Name: gamete collection and in vitro fertilization of astyanax mexicanus
Uploaded: 2019-05-25T13:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Philippe Noguera e Kimberly Bland por seu apoio na produção de vídeo. Os autores também gostariam de reconhecer toda a equipe de Aquatics do Instituto de Stowers para o husbandry animal. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento institucional para DPB e NR. NR foi apoiado pela Fundação Edward Mallinckrodt e JDRF. A RP foi apoiada por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (PE 2807/1-1).

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) do Instituto de pesquisas médicas da Stowers.
1. manipulação de ciclo claro
<ol><li>Configurar tanques de peixes dentro de um opaco, totalmente fechado (proteção de luz), fluxo-através do sistema de aquicultura contendo várias fileiras de tanques (Figura 1). Nota: o sistema de escoamento, como mostrado na Figura 1</strong...

<ol>
	<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regressive+evolution+in+Astyanax+cavefish.">Regressive evolution in Astyanax cavefish.</a> Annual Review Genetics. 43, 25-47 (2009).</li><li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus.">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genetics. 5, e1000326 (2009).</li><li>Riddle, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+in+cavefish+as+an+adaptation+to+a+nutrient-limited+environment.">Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment.</a> Nature. 555, 647-651 (2018).</li><li>Xiong, S., Krishnan, J., Peu&#223;, R., Rohner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+adipogenesis+contributes+to+excess+fat+accumulation+in+cave+populations+of+Astyanax+mexicanus.">Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Astyanax+mexicanus+through+Natural+Spawning.">Breeding Astyanax mexicanus through Natural Spawning.</a> COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Fertilization+of+Astyanax+mexicanus.">In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus.</a> COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).</li><li>Beale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+Mexican+blind+cavefish+Astyanax+mexicanus+in+the+lab+and+in+the+field.">Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field.</a> Nature Communications. 4, 2769 (2013).</li><li>Sato, Y., Sampaio, E. V., Fenerich-Verani, N., Verani, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+biology+and+induced+breeding+of+two+Characidae+species+(Osteichthyes,+Characiformes)+from+the+S&#227;o+Francisco+River+basin,+Minas+Gerais,+Brazil.">Reproductive biology and induced breeding of two Characidae species (Osteichthyes, Characiformes) from the S&#227;o Francisco River basin, Minas Gerais, Brazil.</a> Revista Brasileira Zoology. 23 (1), 267-273 (2006).</li><li>Yasui, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+gamete+quality+and+its+short-term+storage:+an+approach+for+biotechnology+in+laboratory+fish.">Improvement of gamete quality and its short-term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish.</a> Animal. 9 (3), 464-470 (2015).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Simon, V., Hyacinthe, C., Retaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+behavior+in+the+blind+Mexican+cavefish+and+its+river-dwelling+conspecific.">Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific.</a> PLoS One. 14 (2), e0212591 (2019).</li><li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+Sex+of+Adult+Astyanax+mexicanus.">Determining the Sex of Adult Astyanax mexicanus.</a> COLD SPRING HARBOR Protocols. , (2008).</li><li>Ross, L. G., Ross, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anaesthetic and Sedative Techniques for Aquatic Animals. , (2008).</li><li>Matthews, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+to+Extender,+Cryoprotective+Medium,+and+In+Vitro+Fertilization+Improve+Zebrafish+Sperm+Cryopreservation.">Changes to Extender, Cryoprotective Medium, and In Vitro Fertilization Improve Zebrafish Sperm Cryopreservation.</a> Zebrafish. 15 (3), 279-290 (2018).</li><li>Stahl, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+transgenesis+in+Astyanax+mexicanus+using+the+Tol2+transposase+system.">Stable transgenesis in Astyanax mexicanus using the Tol2 transposase system.</a> Developmental Dynamics. , 1-9 (2019).</li><li>Elipot, Y., Legendre, L., Pere, S., Sohm, F., Retaux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astyanax+transgenesis+and+husbandry:+how+cavefish+enters+the+laboratory.">Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory.</a> Zebrafish. 11, 291-299 (2014).</li><li>Gross, J. B., Borowsky, R., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Mc1r+in+the+parallel+evolution+of+depigmentation+in+independent+populations+of+the+cavefish+Astyanax+mexicanus.">A novel role for Mc1r in the parallel evolution of depigmentation in independent populations of the cavefish Astyanax mexicanus.</a> PLoS Genetics. 5 (1), e1000326 (2009).</li><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+8.+Evolution+and+development+in+the+cavefish+Astyanax.">Chapter 8. Evolution and development in the cavefish Astyanax.</a> Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).</li><li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra,+Astyanax+mexicanus.">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17 (5), 452-454 (2007).</li><li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus+surface+fish+and+Pachon+cavefish.">A developmental staging table for Astyanax mexicanus surface fish and Pachon cavefish.</a> Zebrafish. 8, 155-165 (2011).</li><li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization.">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiment. (29), (2009).</li></ol>

Enquanto IVF é um método padronizado para muitos organismos modelo diferentes, como zebrafish, protocolos existentes para a. mexicanus não levam em conta que esta espécie naturalmente gera durante as horas noturnas6. Dado que os peixes cavefish e de superfície diferem completamente dràstica em seus ritmos circadiano, o ciclo da maturação dos óvulos igualmente difere entre os morphotypes da caverna e da superfície. Enquanto as temperaturas de preparo e as horas para a superf?...

