Name: identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry
Uploaded: 2019-06-26T12:30:00
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Los autores reconocen a la Dra. Barbara K. Felber y al Dr. George N. Pavlakis por la cultura adherente hlfB proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Programa de Investigación y Reactivo de Referencia sobre el SIDA, División del SIDA, Instituto Nacional de Alergia según la Alergia y Infeccioso Enfermedades (NIAID), NIH. Los autores también reconocen las fuentes financieras proporcionadas por los NIH, las Subvenciones AI042552 y AI029329.

1. Cultivo celular
<ol><li>Mantener HLfB en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato sódico dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido. Mantener los cultivos celulares a 37oC en una incubadora humidificada suministrada con 5% de CO2. Paso de células confluentes a una densidad celular de 1 x 106 celdas/ml.</li>
	<li>Deseche los medios de cultivo celular. Enjuague suavemente las célul...

<ol>
	<li>Arizala, J. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+Localization+of+HIV-1+Rev+Is+Required,+Yet+Insufficient+for+Production+of+Infectious+Viral+Particles.">Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).</li><li>Li, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+B23+is+an+important+human+factor+for+the+nucleolar+localization+of+the+human+immunodeficiency+virus+protein+Tat.">Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat.</a> Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).</li><li>Szebeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+stimulates+nuclear+import+of+the+HIV-1+Rev+protein+and+NLS-conjugated+albumin.">Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin.</a> Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).</li><li>Truant, R., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+arginine-rich+domains+present+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+Tat+and+Rev+function+as+direct+importin+beta-dependent+nuclear+localization+signals.">The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals.</a> Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).</li><li>Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+evolution+and+functional+diversification+in+the+members+of+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> Genetics. 173, 1835-1850 (2006).</li><li>Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+nucleophosmin/nucleoplasmin+family+of+nuclear+chaperones.">New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones.</a> BioEssays. 29, 49-59 (2007).</li><li>Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+nucleophosmin/B23,+a+nucleolar+acidic+protein,+as+a+histone+chaperone.">Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone.</a> FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).</li><li>Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+has+molecular+chaperone+activities.">Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities.</a> Protein Science. 8, 905-912 (1999).</li><li>Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+functional+domains+of+nucleolar+protein+B23.">Mapping the functional domains of nucleolar protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).</li><li>Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+nucleolar+proteins+shuttle+between+nucleus+and+cytoplasm.">Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm.</a> Cell. 56, 379-390 (1989).</li><li>Yun, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23+is+a+proliferate+shuttle+protein+associated+with+nuclear+matrix.">Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).</li><li>Savkur, R. S., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+cleavage+in+pre-ribosomal+RNA+byprotein+B23+endoribonuclease.">Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).</li><li>Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+activity+of+nucleolar+protein+B23.">The ribonuclease activity of nucleolar protein B23.</a> Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).</li><li>Grisendi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+nucleophosmin+in+embryonic+development+and+tumorigenesis.">Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis.</a> Nature. 437, 147-153 (2005).</li><li>Itahana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+ARF+degrades+B23,+a+nucleolar+protein+involved+in+ribosome+biogenesis+and+cell+proliferation.">Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation.</a> Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).</li><li>Ye, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin/B23,+a+multifunctional+protein+that+can+regulate+apoptosis.">Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 4, 918-923 (2005).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-terminal+polyubiquitination+and+degradation+of+the+Arf+tumor+suppressor.">N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor.</a> Genes &amp; Development. 18, 1862-1874 (2004).</li><li>Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arf-induced+turnover+of+the+nucleolar+nucleophosmin-associated+SUMO-2/3+protease+Senp3.">Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3.</a> Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).</li><li>Horn, H. F., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer:+guarding+the+guardian.">Cancer: guarding the guardian.</a> Nature. 427, 110-111 (2004).</li><li>Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+and+cancer.">Nucleophosmin and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).</li><li>Dingwall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoplasmin+cDNA+sequence+reveals+polyglutamic+acid+tracts+and+a+cluster+of+sequences+homologous+to+putative+nuclear+localization+signals.">Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals.</a> The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).</li><li>Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+complex+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+rev+and+nucleolar+B23+proteins:+dissociation+by+the+Rev+response+element.">Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element.</a> Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).</li><li>Valdez, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+nuclear+and+nucleolar+localization+signals+of+the+protein+p120.+Interaction+with+translocation+protein+B23.">Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).</li><li>Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C23+interacts+with+B23,+a+putative+nucleolar-localization-signal-binding+protein.">C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein.</a> European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).</li><li>Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+targeting+signal+of+Rex+protein+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+I+specifically+binds+to+nucleolar+shuttle+protein+B-23.">Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).</li><li>Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nucleolar+protein+B23+with+peptides+related+to+nuclear+localization+signals.">Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals.</a> Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).</li><li>Tsuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+protein+B23+interacts+with+Japanese+encephalitis+virus+core+protein+and+participates+in+viral+replication.">Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication.</a> Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).</li><li>Ning, B., Shih, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+localization+of+human+hepatitis+B+virus+capsid+protein.">Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein.</a> Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).</li><li>Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+virus+core+interacts+with+the+host+cell+nucleolar+protein,+nucleophosmin+1.">Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1.</a> Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).</li><li>Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleolar+phosphoprotein+B23+interacts+with+hepatitis+delta+antigens+and+modulates+the+hepatitis+delta+virus+RNA+replication.">The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).</li><li>Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+replication+of+hepatitis+delta+virus:+genomic+and+antigenomic+RNAs+associate+with+different+nuclear+bodies.">RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).</li><li>Yang, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+nucleolin+and+its+identification+as+a+transcription+repressor.">Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).</li><li>Sarek, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleophosmin+phosphorylation+by+v-cyclin-CDK6+controls+KSHV+latency.">Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).</li></ol>

