Name: gamete collection and in vitro fertilization of astyanax mexicanus
Uploaded: 2019-05-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا فيليب نوغيرا وكيمبرلي بلاند على دعمهما لإنتاج الفيديو. ويود المؤلفان أيضاً أن يعترفا بفريق الألعاب المائية بأكمله التابع لمعهد أبراج تربية الحيوانات. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل مؤسسي من مكتب دعم التنمية والموارد الطبيعية. وقد حظيت المؤسسة بدعم مؤسسة إدوارد مالينكرودت وشركة JDRF. وكان البرنامج الوطني مدعوما بمنحة من شركة Forschungsgemeinschaft الألمانية (PE 2807/1-1).

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لمعهد أبراج للبحوث الطبية.
1. ضوء دورة التلاعب
<ol><li>إنشاء خزانات الأسماك داخل غير شفاف، مغلقة بالكامل (حماية الضوء)، وتدفق منخلال نظام تربية الأحياء الم?...

<ol>
	<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regressive+evolution+in+Astyanax+cavefish.">Regressive evolution in Astyanax cavefish.</a> Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).</li><li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus.">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).</li><li>Riddle, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555, 647-651 (2018).</li><li>Xiong, S., Krishnan, J., Peu&#223;, R., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+adipogenesis+contributes+to+excess+fat+accumulation+in+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus.">Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Astyanax+mexicanus+through+Natural+Spawning.">Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning.</a> COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Fertilization+of+Astyanax+mexicanus.">In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus.</a> COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).</li><li>Beale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+Mexican+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus+in+the+lab+and+in+the+field.">Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field.</a> Nature Communications. 4, 2769 (2013).</li><li>Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+biology+and+induced+breeding+of+two+Characidae+species+(Osteichthyes,+Characiformes)+from+the+S&#227;o+Francisco+River+basin,+Minas+Gerais,+Brazil.">Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the S&#227;o Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil.</a> Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).</li><li>Yasui, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+gamete+quality+and+its+short-term+storage:+an+approach+for+biotechnology+in+laboratory+fish.">Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish.</a> Animal. 9 (3), 464-470 (2015).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish+and+its+river-dwelling+conspecific.">Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific.</a> PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+Sex+of+Adult+Astyanax+mexicanus.">Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus.</a> COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).</li><li>Ross, L. G., Ross, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).</li><li>Matthews, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+Extender,+Cryoprotective+Medium,+and+In+Vitro+Fertilization+Improve+Zebrafish+Sperm+Cryopreservation.">Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation.</a> Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).</li><li>Stahl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transgenesis+in+Astyanax+mexicanus+using+the+Tol2+transposase+system.">Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system.</a> Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).</li><li>Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+transgenesis+and+husbandry:+how+cavefish+enters+the+laboratory.">Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory.</a> Zebrafish. 11, 291-299 (2014).</li><li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus.">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8.+Evolution+and+development+in+the+cavefish+Astyanax.">Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax.</a> Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).</li><li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra,+Astyanax+mexicanus.">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).</li><li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish.">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8, 155-165 (2011).</li><li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization.">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).</li></ol>

في حين أن التلقيح الاصطناعي هو طريقة موحدة للعديد من الكائنات الحية النموذجية المختلفة مثل حمار وحشي، والبروتوكولات القائمة لA. mexicanus لا تأخذ في الاعتبار أن هذا النوع يفرخ بشكل طبيعي خلال ساعات الليل6. وبالنظر إلى أن أسماك الكهف والأسماك السطحية تختلف اختلافا جذريا في إي?...