Nos últimos anos, Astyanax mexicanus tornou-se um organismo modelo em diferentes áreas, como biologia do desenvolvimento, biologia evolutiva, biologia comportamental e fisiologia1,2,3,4 . A singularidade deste sistema vem desta espécie tendo vários morfotipos que se adaptaram a ambientes muito diferentes. O Morfotipo da habitação de superfície vive nos rios onde há uma biodiversidade elevada e uma abundância de fontes de alimento para os peixes. Em contraste, os morfotipos de caverna de a. mexicanus, o cavefish, vivem em cavernas onde A biodiversidade, fontes de alimentos e oxigênio são drasticamente diminuídos1. Cavefish diferem dos peixes de superfície em uma variedade de fenótipos tais como a ausência de olhos e de pigmentação, resistência de insulin, e a habilidade de armazenar a gordura2,3,4. No entanto, peixes de superfície e cavefish ainda pertencem à mesma espécie e são, portanto, interfertile.
Para ambos os morfotipos, definiu-se um conjunto de condições para permitir a manutenção e reprodução rotineiras em condições laboratoriais5,6. Entretanto, as modificações genéticas, os estudos de desenvolvimento embrionário apropriados, e a criação dos híbridos são ainda desafiantes por diversas razões. A. mexicanus primeiramente desova durante horas da noite que é inconveniente para experiências subseqüentes em estágios embrionário adiantados tais como a injeção de construções genéticas ou a monitoração de processos de desenvolvimento embrionário adiantados. Além disso, a geração de híbridos de superfície e caverna é desafiadora usando a desova natural, uma vez que os morfotipos da caverna têm um ritmo circadiano alterado7 que, em última análise, afeta a produção de óvulos viáveis. Procedimentos de fertilização in vitro bem sucedidos, porém invasivos, foram descritos para outras espécies de Astyanax , onde a produção de gameta e o comportamento de desova foram aprontado usando injeções hormonais8,9. Procedimentos de fertilização in vitro menos invasivos (i.e., obtenção de gametas de desova manual sem a injeção de preparações hormonais) têm sido descritos, mas não consideram as diferenças no ciclo de desova entre os morfotipos de caverna e superfície de a. mexicanus a 6.
Outros organismos do modelo de peixe, como o zebrafish, podem ser facilmente modificados geneticamente e estudados a um nível embrionário, porque os obstáculos acima mencionados foram resolvidos com sucesso. A implementação de técnicas padronizadas de melhoramento genético, fertilização in vitro e criopreservação de espermatozóides têm empurrado o zebrafish para frente e solidificado o uso do modelo nas ciências biológicas10. Portanto, estender essas técnicas para a . mexicanus irá fortalecê-lo como um sistema modelo.
Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para o IVF que ajudará a fazer a . mexicanus mais acessível. Apresentaremos uma configuração de reprodução que permite deslocar os ciclos de luz dos peixes de dia para noite para que os óvulos viáveis possam ser obtidos durante o dia sem injeção de preparações hormonais. Nós, então, fornecer uma descrição detalhada de como obter os óvulos e Milt usado para IVF. Este método permitirá a produção de embriões durante o horário de trabalho normal e tornará mais viável a jusante aplicações em comparação com o uso de embriões de desova natural.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:828px;" width="827">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">0.6 mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:110px;">#22364111</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">100 mm Petri Dishes</td>
			<td style="width:179px;">VWR International</td>
			<td>#25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">Aspirator Tube</td>
			<td style="width:179px;">Drummond&#160;</td>
			<td style="width:110px;">#2-000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calibrated 1-5 &#181;L Capillary Tubes</td>
			<td style="width:179px;">Drummond</td>
			<td style="width:110px;">#2-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">Dispolable Spatulas</td>
			<td style="width:179px;">VWR International</td>
			<td>#80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HMA-50S &#160;50W Aquatic Heaters</td>
			<td style="width:179px;">Finnex</td>
			<td style="width:110px;">HMA-50S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">P1000 Pipette</td>
			<td style="width:179px;">Eppendorf</td>
			<td>#3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">P1000 Pipette Tips</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:110px;">#2079E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sanyo MIR-554 incubator&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Panasonic Health Care</td>
			<td style="width:110px;">MIR-554-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="218">
			<td height="218" style="height:218px;width:366px;">Sperm Extender E400</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td style="width:175px;">130 mM KCl, 50 mM NaCl, 2 mM CaCl2 (2H2O), 1 mM MgSO4 (7H2O), 10 mM D (+)-Glucose, 30 mM HEPES 
			Adjust to pH 7.9 with&#160; 5M KOH and filter sterilize. Solution can be stored at 4 &#730;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:366px;">Sponge Animal Holder</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td>Made from scrap foam</td>
		</tr>
		<tr height="374">
			<td height="374" style="height:375px;width:366px;">System Water</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td style="width:175px;">Deionized water supplemented with Instant Ocean Sea Salt [Blacksburg, VA] to reach a specific conductance of 800 &#181;S/cm.&#160; Water quality parameters are maintained within safe limits (Upper limit of total ammonia nitrogen range, 1 mg/L; upper limit of nitrite range, 0.5 mg/L; upper limit of nitrate range, 60 mg/L; temperature, 22 &#176;C; pH, 7.65; dissolved oxygen 100 %)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:366px;">Tissue Wipes</td>
			<td style="width:179px;">Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>#21905-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="245">
			<td height="245" style="height:245px;width:366px;">ZIRC E2 Embryo Media</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:110px;"></td>
			<td style="width:175px;">15 mM NaCl, 0.5 mM KCl, 1.0 mM MgSO4, 150 &#181;M KH2PO4, 50 &#181;M Na2HPO4, 
			1.0 mM CaCl2, 0.7 mM NaHCO3. Adjust pH to 7.2 to 7.4 using 2 N hydrochloric acid. Filter sterilize. Stored at room temperature for a maximum of two weeks.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gamete collection and in vitro fertilization of astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus está emergindo como um organismo modelo para uma variedade de campos de pesquisa na ciência biológica. Parte do sucesso recente desta espécie de peixe teleósteo é que possui caverna cruzar e populações de Rio-habitação. Isso possibilita o mapeamento genético de traços hereditários que foram fixados durante a adaptação aos diferentes ambientes dessas populações. Enquanto esta espécie pode ser mantida e criada no laboratório, é desafiador tanto para obter embriões durante o dia e criar embriões híbridos entre as cepas. In vitro a fertilização (IVF) foi usada com uma variedade de organismos modelo diferentes para produzir com sucesso e repetidamente animais no laboratório. Neste protocolo, mostramos como, aclimatizando a . mexicanus a diferentes ciclos de luz juntamente com mudanças na temperatura da água, podemos mudar os ciclos de reprodução para uma hora escolhida do dia. Posteriormente, mostramos como identificar peixes parentais adequados, coletar gametas saudáveis de machos e fêmeas, e produzir progênies viáveis usando FIV. Isto permite procedimentos relacionados tais como a injeção de construções genéticas ou a análise desenvolvente a ocorrer durante horas de trabalho normais. Além disso, esta técnica pode ser usada para criar híbridos entre as populações de cavernas e de superfície, e assim possibilitar o estudo da base genética de adaptações fenotípicas a diferentes ambientes.

O protocolo apresentado aqui é baseado principalmente em um protocolo previamente publicado6. No entanto, desde a. mexicanus gera durante as horas noturnas, nós projetamos um rack de habitação para a criação de peixes que pode mudar o fotoperíodo independente do horário de trabalho (Figura 1). O ciclo de luz dos peixes é alterado dentro de um sistema de aquicultura totalmente fechado, que contém três fileiras de tan...

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Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

A fertilização in vitro é uma técnica comumente utilizada com uma variedade de organismos modelo para manter as populações de laboratório e produzir embriões sincronizados para aplicações a jusante. Aqui, apresentamos um protocolo que implementa esta técnica para diferentes populações do peixe Tetra mexicano, Astyanax mexicanus.