Se evaluaron análisis espectrométricos masivos que comparaban las mutaciones Rev-NoLS y WT Rev en presencia de VIH-1 para comprender los factores nucleolares involucrados en el ciclo de replicación viral. Esto identificaría los componentes nucleolares necesarios para la infectividad viral. Nucleolar B23 tiene una alta afinidad con Rev-NoLS y funciona en la localización nucleolar de Rev3 y transporte nucleocitotoplasmático de MRNAs 22 de VIH ligados a Rev. La afinidad ...

El núcleo se postula como el suelo de interacción de varios factores de huésped celular y virales necesarios para la replicación viral. El núcleo es una estructura compleja subdividida en tres compartimentos diferentes: el compartimento fibrilar, el compartimento fibrilar denso y el compartimento granular. La proteína HIV-1 Rev se localiza específicamente dentro de compartimentos granulares; sin embargo, se desconoce la razón de este patrón de localización. En presencia de mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones de Rev 4, 5 y 6), Rev mantiene un patrón nucleolar y se ha demostrado previamente para rescatar la replicación del VIH-1HXB2, sin embargo, con una eficiencia reducida en comparación con WT Rev1 . Todas las mutaciones de un solo punto son incapaces de sostener el ciclo infeccioso VIH-1NL4-3. En presencia de múltiples mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones De Rev-NoLS 2 y 9), se ha observado que Rev se dispersa por todo el núcleo y el citoplasma y no ha podido rescatar la replicación del VIH-1HXB2 1. El objetivo de este estudio proteómico es descifrar factores celulares nucleolares y no nucleolares involucrados en la vía infecciosa VIH-1 mediada por Rev. Las condiciones de inmunoprecipitación de Rev se optimizan mediante la interacción con la fosfoproteína nucleolar B23, que previamente se ha demostrado que pierde la interacción con Rev en presencia de mutaciones nucleolares.
Los factores celulares Rev han sido ampliamente estudiados en el pasado; sin embargo, esto se ha hecho en ausencia de patogénesis viral. Una proteína, en particular, que se caracteriza en este estudio a través de la interacción Rev durante la replicación del VIH-1 es la fosfoproteína nucleolar B23 - también llamada nucleofosmina (NPM), numatrina, o NO38 en anfibios2,3, 4. B23 se expresa como tres isoformas (NPM1, NPM2 y NPM3) - todos los miembros de la familia de chaperosina nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmina5,6. El chaperosón molecular NPM1 funciona en el montaje adecuado de nucleosomas, en la formación de complejos proteicos/ácidos nucleicos implicados en las estructuras de alto orden de cromatina7,8, y en la prevención de la agregación y el desdoblamiento erróneo de las proteínas diana a través de un dominio del núcleo N-terminal (residuos 1-120)9. La funcionalidad NPM1 se extiende a la génesis ribosoma a través del transporte de partículas preribosomales entre el núcleo y el citoplasma10,11, el procesamiento del ARN preribosomal en la secuencia del espaciador transcrito interno 12,13, y la detención de la agregación nucleolar de proteínas durante el ensamblaje ribosomal14,15. NPM1 está implicado en la inhibición de la apoptosis16 y en la estabilización de los supresores tumorales ARF17,18 y p5319,revelando su doble papel como factor oncogénico y supresor tumoral. NPM1 participa en las actividades celulares de estabilidad del genoma, replicación centrosoma y transcripción. NPM1 se encuentra en nucleólidos durante la interfase del ciclo celular, a lo largo de la periferia cromosómica durante la mitosis, y en cuerpos prenucleolares (PNB) al final de la mitosis. NPM2 y NPM3 no están tan bien estudiados como NPM1, que sufre niveles alterados de expresión durante la neoplasia maligna20.
NPM1 está documentado en el cierre nucleocitotoplasmático de varias proteínas nucleares/nucleolares a través de un NES interno y NLS9,21 y se informó previamente para impulsar la importación nuclear de proteínas VIH-1 Tat y Rev. En presencia de las proteínas de fusión B23-binding-domain---galactosidase, Tat localiza erróneamente dentro del citoplasma y pierde la actividad de transactivación; esto demuestra una fuerte afinidad de Tat para B232. Otro estudio estableció un complejo estable Rev/B23 en ausencia de ARNm que contienen RRE. En presencia de ARNm RRE, Rev se disocia de B23 y se une preferentemente al VIH RRE, lo que conduce al desplazamiento de B2322. Se desconoce dónde, a nivel subnuclear, se lleva a cabo la transactivación de Tat y el proceso de intercambio de Rev de B23 por ARNm del VIH. Ambas proteínas se postulan para entrar en el nucleolus simultáneamente a través de la interacción B23. Se espera la participación de otras proteínas celulares del huésped en la vía nucleolar del VIH. Los métodos descritos en esta investigación proteómica ayudarán a dilucidar la interacción del nucleol con los factores celulares del huésped involucrados durante la patogénesis del VIH-1.