في السنوات الأخيرة، أصبحت Astyanax mexicanus كائن حي نموذجي في مجالات مختلفة مثل البيولوجياالتنموية، والبيولوجيا التطورية، والبيولوجيا السلوكية، وعلم وظائف الأعضاء 1،2،3،4 . تفرد هذا النظام يأتي من هذا النوع وجود العديد من morphotypes التي تكيفت مع بيئات مختلفة جدا. يعيش النمط المورفي للمسكن السطحي في الأنهار حيث يوجد تنوع بيولوجي كبير والكثير من المصادر الغذائية للأسماك. وعلى النقيض من ذلك، فإن أنواع الكهوف من A. mexicanus، وسمك الكهف ، تعيش في الكهوف حيث التنوع البيولوجي ، ومصادر الغذاء ، والأكسجين تتضاءل بشكل كبير1. أسماك الكهف تختلف عن الأسماك السطحية في مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية مثل غياب العينينوالتصبغ، ومقاومة الأنسولين، والقدرة على تخزين الدهون 2،3،4. ومع ذلك، فإن الأسماك السطحية وأسماك الكهف لا تزال تنتمي إلى نفس النوع، وبالتالي فهي التداخلية.
لكل من المورفوتاي، تم تحديد مجموعة من الشروط للسماحبالصيانة الروتينية والتكاثر في ظل الظروف المختبرية 5،6. ومع ذلك، لا تزال التعديلات الوراثية، والدراسات التنموية الجنينية السليمة، وخلق الهجينة تشكل تحديا لعدة أسباب. A. المكسيكية تفرخ في المقام الأول خلال ساعات الليل وهو أمر غير مريح للتجارب اللاحقة على المراحل الجنينية المبكرة مثل حقن المنشآت الوراثية أو رصد عمليات النمو الجنيني المبكر. وبالإضافة إلى ذلك، جيل من الهجينة السطحية والكهف هو التحدي باستخدام التفريخ الطبيعي، منذ morphotypes الكهف لديها إيقاع circadian تغيير7 التي تؤثر في نهاية المطاف على إنتاج البويضة قابلة للحياة. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي الناجحة، ولكن الغازية، لأنواع أخرى من Astyanax، حيث تم إعداد إنتاج الجاميت والسلوك التفريخ باستخدام الحقن الهرمونية8،9. وقد تم وصف إجراءات التلقيح الاصطناعي أقل الغازية (أي الحصول على gametes من التفريخ اليدوي دون حقن الاستعدادات الهرمونية) ولكن لا تنظر في الاختلافات في دورة التفريخ بين الكهف والأنماط المورفولوجية السطحية من A. mexicanus 6.
ويمكن بسهولة تعديل الكائنات الحية النموذجية الأخرى للأسماك، مثل سمك الحمار الوحشي، ودراستها وراثيا على المستوى الجنيني لأن العقبات المذكورة أعلاه قد تم حلها بنجاح. وقد دفع تنفيذ تقنيات التربية الموحدة، والإخصاب في المختبر، والحفاظ على الحيوانات المنوية بالتبريد جميعها سمك الحمار الوحشي إلى الأمام وعزز استخدام النموذج في العلوم البيولوجية10. ولذلك، فإن توسيع نطاق هذه التقنيات إلى A. mexicanus سيزيد من تعزيزها كنظام نموذجي.
هنا، نقدم بروتوكول مفصل للإخصاب خارج الرحم من شأنها أن تساعد على جعل A. mexicanus أكثر سهولة. وسوف نقدم إعداد تربية التي تمكن من تحويل دورات الضوء من الأسماك من النهار إلى الليل بحيث يمكن الحصول على البويضة قابلة للحياة خلال ساعات النهار دون حقن المستحضرات الهرمونية. ثم نقدم وصفا مفصلا لكيفية الحصول على ova وmilt المستخدمة في التلقيح الاصطناعي. وستمكن هذه الطريقة من إنتاج الأجنة خلال ساعات العمل العادية وتجعل المزيد من التطبيقات النهائية أكثر جدوى مقارنة باستخدام الأجنة من التفريخ الطبيعي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="827">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">0.6 mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:110px;">#22364111</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">100 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:179px;">VWR International</td>
			<td>#25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">Aspirator Tube</td>
			<td style="width:179px;">Drummond&#160;</td>
			<td style="width:110px;">#2-000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated 1-5 &#181;L Capillary Tubes</td>
			<td style="width:179px;">Drummond</td>
			<td style="width:110px;">#2-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">Dispolable Spatulas</td>
