Name: identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry
Uploaded: 2019-06-26T12:30:00
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著者らは、国立衛生研究所(NIH)エイズ研究・参照試薬プログラム、エイズ部門、国立アレルギー・感染症研究所が提供するHLfB付着培養のためのバーバラ・K・フェルバー博士とジョージ・N・パヴラキス博士を認めます。病気 (NIAID), NIH.著者らはまた、NIH、助成金AI042552とAI029329によって提供される財政源を認めます。

1. 細胞培養
<ol><li>10%の胎児ウシ血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、および1mMのピルビン酸ナトリウムを組織培養処理100mmプレート内で補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でHLfBを維持する。5%CO2で供給される加湿インキュベーターで37 °Cで細胞培養物を保つ。1 x 106細胞/mLの細胞密度への通過コンフルエント細胞。</li>
	<li>細胞培養培養培養を破棄します。1xリン酸緩衝生理食...

<ol>
	<li>Arizala, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+Localization+of+HIV-1+Rev+Is+Required,+Yet+Insufficient+for+Production+of+Infectious+Viral+Particles.">Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).</li><li>Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+B23+is+an+important+human+factor+for+the+nucleolar+localization+of+the+human+immunodeficiency+virus+protein+Tat.">Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat.</a> Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).</li><li>Szebeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+stimulates+nuclear+import+of+the+HIV-1+Rev+protein+and+NLS-conjugated+albumin.">Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin.</a> Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).</li><li>Truant, R., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arginine-rich+domains+present+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+Tat+and+Rev+function+as+direct+importin+beta-dependent+nuclear+localization+signals.">The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).</li><li>Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+and+functional+diversification+in+the+members+of+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Genetics. 173, 1835-1850 (2006).</li><li>Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> BioEssays. 29, 49-59 (2007).</li><li>Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+nucleophosmin/B23,+a+nucleolar+acidic+protein,+as+a+histone+chaperone.">Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone.</a> FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).</li><li>Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+has+molecular+chaperone+activities.">Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities.</a> Protein Science. 8, 905-912 (1999).</li><li>Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+functional+domains+of+nucleolar+protein+B23.">Mapping the functional domains of nucleolar protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).</li><li>Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+nucleolar+proteins+shuttle+between+nucleus+and+cytoplasm.">Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.</a> Cell. 56, 379-390 (1989).</li><li>Yun, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23+is+a+proliferate+shuttle+protein+associated+with+nuclear+matrix.">Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).</li><li>Savkur, R. S., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+cleavage+in+pre-ribosomal+RNA+byprotein+B23+endoribonuclease.">Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).</li><li>Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+activity+of+nucleolar+protein+B23.">The ribonuclease activity of nucleolar protein B23.</a> Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).</li><li>Grisendi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nucleophosmin+in+embryonic+development+and+tumorigenesis.">Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis.</a> Nature. 437, 147-153 (2005).</li><li>Itahana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+ARF+degrades+B23,+a+nucleolar+protein+involved+in+ribosome+biogenesis+and+cell+proliferation.">Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation.</a> Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).</li><li>Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23,+a+multifunctional+protein+that+can+regulate+apoptosis.">Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 4, 918-923 (2005).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+polyubiquitination+and+degradation+of+the+Arf+tumor+suppressor.">N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor.</a> Genes &amp; Development. 18, 1862-1874 (2004).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf-induced+turnover+of+the+nucleolar+nucleophosmin-associated+SUMO-2/3+protease+Senp3.">Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3.</a> Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).</li><li>Horn, H. F., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer:+guarding+the+guardian.">Cancer: guarding the guardian.</a> Nature. 427, 110-111 (2004).</li><li>Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+and+cancer.">Nucleophosmin and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).</li><li>Dingwall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+cDNA+sequence+reveals+polyglutamic+acid+tracts+and+a+cluster+of+sequences+homologous+to+putative+nuclear+localization+signals.">Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals.</a> The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).</li><li>Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+complex+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+rev+and+nucleolar+B23+proteins:+dissociation+by+the+Rev+response+element.">Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element.</a> Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).</li><li>Valdez, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+of+the+protein+p120.+Interaction+with+translocation+protein+B23.">Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).</li><li>Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C23+interacts+with+B23,+a+putative+nucleolar-localization-signal-binding+protein.">C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein.</a> European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).</li><li>Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+targeting+signal+of+Rex+protein+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+I+specifically+binds+to+nucleolar+shuttle+protein+B-23.">Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).</li><li>Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleolar+protein+B23+with+peptides+related+to+nuclear+localization+signals.">Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals.</a> Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).</li><li>Tsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+interacts+with+Japanese+encephalitis+virus+core+protein+and+participates+in+viral+replication.">Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication.</a> Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).</li><li>Ning, B., Shih, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+localization+of+human+hepatitis+B+virus+capsid+protein.">Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein.</a> Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).</li><li>Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+core+interacts+with+the+host+cell+nucleolar+protein,+nucleophosmin+1.">Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1.</a> Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).</li><li>Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolar+phosphoprotein+B23+interacts+with+hepatitis+delta+antigens+and+modulates+the+hepatitis+delta+virus+RNA+replication.">The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).</li><li>Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+replication+of+hepatitis+delta+virus:+genomic+and+antigenomic+RNAs+associate+with+different+nuclear+bodies.">RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).</li><li>Yang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+nucleolin+and+its+identification+as+a+transcription+repressor.">Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).</li><li>Sarek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+phosphorylation+by+v-cyclin-CDK6+controls+KSHV+latency.">Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).</li></ol>