La investigación proteómica se inició a través de la expresión de mutaciones de un solo punto Rev NoLS (M4, M5 y M6) y múltiples sustituciones de arginina (M2 y M9) para la producción de VIH-1HXB2. En este modelo, una línea celular HeLa que expresa establemente la VIH-1HXB2 (HLfB) deficiente de Rev está transllenada de mutaciones nucleolares WT Rev y Rev que contienen una etiqueta de bandera al final de los 3'. La presencia de WT Rev permitirá que se produzca replicación viral en el cultivo HLfB, en comparación con las mutaciones Rev-NoLS que no rescatan la deficiencia de Rev (M2 y M9), o permiten que se produzca la replicación viral, pero no tan eficientemente como WT Rev (M4, M5 y M6)1. El lisato celular se recoge 48 horas más tarde después de la proliferación viral en presencia de la expresión Rev y se somete a inmunoprecipitación con un tampón de lisis optimizado para la interacción Rev/B23. Se describe la optimización del tampón de lisis utilizando diferentes concentraciones de sal, y los métodos de elución de proteínas para HIV-1 Rev se comparan y analizan en geles SDS-PAGE teñidos de plata o coomassie. El primer enfoque proteómico implica el análisis directo de una muestra eluida de WT Rev, M2, M6 y M9 expresados por espectrometría de masas en tándem. Un segundo enfoque por el cual los eludos de WT Rev, M4, M5 y M6 se sometieron a un proceso de extracción de gel se compara con el primer enfoque. Se analiza la afinidad de péptidos con las mutaciones Rev-NoLS en comparación con WT Rev y se muestra la probabilidad de identificación de proteínas. Estos enfoques revelan factores potenciales (nucleolar y no nucleolar) que participan en el transporte y empalme de ARNm VIH-1 con Rev durante la replicación del VIH-1. En general, las condiciones de lisis celular, IP y elución descritas son aplicables a las proteínas virales de interés para la comprensión de los factores celulares del huésped que activan y regulan las vías infecciosas. Esto también es aplicable al estudio de los factores de huésped celular necesarios para la persistencia de varios modelos de enfermedad. En este modelo proteómico, HIV-1 Rev IP está optimizado para la interacción B23 a factores nucleolares dilucidos involucrados en la actividad de cierre nucleocitolasmático y la unión de ARNm VIH-1. Además, se pueden desarrollar líneas celulares que expresan establemente modelos de enfermedades infecciosas que son deficientes para las proteínas clave de interés, similara a la línea celular HLfB, para estudiar las vías infecciosas de interés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A38S-212</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A955-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Acrylamide:Bisacrylamide</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A643-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ANTI-Flag M2 affinity gel</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BioMax MS film</td>
			<td style="width:321px;">Carestream</td>
			<td style="width:119px;">8294985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL</td>
			<td style="width:321px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">B23 mouse monoclonal IgG</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-47725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:321px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Carnation non-fat powdered milk</td>
			<td style="width:321px;">Nestle</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">179693PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">C18IonKey nanoTile column</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td>186003763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning 100-mm TC-treated culture dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J1539714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">1 x DPBS</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-030-CVRS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">ECL Estern blotting substrate</td>
			<td style="width:321px;">Pierce</td>
			<td style="width:119px;">32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A409-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FBS</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">GelCode blue stain reagent</td>
			<td style="width:321px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Glycerol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">goat-anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td style="width:321px;">Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td style="width:119px;">sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:321px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:119px;">122270050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">KimWipe delicate task wiper</td>
			<td style="width:321px;">Kimberly Clark Professional</td>
			<td style="width:119px;">34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Methanol</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">NanoAcuity UPLC</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">24600df</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">15-mL Polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:321px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td>
			<td style="width:321px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Purified BSA</td>
			<td style="width:321px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">PVDF&#160; Western blotting membrane</td>
			<td style="width:321px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3010040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:321px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">10 x TBS</td>
			<td style="width:321px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP2471500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">TEMED</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610880edu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Triton X-100 detergent solution</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizaic source</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:321px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-051-CIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Tween 20</td>
			<td style="width:321px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Synapt G2 mass spectrometer</td>
			<td style="width:321px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:321px;">Tisch Scientific</td>
			<td>10427813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of nucleolar factors during hiv-1 replication through rev immunoprecipitation and mass spectrometry