			<td style="width:179px;">VWR International</td>
			<td>#80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HMA-50S &#160;50W Aquatic Heaters</td>
			<td style="width:179px;">Finnex</td>
			<td style="width:110px;">HMA-50S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">P1000 Pipette</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td>#3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">P1000 Pipette Tips</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:110px;">#2079E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sanyo MIR-554 incubator&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Panasonic Health Care</td>
			<td style="width:110px;">MIR-554-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="218">
			<td height="218" style="height:218px;width:366px;">Sperm Extender E400</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td style="width:175px;">130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES 
			Adjust to pH 7.9 with&#160; 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 &#730;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">Sponge Animal Holder</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td>Made from scrap foam</td>
		</tr>
		<tr height="374">
			<td height="374" style="height:375px;width:366px;">System Water</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td style="width:175px;">Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 &#181;S/cm.&#160; Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 &#176;C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:366px;">Tissue Wipes</td>
			<td style="width:179px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>#21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="245">
			<td height="245" style="height:245px;width:366px;">ZIRC E2 Embryo Media</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td style="width:175px;">15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 &#181;M KH2PO4, 50 &#181;M Na2HPO4, 
			1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gamete collection and in vitro fertilization of astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus آخذ في الظهور ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من مجالات البحث في العلوم البيولوجية. جزء من النجاح أخيرة من هذا [تلّوست] سمكة نوع أنّ يملك هو يملك [إنترفيتيل] كهف و [ريفر-رلأيشن] مجموعة. وهذا يمكّن من رسم الخرائط الجينية للصفات القابلة للوراثة التي تم إصلاحها أثناء التكيف مع البيئات المختلفة لهذه التجمعات السكانية. في حين يمكن الحفاظ على هذا النوع وتربيته في المختبر، فإنه من الصعب على حد سواء الحصول على الأجنة خلال النهار وخلق الأجنة الهجينة بين سلالات. وقد استخدم الإخصاب في المختبر (IVF) مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية المختلفة لتربية الحيوانات بنجاح وبشكل متكرر في المختبر. في هذا البروتوكول، نبين كيف، من خلال التأقلم مع A. mexicanus إلى دورات الضوء المختلفة إلى جانب التغيرات في درجة حرارة المياه، يمكننا تحويل دورات تربية إلى وقت مختار من اليوم. في وقت لاحق، نعرض كيفية تحديد الأسماك الأبوية المناسبة، وجمع الجيمات صحية من الذكور والإناث، وإنتاج ذرية قابلة للحياة باستخدام التلقيح الاصطناعي. وهذا يمكّن الإجراءات ذات الصلة مثل حقن المنشآت الوراثية أو تحليل النمو من أن تحدث خلال ساعات العمل العادية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لخلق هجين بين الكهوف والسكان الذين يعيشون على السطح، وبالتالي تمكين دراسة الأساس الوراثي للتكيفات الفينوتية إلى بيئات مختلفة.