HIV-1の存在下でRev-NoLS変異とWT Revを比較した質量分析は、ウイルス複製サイクルに関与するヌクレオロール因子を理解するために評価された。これは、ウイルス感染に必要なヌクレオラー成分を同定するであろう。ヌクレオラーB23はRev-NoLSに対して高い親和性を有し、Rev3およびRev結合HIV mRNA22のヌクレオ細胞局在化における機能を有する。単一または複数の?...

核は、ウイルス複製に必要な様々な細胞宿主およびウイルス因子の相互作用場として仮定される。核は3つの異なったコンパートメントに細分される複雑な構造である:フィブリラコンパートメント、密な線維のコンパートメントおよび粒状コンパートメント。HIV-1 Revタンパク質は、粒状コンパートメント内で特異的に局所化します。ただし、このローカリゼーション パターンの理由は不明です。NoLS配列(Rev突然変異4、5、および6)内に単一点突然変異が存在する場合、Revは核パターンを維持し、以前にHIV-1HXB2複製を救出することが示されているが、WT Rev 1と比較して効率が低下した。.すべての単一点突然変異は、HIV-1NL4-3感染サイクルを維持することができません。NoLS配列内の複数の単一点突然変異(Rev-NoLS突然変異2および9)の存在下で、Revは核および細胞質全体に分散することが観察され、HIV-1HXB2複製1を救出することができませんでした。このプロテオミクス研究の目的は、Rev媒介性HIV-1感染経路に関与するヌクレオラーおよび非ヌクレオロール細胞因子を解読することです。Rev免疫沈殿条件は、ヌクレオラーB23リンタンパク質との相互作用を通じて最適化され、以前にヌクレオラー変異の存在下でRevとの相互作用を失うことが示されている。
Rev細胞因子は、過去に広範囲に研究されています。しかし、これはウイルス病因の不在で行われている。特に、HIV-1複製中のRev相互作用を介して本研究で特徴付けられた1つのタンパク質は、両生類2、3、両生類におけるヌクレオホスミン(NPM)、ヌマトリン、またはNO38とも呼ばれるヌクレオホスミンB23である。4.B23は、3つのアイソフォーム(NPM1、NPM2、およびNPM3)として表される- 核核ホスミン/核オプラスミン核シャペロンファミリー5、6の全メンバー。NPM1分子シャペロンは、ヌクレオソームの適切な組み立てにおいて、クロマチン高次構造7、8に関与するタンパク質/核酸複合体の形成において、および凝集の防止において機能し、N末端コアドメインを介した標的タンパク質の誤折(残渣1-120)9.NPM1機能は、核と細胞質間のプリリボソーム粒子の輸送を通じてリボソーム発生にまで及び、内部転写スペーサー配列におけるプリリボソームRNAの処理12,13,リボソームアセンブリ14,15の間にタンパク質の核凝集を逮捕する.NPM1は、アポトーシス16の阻害および腫瘍抑制剤ARF 17、18およびp5319の安定化に関与し、発生因子および腫瘍抑制剤としての二重の役割を明らかにする。NPM1は、ゲノム安定性、セントロソーム複製、転写の細胞活動に関与する。NPM1は、細胞周期間相中のヌクレオリ、有人化時の染色体周辺、および有分裂の終わりに核前核体(PNB)に見出される。NPM2およびNPM3は、悪性腫瘍20の間に発現レベルの変化を受けるNPM1ほどよく研究されていない。
NPM1は、内部ファミコンおよびNLS 9、21を介した様々な核/核系タンパク質の核細胞質シャトルに記載されており、HIV-1タットおよびRevタンパク質の核輸入を促進することが以前に報告されている。B23-結合ドメイン-β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質の存在下で、タットは細胞質内で誤局在化し、トランス活性化活性を失う。これはB232のためのタットの強い親和性を示す。別の研究は、RRE含有mRNAの不在でRev/B23安定複合体を確立した。RRE mRNAの存在下で、RevはB23から解離し、好ましくはHIV RREに結合し、B2322の変位を引き起こす。核レベルでは、HIV mRNAに対するB23のタットトランス活性化およびRev交換プロセスがどこで起こるかは不明である。両方のタンパク質は、B23相互作用を介して同時に核に入ると仮定される。HIV核経路における他の宿主細胞タンパク質の関与が期待される。このプロテオミクス調査に記載されている方法は、HIV-1病因の間に関与する宿主細胞因子との核の相互作用を解明するのに役立つ。
プロテオミクス調査は、HIV-1HXB2産生に対するRev NoLS単点変異(M4、M5、およびM6)および複数のアルギニン置換(M2およびM9)の発現を通じて開始された。このモデルでは、Rev欠損HIV-1HXB2(HLfB)を安定的に発現するHeLa細胞株を、3'末端にフラグタグを含むWT RevおよびRevヌクレオラー変異でトランスフェクトする。WT Revの存在は、Rev欠乏症(M2およびM9)を救済しないRev-NoLS変異と比較して、HLfB培養においてウイルス複製が起こることを可能にする、またはウイルス複製がWT Rev(M4、M5、およびM6)1ほど効率的に起こらないことを可能にする。細胞リサートは、Rev発現の存在下でウイルス増殖後48時間後に収集され、Rev/B23相互作用用に最適化されたリシスバッファーを用いて免疫沈殿を行った。様々な塩濃度を用いた溶解バッファー最適化について説明し、HIV-1 Revのタンパク質溶出方法を銀染色またはクマシー染色SDS-PAGEゲルで比較・分析する。最初のプロテオミクスアプローチは、タンデム質量分析による発現WT Rev、M2、M6、およびM9からの放出サンプルの直接分析を含む。WT Rev、M4、M5、およびM6の溶出をゲル抽出プロセスを受けた第2のアプローチを、第1のアプローチと比較する。WT Revと比較してRev-NoLS変異に対するペプチド親和性を分析し、タンパク質同定確率を表示する。これらのアプローチは、HIV-1 mRNA輸送およびHIV-1複製中のRevとのスプライシングに関与する潜在的な因子(ヌクレオールおよび非ヌクレオラー)を明らかにする。全体的に、記載された細胞溶解、IP、および溶出条件は、感染経路を活性化および調節する宿主細胞因子の理解のために目的とするウイルスタンパク質に適用可能である。これは、様々な疾患モデルの持続性に必要な細胞宿主因子の研究にも適用可能である。このプロテオミクスモデルでは、HIV-1 Rev IPは、核細胞質シャトル活性およびHIV-1 mRNA結合に関与するヌクレオロール因子を解明するためにB23相互作用用に最適化されています。さらに、目的の主要タンパク質に欠乏している感染症モデルを安定的に発現する細胞株は、HLfB細胞株と同様に、目的とする感染経路を研究するために開発することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A38S-212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acrylamide:Bisacrylamide</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ANTI-Flag M2 affinity gel</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BioMax MS film</td>
			<td style="width:321px;">Carestream</td>
			<td style="width:119px;">8294985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL</td>
			<td style="width:321px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">B23 mouse monoclonal IgG</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-47725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Carnation non-fat powdered milk</td>
			<td style="width:321px;">Nestle</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">179693PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">C18IonKey nanoTile column</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td>186003763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 100-mm TC-treated culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1539714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">1 x DPBS</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-030-CVRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ECL Estern blotting substrate</td>
			<td style="width:321px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A409-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FBS</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">GelCode blue stain reagent</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glycerol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">goat-anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:321px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">KimWipe delicate task wiper</td>
			<td style="width:321px;">Kimberly Clark Professional</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Methanol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">NanoAcuity UPLC</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24600df</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">15-mL Polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:321px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Purified BSA</td>
			<td style="width:321px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PVDF&#160; Western blotting membrane</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">10 x TBS</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2471500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TEMED</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610880edu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Triton X-100 detergent solution</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizaic source</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-051-CIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Tween 20</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Synapt G2 mass spectrometer</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:321px;">Tisch Scientific</td>
			<td>10427813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry

HIV-1感染サイクルは、ウイルスの複製、包装、および放出を容易にするために、宿主因子とのウイルスタンパク質相互作用を必要とする。感染サイクルはさらに、スプライシングを調節し、ヌクレオサイトプラズム輸送を可能にするために、HIV-1 RNAを用いたウイルス/宿主タンパク質複合体の形成を必要とする。HIV-1 Revタンパク質は、イントロニックシス-作用型標的-Rev応答元素(RRE)との多層化を通じてHIV-1 mRNAの核輸出を達成する。核色の局在シグナル(NoLS)は、Revアルギニン豊富なモチーフ(ARM)のCOOH終位内に存在し、核内のRev/RRE複合体の蓄積を可能にする。核因子因子は、mRNAに依存しない核輸出およびスプライシングを媒介することに加えて、様々な他の機能を通じてHIV-1感染サイクルをサポートすると推測される。質量分析のためのHIV-1複製の存在下で、Revヌクレオラー変異(欠失および単一点Rev-NoLS変異)と比較して、野生型(WT)Revの免疫沈殿法について述べるとよ。ヌクレオ細胞性輸送に関与するヌクレオロール因子(ヌクレオホスミンB23およびヌクレオリンC23)ならびに細胞スプライシング因子は、Rev-NoLS変異の存在下でRevとの相互作用を失う。snoRNA C/Dボックス58のような様々な他の核因子は、Rev変異との相互作用を失うことが同定されるが、HIV-1複製サイクルにおけるその機能は未知のままである。ここで提示された結果は、HIV-1感染サイクルを維持するウイルス/宿主ヌクレオロール因子の同定にこのアプローチを使用することを示す。このアプローチで使用される概念は、研究中の経路の特性を必要とする他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。

様々な細胞下局在パターンに対応するRev-NoLSの単一および多点アルギニン変異は、WT Rev.WT Rev-3'フラグおよびp cDNA-flagと比較して細胞宿主因子と相互作用する能力において検討された。ベクターはHLfB培養において発現した。タンパク質複合体を全細胞リサートから処理し、銀染色試薬で染色した。Rev-NoLS-3'フラグは、図1のNaCl(137 mM、200mM、および300mM)の様々な濃度を...