Coleção gamete e fertilização in vitro de Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Astyanax mexicanus, também conhecido como o peixe-caverna mexicano cego, está emergindo como um organismo modelo para uma variedade de campos de pesquisa em ciência biológica, especificamente na compreensão da evolução dos traços genéticos adaptativos. Esta espécie consiste em uma morfa da superfície que habita o rio e uma morfina que habita cavernas, permitindo-nos analisar como duas populações da mesma espécie divergiram ao longo do tempo. No entanto, para que esta pesquisa ocorra, devemos ser capazes de obter embriões saudáveis com tempo e outcrosses híbridos.Embora esta espécie seja facilmente mantida e criada em laboratório, os peixes desovam principalmente durante as horas noturnas, tornando desafiador obter embriões recém-colocados durante o dia. Neste protocolo mostramos como, aclimatando astyanax mexicanus a ciclos de luz alterados e mudanças de temperatura, somos capazes de mudar os ciclos de reprodução para uma hora mais conveniente do dia. Em seguida, mostramos como identificar peixes-mãe adequados e coletar gametas de machos e fêmeas anestesiados.Finalmente, demonstramos como produzir descendentes viáveis usando fertilização in vitro e discutir sinais de fertilização bem sucedida. Esperamos que este protocolo permita que procedimentos como a injeção de construtos genéticos e análises de desenvolvimento sejam facilmente conduzidos durante o horário normal de trabalho. Além disso, essa técnica pode ser útil para criar outcrosses híbridos entre todas as cavernas e populações que habitam a superfície.Configure tanques de peixe dentro de um sistema de aquicultura opaco e totalmente fechado contendo múltiplas fileiras de tanques. Mantenha a temperatura de cada tanque com um elemento de aquecimento independente que é usado para alterar manualmente a temperatura durante o processo de escoramento. Configure linhas individuais de forma a habilitar fotoperióduos separados em cada um deles.Instale portas em cada linha que possam ser fechadas para evitar que a luz entre ou escape. O controlador automatizado pode permitir a manipulação de todos os fotoperióduos com a menor perturbação ao peixe. Equipar o rack com uma luz vermelha de trabalho e cortinas de apagão para acesso durante horas escuras.Remova os peixes desejados dos racks do sistema geral e coloque em racks de reprodução para permitir o ajuste do fotoperiodo 14 dias antes da escorva. Isso permite que o peixe se aclimata em um novo ambiente. Mantenha o peixe a 22,8 graus Celsius durante este período usando o sistema de aquecimento aquático instalado.O fotoperíodo normal é de seis a.m. a oito p.m luz, e oito p.m.a seis a.m.escuro. Para o rack de ciclo de luz, mude o fotoperíodo para 10 p.m. para 12 p.m.luz, e 12 p.m. a 10 p.m. escuro, ajustando o temporizador que alimenta a luz dentro do rack.Uma vez que os peixes são aclimatados comece a preparar os animais para desova. Este é um procedimento que leva seis dias no total. Ao longo deste tempo, altere a temperatura para preparar a produção de ovas usando um sistema de aquecimento aquático instalado.No primeiro dia, eleve a temperatura de 22,8 graus Celsius para 24,4 graus Celsius. No segundo dia, eleve a temperatura de 24,4 graus Celsius para 26,1 graus Celsius. Nos dias três e quatro manter a temperatura em 26,1 graus Celsius.Os peixes estarão prontos para desovar durante o dia e a FIV pode ser realizada. No quinto dia, a temperatura baixou de 26,1 graus Celsius para 24,4 graus Celsius. No sexto dia, a temperatura baixou de 24,4 graus Celsius para 22,8 graus Celsius.Forneça uma diferença de sete dias antes de repetir este ciclo de temperatura. Recomendamos continuar a manter o peixe neste fotoperóuodo, uma vez que isso reduzirá o tempo total necessário pelos peixes para se ajustar ao ciclo de luz deslocado. Comece inserindo um lenço umedecido de tecido em uma tampa de placa de Petri e fechando a placa para criar uma câmara umidificada e evitar que o ova seque durante o processo de coleta.Em seguida, escolha uma fêmea para a coleção. Peixes gravid com grandes abdômens salientes provavelmente serão a melhor escolha para este procedimento. Imobilize uma fêmea usando água gelada e coloque-a em posição supina em um suporte de animal esponja umedecido.Uma vez posicionado o lado ventral do peixe com um delicado lenço de tecido como contato com a água fará com que o ova seja ativado. Segure a fêmea entre o polegar e o dedo indicador. Aperte suavemente os lados laterais da cavidade