ويستند البروتوكول المعروض هنا أساسا إلى بروتوكول سبق نشره6. ومع ذلك، منذ A. المكسيكية تفرخ خلال ساعات الليل، قمنا بتصميم رف الإسكان لتربية الأسماك التي يمكن أن تغير الفترة الضوئية مستقلة عن ساعات العمل (الشكل1). يتم تغيير دورة ضوء الأسماك ...

Watch this Scientific Journal Video about Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus at JoVE.com

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

الإخصاب في المختبر هو تقنية شائعة الاستخدام مع مجموعة متنوعة من الكائنات الحية النموذجية للحفاظ على مجموعات المختبرات وإنتاج الأجنة المتزامنة للتطبيقات النهائية. هنا، نقدم بروتوكول اطبق هذه التقنية لمختلف مجموعات الأسماك المكسيكية رباعي، Astyanax mexicanus.

مجموعة جاميت والإخصاب في المختبر من أسيتاناكس المكسيكية

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Astyanax mexicanus ، المعروف أيضا باسم سمك الكهف المكسيكي الأعمى ، وبرز ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من مجالات البحوث في العلوم البيولوجية ، وتحديدا في فهم تطور الصفات الوراثية التكيفية. ويتكون هذا النوع من تحول سطح يسكن النهر وتحول مسكن كهف يسمح لنا بتحليل كيفية اختلاف اثنين من السكان من نفس النوع مع مرور الوقت. ومع ذلك، من أجل إجراء هذا البحث يجب أن نكون قادرين على الحصول على الأجنة الصحية المتطابقة زمنياً والخروج الهجين.في حين أن هذا النوع يتم الحفاظ عليه بسهولة وتربية في المختبر الأسماك تفرخ في المقام الأول خلال ساعات الليل مما يجعل من الصعب الحصول على الأجنة وضعت حديثا خلال النهار. في هذا البروتوكول نعرض كيف من خلال التأقلم Astyanax mexicanus إلى دورات الضوء المتغيرة وتغيرات درجة الحرارة ونحن قادرون على تحويل دورات تربية إلى وقت أكثر ملاءمة من اليوم. بعد ذلك، نعرض كيفية تحديد الأسماك المناسبة للوالدين وجمع الأم من الذكور والإناث المُلقنين.وأخيراً، نُظهر كيفية إنتاج نسل قابل للحياة باستخدام الإخصاب في المختبر ونناقش علامات الإخصاب الناجح. ونتوقع أن يتيح هذا البروتوكول إجراء إجراءات مثل حقن النشئات الوراثية وتحليل النمو بسهولة خلال ساعات العمل العادية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة في خلق التباعد المختلط بين جميع تجمعات الكهوف والمساكن السطحية.قم بإعداد خزانات الأسماك داخل نظام استزراع مائي مبهم ومغلق بالكامل يحتوي على صفوف متعددة من الخزانات. الحفاظ على درجة حرارة كل خزان مع عنصر التدفئة المستقلة التي تستخدم لتغيير درجة الحرارة يدويا أثناء عملية فتيلة. قم بإعداد صفوف فردية بطريقة لتمكين الصور الضوئية المنفصلة في كل منها.تثبيت الأبواب على كل صف التي يمكن إغلاقها لمنع الضوء من الدخول أو الهروب. يمكن أن وحدة تحكم الآلي تمكين التلاعب من جميع photoperiods مع أقل اضطراب للأسماك. تجهيز الرف مع ضوء العمل الأحمر وستائر التعتيم للوصول خلال ساعات الظلام.إزالة الأسماك المطلوبة من رفوف النظام العام ووضع في رفوف تربية للسماح لتعديل photoperiod 14 يوما قبل فتيلة. وهذا يسمح للأسماك بالتأقلم مع بيئة جديدة. الحفاظ على الأسماك عند 22.8 درجة مئوية خلال هذه الفترة باستخدام نظام التدفئة المائية المثبتة.الضوئي العادي هو ستة أ.m إلى ثمانية p.m ضوء، وثمانية .m.إلى ستة a.m.dark. لرف دورة الضوء تحول photoperiod إلى 10 p.m. إلى 12 p.m.الضوء، و12 .m. إلى 10 p.m. الظلام عن طريق ضبط الموقت الذي القوى الضوء داخل الرف.مرة واحدة يتم التأقلم الأسماك بدء فتيلة الحيوانات لتفريخ. هذا هو الإجراء الذي يستغرق ستة أيام في المجموع. على هذا وقت غيّر الدرجة حرارة إلى رئيس الزّاوا إنتاج يستعمل تثبيت نظامة تدفئة مائيّة.