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Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

ここでは、質量分析のためのHIV-1複製の存在下でのRev免疫沈殿について説明する。記載された方法は、HIV-1感染サイクルに関与するヌクレオラー因子の同定に使用することができ、研究中の経路の特徴付けのための他の疾患モデルに適用可能である。

REV免疫沈殿と質量分析によるHIV-1複製中のヌクレオール因子の同定

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

我々のプロトコルは、HIV-1感染性周期を維持するウイルス、ヌクレオラー、および非ヌクレオラー宿主因子の同定と特性評価のための代替方法を提供する。このアプローチで使用される概念は、研究対象経路の特徴付けを必要とする他のウイルスおよび疾患モデルに適用可能である。他のタンパク質モデルへの変更に関するトラブルシューティング手法について説明します。この手順のデモンストレーションは、希望都市ベックマン研究所の分子細胞生物学部門の科学者であるハイタン・リーとプリツァナ・チョムチャンと、希望の市プロテオミクスコアと分子免疫学科のメンバーであるロジャー・ムーアです。HLfBを安定して発現させるHLfBを、3つの100ミリメートル培養プレートで、1ミリリットル当たり2倍の10〜6個の細胞に培養します。細胞が適切な濃度に達したら、Revヌクレオラー局在化シグナル3素旗変異を含むプラスミドを15ミリリットルチューブに1.76ミリリットルのTE 79/10と混合し、続いて2モル塩化カルシウム240マイクロリットルを添加し、徹底的に混合する。次に、チューブの内容物を2倍HBSの2ミリリットルを含む新しい15ミリリットルのチューブに滴下し、続いて渦盤で混合する。室温で30分後、降水を渦出させる。培地をそっと渦巻きながら、3枚の100ミリメートルHLfB培養プレートのそれぞれに滴下する懸濁液の1ミリリットルを加えます。細胞培養インキュベーターで6時間のインキュベーションを行った後、トランスフェクション混合物を10ミリリットルの新鮮な培養培地に置き換え、さらに42時間培養器に細胞を戻します。トランスフェクションの48時間後、各プレートをバイオハザードレベル2の組織培養フード内の氷のベッドの上に置きます。細胞培養培地を取り出し、細胞層を破壊することなく、10ミリリットルのプレチルPBSで細胞を穏やかにリンスする。細胞をすすいだ後、PBSを捨てます。次に、細胞を1皿あたり1ミリリットルのリシスバッファーで処理し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加する。プレートを傾けてセルをプールに集め、セルスクレーパーを使用して手動で層を破壊します。1,000マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、各プレートからリセートをプレチル、15ミリリットルのチューブにプールし、氷の上で15分間インキュベートし、5分ごとに渦を出します。インキュベーションの終わりに、ライセートを3本の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにアリコートし、遠心分離によってライセートを回収する。上清を新しい15ミリリットルチューブに移し、原稿に記載されているようにウイルスタンパク質のライセート濃度を得る。Revヌクレオラー局在化シグナル3本分旗の共免疫沈降については、M2アフィニティゲルビーズ25マイクロリットルを500マイクロリットルの新鮮なライシスバッファーで3回洗い流し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加し、洗浄1回。冷たい部屋で、または氷の上の試薬でこれらのステップを実行します。最後のすすみ後、5ミリリットルのリシスバッファーの最終体積で、リンスビーズにウイルスタンパク質ライゼートの1ミリグラム/ミリリットル濃度を加えます。反応を摂氏4度で3時間回転させてインキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によってウイルスタンパク質のリセート結合ビーズをペレット化する。免疫沈降後のタンパク質濃度の測定のために上清を収集します。サンプルの保管手順については、原稿を参照してください。