El ciclo infeccioso VIH-1 requiere interacciones virales con proteínas con factores de huésped para facilitar la replicación viral, el empaquetado y la liberación. El ciclo infeccioso requiere además la formación de complejos proteicos virales/huésped con ARN VIH-1 para regular el empalme y permitir el transporte nucleocitolasmático. La proteína HIV-1 Rev logra la exportación nuclear de ARNM VIH-1 a través de la multimerización con objetivos de acción cisintrónicos - el elemento de respuesta Rev (RRE). Existe una señal de localización nucleolar (NoLS) dentro del coOH-terminus del motivo rico en arginina Rev (ARM), permitiendo la acumulación de complejos Rev/RRE en el nucleolus. Se especula con factores nucleolares para apoyar el ciclo infeccioso del VIH-1 a través de varias otras funciones, además de mediar la exportación nuclear independiente del ARNm y el empalme. Describimos un método de inmunoprecipitación de Rev de tipo salvaje (WT) en comparación con las mutaciones nucleolares Rev (deleción y mutaciones Rev-NoLS de un solo punto) en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los factores nucleolares implicados en el transporte nucleocitotoplasm (nucleophosmin B23 y nucleolin C23), así como los factores de empalme celular, pierden la interacción con Rev en presencia de mutaciones Rev-NoLS. Se identifican otros factores nucleolares, como el esnoRNA C/D 58, para perder la interacción con las mutaciones de Rev, pero su función en el ciclo de replicación del VIH-1 sigue siendo desconocida. Los resultados presentados aquí demuestran el uso de este enfoque para la identificación de factores nucleolares virales/anfitriones que mantienen el ciclo infeccioso VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías poco estudiadas.

Las mutaciones de arginina de un solo punto y de punto múltiple Rev-NoLS, correspondientes a una variedad de patrones de localización subcelular, se examinaron en su capacidad de interactuar con los factores de host celular en comparación con WT Rev. WT Rev-3'flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir del lisado celular total y se teñiron con reactivo de manchas de plata. Rev-NoLS-3'flag es detectable (aproximadamente 18 kDa) en tres condiciones ...

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Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

Aquí describimos la inmunoprecipitación Rev en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los métodos descritos pueden utilizarse para la identificación de factores nucleolares implicados en el ciclo infeccioso VIH-1 y son aplicables a otros modelos de enfermedades para la caracterización de vías poco estudiadas.