في اليوم الأول رفع درجة الحرارة من 22.8 درجة مئوية إلى 24.4 درجة مئوية. في اليوم الثاني رفع درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية إلى 26.1 درجة مئوية. في اليوم الثالث و الرابع يبقيان درجة الحرارة عند 26.1 درجة مئويةوسوف تكون الأسماك على استعداد لتفرخ خلال النهار ويمكن إجراء التلقيح الاصطناعي. في اليوم الخامس انخفاض درجة الحرارة من 26.1 درجة مئوية إلى 24.4 درجة مئوية. في اليوم السادس انخفاض درجة الحرارة من 24.4 درجة مئوية إلى 22.8 درجة مئوية.توفير فجوة لمدة سبعة أيام قبل تكرار دورة درجة الحرارة هذه. نوصي بالاستمرار في الحفاظ على الأسماك في هذا photoperiod لأن هذا سوف يقلل من الوقت الإجمالي الذي تحتاجه الأسماك للتكيف مع دورة الضوء المتغيرة. تبدأ عن طريق إدراج مسح الأنسجة مبللة في غطاء طبق بيتري وإغلاق الطبق لإنشاء غرفة مرطبة ومنع البويضات من الجفاف أثناء عملية جمع.المقبل اختيار أنثى لجمع. من المرجح أن تكون أسماك جرافيد ذات البطن البراحظ كبيرة الخيار الأفضل لهذا الإجراء. شل حركة أنثى باستخدام الماء المبرد ووضعها في موقف سوبين في حامل الإسفنج مبللة.مرة واحدة وضع لطخة الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف يسبب البويضة لتنشيط. عقد الأنثى بين الإبهام وسببة. الضغط بلطف ضد الجانبين الجانبي للتجويف coelomic في اتجاه فتح البولي التناسلي في حين المتداول الاصبع قليلا.جمع البويضات التي أعرب عنها باستخدام ملعقة المتاح. نقل هذه إلى طبق بيتري المرطب. ويمكن الجمع بين العديد من براثن من البويضات في نفس الطبق إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات محددة عن الوالدين.بعد جمع بلطف عودة الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام. اختيار الذكور لجمع. لا توجد علامات واضحة ظاهريًا لجودة راتة الذكور.ومع ذلك، يجب أن تظهر الأسماك في حالة صحية في المظهر قبل استخدامها في هذا الإجراء. شل حركة ذكر باستخدام الماء المبرد ووضعه في موقف سوبين في حامل الإسفنج مبللة. لطخة الجانب البطني من الأسماك مع مسح الأنسجة الحساسة كما الاتصال بالماء سوف تنشط milt.ضع بلطف نهاية أنبوب الشعيرات الدموية عند فتحة البولي التناسلية. طرد milt عن طريق تطبيق ضغط لطيف على جانبي السمكة مع الإبهام والسبابة. بدء ابتعاد عن الخياشيم تتحرك نحو فتح البولي التناسلي.جمع milt في نهاية أنبوب شعري. قد يكون من الضروري شفط لطيف عن طريق استخدام أنبوب الزفير. تجنب أي براز التي قد تكون طردت مع milt.الاستغناء milt في أنبوب جهاز طرد مركزي فارغ 1.5 ملليلتر وتمييع مع ضعف حجم تمديد الحيوانات المنوية E400. حافظ على الثلج. قد يتم تجميع Milt من عدة ذكور معًا إذا لم تكن هناك حاجة إلى بيانات تربية محددة.يمكن استخدام هذه الخطوة لتمديد وقت العمل من milt لعدة ساعات، ولكن ليست مطلوبة للتخصيب الفوري. بعد جمع بلطف عودة الأسماك إلى خزان الانتعاش مليئة المياه النظام. باستخدام ماصة جديدة لكل مخزون مزيج الحيوانات المنوية عن طريق الأنابيب و / أو تهيج الجانبين من الأنبوب قبل الإخصاب والحيوانات المنوية وmilt وتسوية في حل E400 مع مرور الوقت.الاستغناء عن milt أو حل milt الموسعة في البويضات التي تم جمعها حديثا. سرعان ما يضاف ملليلتر واحد من المياه النظام إلى مخلب لتنشيط الحيوانات المنوية والبويضات للتخصيب. تجنب خلط أو تهيج محتويات الطبق والسماح لمدة دقيقتين للتخصيب أن يحدث.إضافة E2 وسائط الجنين لملء الطبق 2/3 كامل. اعتمادا على الإجراء اللاحق الأجنة يمكن أن تستخدم على الفور لتطبيقات المصب أو أنها يمكن أن تحضن في وسائل الإعلام الجنين E2 في 23 درجة مئوية حتى تصل إلى خمسة أيام بعد الإخصاب. عند هذه النقطة نقوم بنقل الأجنة إلى نظام الإسكان الرئيسي إعادة تدوير باستخدام نظام المياه.