattia durante il processo di risoluzione dei problemi e screening per potenziali fattori di legame. Tutte le mutazioni a singolo punto possono essere esaminate per l'attività dominante-negativa attraverso la multimerizzazione con Rev di tipo selvaggio e utilizzate nell'arresto della replicazione dell'HIV-1.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

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New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nuovi strumenti per espandere cellule T regolatorie di individui HIV-1-infetti

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A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

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Un enzima di restrizione metodo basato clonazione per valutare l&#39;<em&gt; In vitro</em&gt; Replica Capacità di HIV-1 Sottotipo C Gag-MJ4 chimerici virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

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Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

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Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

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Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...