ウイルスタンパク質のリセート結合ビーズペレットに750マイクロリットルのリシスバッファーを加え、ビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、ビーズを摂氏4度で5分間ローテーターで洗浄します。ちょうど示したように、ローテーター上の追加の2回の打ち付けのための遠心分離によってビーズを収集します。最後の洗浄後、つままれた長いゲルローディングチップを使用して、ビーズ-コインムヌノ沈降複合体からリシスバッファーの痕跡を除去します。2xローディングバッファの55マイクロリットルにビーズを再中断します。その後、95°Cで10分間沸騰させます。1つのウェスタンブロットゲルと1つのクマシー染色SDS-PAGEゲルに25マイクロリットルの溶出物をロードします。SDS-PAGEゲル電気泳動終了後、25ミリリットルの超純水でゲルを15分間3回リンスします。最後の洗浄後、100ミリリットルのクマシー染色試薬をゲルに加えます。完全な染色プロトコルについては、原稿を参照してください。ゲルバンドの消化のために、最初にきれいなカミソリの刃を使用して、各突然変異を表すゲルのレーン全体からゲルバンドを約5ミリメートルの立方体に切断する。各バンドを清潔な0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに入れる。バンドを100ミリモルの重炭酸アンモニウムで2回、1対1のアセトニトリル対水溶液で室温で15分間覆います。その後、ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。タンパク質を減らすために、乾燥したゲル片を100ミリモルのジチオトライトールで100ミリモル炭酸アンモニウムで覆い、摂氏56度で1時間培養し、続いて水中で100ミリモルのヨウ酢酸アルキル化を水中で1時間水中で1時間暗濁時に1時間覆います。次に、ゲル片をアセトニトリルで2回収縮させ、再膨れ上げし、続いて100ミリモルモルの重炭酸アンモニウムを室温で穏やかに振りかけて15分間再収縮させる。2回目の再膨潤後、ゲル片を真空遠心分離機で5分間乾燥させます。100ミリモルの重炭酸アンモニウムで、シーケンシンググレードの改変トリプシンのマイクロリットル当たり50ナノグラムのゲル片を膨潤させる。5分後、ゲル片を100ミリモルの重炭酸アンモニウムで覆い、完全に再膨れ上がりさせ、100ミリモルのアンモニウム重炭酸塩を加えて、膨らんだゲル片を完全に覆います。次いで、ゲル片を摂氏37度で一晩インキュベートし、翌朝水に10%のギ酸を入れてサンプルの体積の1/10で反応を止め、各チューブから上清を集める。Revヌクレオラー局在化シグナル3素旗は、種々の濃度の塩化ナトリウムを含む3つの異なるライシス緩衝条件下で検出可能である。B23は、より低い塩濃度を含むリシス緩衝液においても検出可能であり、培地塩濃度を含むリシス緩衝液では検出がやっとであり、高塩濃度を含むリシス緩衝液では検出できない。B23検出は、野生型Rev3-プライムフラグを有する低塩化ナトリウム濃度を含有するリシスバッファーにおいて最適であり、Revヌクレオラー局在化シグナルM1 3素旗との親和性を失う。野生型Rev 3-プライムフラグとのB23アフィニティーも塩濃度が高くなると減少し、pcDNA陰性対照は、両方のリシス緩衝条件下での免疫沈降後の非特異的免疫検出を生じさせない。Revヌクレオラー局在化シグナル3プライムフラグは、2倍のサンプルローディングバッファで沸騰を通して溶出した後に最も検出可能であり、B23は37°Cおよび95°Cの両方のサンプルバッファインキュベーション条件下で検出可能です。免疫沈降および銀染色後、実証されているように、野生型RevおよびRevヌクレオラー局在化シグナルM2、M6、M9は18キロダルトンで検出可能である。B23タンパク質に相当するバンドも37キロダルトンマーカーで観察される。クマシー試薬による染色は、18キロダルトンでの変異の有無に関するRevヌクレオラー局在化シグナル3素旗の検出可能性をさらに示す。潜在的な結合因子のトラブルシューティングおよびスクリーニングプロセス中に疾患モデルに関連する参照に必要な数のコントロール(正と負の両方)を使用してください。すべての欠失および単一点突然変異は野生型Revを用いた多量体化を通じて支配的陰性活性について調べることができ、HIV-1複製の逮捕に利用される。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

緑色蛍光タンパク質を発現するリビジョンに依存するレンチウイルスベクターを用いたHIV - 1陽性細胞の特定のマーキング

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...