Identificación de factores nucleolares durante la replicación del VIH-1 a través de la inmunoprecipitación de rev y la espectrometría de masas

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Nuestro protocolo proporciona métodos alternativos para la identificación y caracterización de factores de huésped virales, nucleolares y no nucleolares que mantienen el ciclo infeccioso DEL VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías subesteudiadas. Las técnicas de solución de problemas se describen para modificar otros modelos de proteínas.Al demostrar el procedimiento se mostrarán Haitang Li y Pritsana Chomchan, científicos del Departamento de Biología Molecular y Celular del Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza, y Roger Moore, miembros del Núcleo de Proteómica de la Ciudad de la Esperanza y del Departamento de Inmunología Molecular. Comience por cultivar un cultivo de línea celular HeLa que expresa de forma estable el HLfB en tres placas de cultivo de 100 milímetros a una densidad de dos veces a 10 a seis células por mililitro. Cuando las células alcancen la concentración adecuada, mezcle 20 microgramos de plásmido que contengan la señal de localización nucleolar Rev mutación de tres banderas de interés con 1,76 mililitros de TE 79/10 en un tubo de 15 mililitros, seguido de la adición de 240 microlitros de cloruro de calcio bipolar, con mezcla a fondo.A continuación, transfiera el contenido del tubo por gota en un nuevo tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de 2x HBS, seguido de la mezcla en una máquina de vórtice. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, vórtice la precipitación. Agregue un mililitro de la suspensión por gota a cada una de las tres placas de cultivo HLfB de 100 milímetros mientras gira suavemente el medio.Después de una incubación de seis horas en la incubadora de cultivo celular, reemplace la mezcla de transfección con 10 mililitros de medio de cultivo fresco, y devuelva las células a la incubadora durante otras 42 horas. 48 horas después de la transfección, coloque cada plato sobre un lecho de hielo dentro de una capucha de cultivo de tejido de nivel dos de riesgo biológico. Retire el medio de cultivo celular y enjuague suavemente las células con 10 mililitros de PBS prechilled, sin interrumpir las capas celulares.Deseche el PBS después de enjuagar las células. A continuación, tratar las células con un mililitro de tampón de lelisis, complementado con cóctel inhibidor de la proteasa, por plato. Inclinando las placas para recoger las células en una piscina, utilice un rascador de celdas para interrumpir manualmente las capas.Usando una micropipeta de 1.000 microlitros, acope el éltato de cada plato en un tubo prechilled, de 15 mililitros para una incubación de 15 minutos sobre hielo, con vórtice cada cinco minutos. Al final de la incubación, aliquot los lysates en tres tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y recoger los lysates por centrifugación. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros y obtenga la concentración de izado de proteína viral, como se describe en el manuscrito.Para la coimmunoprecipitación de la señal de localización nucleolar Rev bandera de tres primos, enjuague 25 microlitros de perlas de gel de afinidad M2 tres veces con 500 microlitros de tampón de lisis fresca, complementado con cóctel inhibidor de la proteasa, por lavado. Realice estos pasos en una sala fría o con los reactivos sobre hielo. Después del último enjuague, agregue una concentración de un miligramo por mililitro de licato de proteína viral a las cuentas enjuagadas en un volumen final de cinco mililitros de tampón de lysis.Incubar la reacción durante tres horas a cuatro grados centígrados con rotación. Al final de la incubación, pele el pellet de las proteínas virales con perlas conjugadas con izado por centrifugación. Recoger el sobrenadante para la medición de la concentración de proteína de izado post-inmunoprecipitación.Consulte el manuscrito para obtener instrucciones de almacenamiento de muestras. Añadir 750 microlitros de tampón de lelisis al pellet de perla conjugado con élicato de proteína viral, transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y lavar las perlas de un rotador durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Recoger las perlas por centrifugación para un adicional de dos lavados en el rotador, como acaba de demostrar.Después del último lavado, usa una punta de carga de gel pellizcada, larga y pellizcada para eliminar cualquier rastro de tampón de lelisis del complejo de la vacunación de los cuentas. Resuspender las perlas en 55 microlitros de 2x tampón de carga. Luego, hierva la muestra a 95 grados centígrados durante 10 minutos.Cargue 25 microlitros de eluido en un gel de mancha occidental y un gel SDS-PAGE de Coomassie. Después de completar la electroforesis de gel SDS-PAGE, enjuague el gel tres veces en 25 mililitros de agua ultrapura durante 15 minutos. Después del último lavado, agregue 100 mililitros de reactivo de tinción de Coomassie al gel.Consulte el manuscrito para ver el protocolo de tinción completo. Para la digestión de las bandas de gel, primero utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar las bandas de gel de todo el carril del gel, que representa cada mutación, en cubos de aproximadamente cinco milímetros. Coloque cada banda en un tubo limpio de microcentrífuga de 0,5 mililitros.Cubra las bandas dos veces con bicarbonato de amonio de 100 mililitrolares en una solución de acetonitrilo a agua de uno a uno a temperatura ambiente durante 15 minutos por lavado. Luego, seque las piezas de gel durante cinco minutos en una centrífuga al vacío. Para reducir las proteínas, cubra las piezas de gel seco con ditiotrotanio de 10 mililitrolares en bicarbonato de amonio 100 mililitrolar durante una hora de incubación a 56 grados centígrados, seguido de alquilación en 100 mililitrolado de yodoacamida en agua durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad.A continuación, encoger y reespolar las piezas de gel dos veces con acetonitrilo, seguido de bicarbonato de amonio 100 millilolar, ambos con agitación suave a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después del segundo reswelling, seque las piezas de gel durante cinco minutos en una centrífuga de vacío. Hincha las piezas de gel con 50 nanogramos por microlitro de trippsina modificada de grado de secuenciación en bicarbonato de amonio de 100 mililitrolares.Después de cinco minutos, cubra las piezas de gel con bicarbonato de amonio de 100 mililitrolares, y permítales que se relacionen por completo, añadiendo bicarbonato de amonio adicional de 100 mililitrolares para que las piezas de gel hinchadas estén completamente cubiertas. Luego, incubar las piezas de gel durante la noche a 37 grados Celsius, deteniendo la reacción con 1/10 del volumen de las muestras con 10% de ácido fórmico en agua a la mañana siguiente, y recoger el sobrenadante de cada tubo. La señal de localización nucleolar Rev de tres primos es detectable bajo tres condiciones diferentes de tampón de lelisis que contienen varias concentraciones de cloruro de sodio.B23 también es detectable en tampón de lelisis que contiene la menor concentración de sal, apenas detectable en tampón de lelisis que contiene la concentración media de sal, e indetectable en tampón de lelisis que contiene una alta concentración de sal. La detección de B23 es óptima en el tampón de lisias que contiene la baja concentración de cloruro de sodio con bandera de tres primos Rev de tipo salvaje y pierde afinidad con la señal de localización nucleolar Rev M1 de tres primeros ministros. La afinidad B23 con el indicador de tres primos Rev de tipo salvaje también disminuye con una mayor concentración de sal, y el control negativo de ADDNA no produce inmunodetección inespecífico después de la inmunoprecipitación en ambas condiciones de tampón de la lesis.La señal de localización nucleolar Rev marca de tres primos es más detectable después de la elución a través de la ebullición en tampón de carga de muestra 2x, mientras que B23 es detectable bajo las condiciones de incubación de la muestra de 37 y 95 grados Celsius. Después de la inmunoprecipitación y la tinción de plata, como se ha demostrado, las señales de localización nucleolares Rev y Rev de tipo salvaje M2, M6 y M9 son detectables a 18 kilodaltones. Las bandas correspondientes a la proteína B23 también se observan en el marcador de 37 kilodalton.La tinción con reactivo Coomassie demuestra además la capacidad de detección de la señal de localización nucleolar Rev de tres primeros indicadores en presencia y ausencia de mutaciones a 18 kilodaltons. Utilice tantos controles, tanto positivos como negativos, como sea necesario para las referencias que pertenecen a su modelo de enfermedad durante el proceso de solución de problemas y cribado de posibles factores de enlace. Todas las mutaciones de deleción y de un solo punto pueden ser examinadas para detectar actividad dominante-negativa a través de la multimerización con Rev de tipo salvaje y utilizadas en la detención de la replicación del VIH-1.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

Marcado específico del VIH-1 células positivas utilizando un vector lentiviral Ap-dependientes que expresan la proteína verde fluorescente

Most of HIV-responsive expression vectors are based on the HIV promoter, the long terminal repeat (LTR). While responsive to an early HIV protein, Tat, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

En uncoating in vitro del VIH-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

Una enzima de restricción método basado clonación para evaluar la<em&gt; In vitro</em&gt; Capacidad de replicación del VIH-1 subtipo C Gag-MJ4 quiméricos virus

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Evaluación conformacional del VIH-1 glicoproteínas de la envoltura trimérica El uso de un ELISA ensayo basado en células

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

El recocido mediada nucleocápside electroforesis (NOMBRE) ensayo permite la identificación rápida del VIH-1 inhibidores de la nucleocápside

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Aislamiento de exosomas del plasma de VIH-1 en individuos positivos

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

Visualización de VIH-1 Gag unión a Giant unilamelares vesículas membranas (GUV)

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...