القوة الرئيسية لهذا الأسلوب هو إنتاج موثوق بها من الكهوف والهجينة السطحية من المكسيكية Astyanax. الطرق التقليدية للإنتاج الهجين هي صعبة للغاية بسبب فقدان إيقاع circadian في كهف morphotype من المكسيكية Astyanax، مما يؤدي إلى تغيير أوقات التفريخ من هذه الأسماك. لإجراء التلقيح الاصطناعي الناجح في Astyanax mexicanus فإن جودة البويضات التي تم جمعها ذات أهمية كبرى.غرافيد الإناث الأسماك مع البطن جاحظ كبير هي الأكثر عرضة لإطلاق البويضات قابلة للحياة، والتي تبدو واضحة وحتى في المظهر. إضافة milt التي تم جمعها إلى هذه النتائج في تطوير الأجنة المخصبة عادة في غضون 20 إلى 30 دقيقة. سوف تصبح الأجنة القابلة للحياة أكثر شفّاً قليلاً قبل دخول مرحلة الخلية الواحدة من دورة النمو.سوف تبدو البويضات غير المخصبة أكثر تفاوتًا وغموضًا. باستخدام التلقيح الاصطناعي لتوليد الهجينة من سمك الكهف tenaja والأسماك السطحية يمكن للمرء أن يفحص مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية المورفولوجية. على سبيل المثال، السطح / كهف الهجينة لديها عيون تشير إلى وجود العينين هي سمة مهيمنة.في كهف سطح F2 الهجينة ومع ذلك, نحصل على مجموعة واسعة من أحجام العين مما يدل على أن هناك loci متعددة التي تتحكم حجم العين في المكسيكي Astyanax مما يجعلها سمة كمية. مثال آخر هو التصبغ. مراقبة الهجين F1 من سطح وسمك الكهف، يمكن أن يُستنتج أن تصبغ الجسم هو سمة مهيمنة حيث أن الأسماك مصطبغة بالكامل.في الجيل F2 الاختلاف في تصبغ الجسم مرة أخرى يشير نحو سمة كمية. يمكن أن يكشف الجمع بين هذه البيانات الظاهرية مع بيانات التسلسل عن بؤرة جينية ناصحة عن هذه الأنماط الظاهرية. تعلمنا في هذا البروتوكول كيفية تحويل دورات تربية المكسيكي أستياناكس إلى ساعات أكثر ملاءمة من اليوم، والحصول على أجنة صحية قابلة للحياة باستخدام الإخصاب في المختبر.بالإضافة إلى السماح بالعمل مع الأجنة في المراحل المبكرة ، فإنه يتيح أيضًا استكشاف الحيوانات المنوية في المستقبل. توحيد هذه التقنية يعزز Astyanax mexicanus كنظام نموذجي للدراسات التنموية والوراثية في وقت مبكر.

Research

JoVE Journal

Biology

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Seawater Sampling and Collection

أخذ عينات مياه البحر وكوكتيل

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

أسلوب الإنتاجية العالية للحصول على الحيوانات المنوية الحفظ بالتبريد واسماك الزرد في المختبر التسميد

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

تسميد البويضات القيطم باستخدام أسلوب نقل المضيف

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

التشخيص والتشريح والأنسجة عينة مختارة كوكتيل في الجرذان والفئران

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

عزلة البروتينية ريبوسوم الوليدة منضم<em&gt; في المختبر</em&gt; لتحديد المواقع وقفة بالحركة على طول مرنا

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

إنتاج فرداني الزرد الأجنة عن طريق<em&gt; في المختبر</em&gt; التسميد

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

كرر جمع الدم لاختبارات الدم في اسماك الزرد الكبار

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

الجينوم التحرير في<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; استخدام النسخ المنشط مثل المستجيب Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

جمع وتحديد حبوب اللقاح من مستعمرات نحل العسل

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...