coelomic na direção da abertura urogenital enquanto rola ligeiramente o dedo.Colete o ova expresso usando uma espátula descartável. Transfira isso para a placa de Petri umidificada. Várias embreagens de ova podem ser combinadas no mesmo prato se dados específicos de parentalidade não forem necessários.Após a coleta, devolva suavemente o peixe para um tanque de recuperação cheio de água do sistema. Escolha um macho para a coleção. Não há sinais externamente visíveis de qualidade masculina de jogo.No entanto, os peixes devem parecer saudáveis na aparência antes do uso neste procedimento. Imobilize um macho usando água gelada e coloque-o em posição supina em um suporte de animal esponja umedecido. Borrigue o lado ventral do peixe com uma delicada limpeza tecidual, pois o contato com a água ativará o milt.Coloque suavemente a extremidade de um tubo capilar na abertura urogenital. Expele milt aplicando pressão suave nas laterais do peixe com o polegar e o dedo indicador. Comece a distal para as brânquias movendo-se em direção à abertura urogenital.Colete o milt na ponta de um tubo capilar. Sucção suave pode ser necessária pelo uso de um tubo aspirador. Evite fezes que possam ser expelidas com o milt.Distribua o milt em um tubo vazio de centrífuga de 1,5 mililitro e dilua com o dobro do volume do extensor de esperma E400. Mantenha-se no gelo. Milt de vários machos pode ser agrupado se dados específicos de parentesco não forem necessários.Esta etapa pode ser usada para estender o tempo de trabalho do milt por várias horas, mas não é necessária para fertilização imediata. Após a coleta, devolva suavemente o peixe para um tanque de recuperação cheio de água do sistema. Usando uma nova pipeta para cada estoque misture o esperma por pipetar e/ou agitar as laterais do tubo antes de fertilizar como esperma e milt e se instalar na solução E400 ao longo do tempo.Dispense a solução milt ou milt estendida no ovário recém-coletado. Adicione rapidamente um mililitro de água do sistema à embreagem para ativar o esperma e os óvulos para fertilização. Evite misturar ou agitar o conteúdo do prato e deixe dois minutos para que a fertilização ocorra.Adicione mídia de embrião E2 para encher o prato 2/3 cheio. Dependendo do procedimento subsequente, os embriões podem ser usados imediatamente para aplicações a jusante ou podem ser incubados em mídia de embriões E2 a 23 graus Celsius até atingirem cinco dias após a fertilização. Neste ponto, transferimos embriões para o sistema habitacional principal recirculando usando água do sistema.A maior força deste método é a produção confiável de híbridos de cavernas e superfícies de Astyanax mexicanus. Métodos convencionais de produção híbrida são muito desafiadores devido à perda do ritmo circadiano no morfótipo das cavernas de Astyanax mexicanus, o que resulta em tempos alterados de desova desses peixes. Para um procedimento de FIV bem sucedido em Astyanax mexicanus a qualidade do ovado coletado é de grande importância.Peixes fêmeas gravid com grandes abdômens salientes são mais propensos a liberar ovas viáveis, que parecem claros e até mesmo na aparência. Adicionar o milt coletado a tais óvulos resulta no desenvolvimento de embriões fertilizados geralmente dentro de 20 a 30 minutos. Embriões viáveis se tornarão um pouco mais translúcidos antes de entrar em um estágio celular do ciclo de desenvolvimento.Ovas não fertilizadas parecerão mais desiguais e opacas. Usando FIV para gerar híbridos de peixes-caverna tenaja e peixes superficiais pode-se examinar uma ampla gama de fenótipos morfológicos. Por exemplo, híbridos de superfície/caverna têm olhos indicando que a presença dos olhos é um traço dominante.Na caverna de superfície híbridos F2, no entanto, obtemos uma ampla gama de tamanhos oculares indicando que existem vários loci que controlam o tamanho dos olhos em Astyanax mexicanus tornando-o um traço quantitativo. Outro exemplo é a pigmentação. Observando o F1 híbrido de superfície e peixe-caverna, pode-se concluir que a pigmentação corporal é um traço dominante, pois os peixes são totalmente pigmentados.Na geração F2, a variação da pigmentação corporal aponta novamente para um traço quantitativo. A combinação desses dados fenotípicos com dados de sequenciamento pode revelar loci genético subjacente responsável por esses fenótipos. Neste protocolo aprendemos como mudar os ciclos de reprodução de Astyanax mexicanus para horas mais convenientes do dia, e obter embriões viáveis saudáveis usando fertilização in vitro.Além de permitir trabalhos com embriões em estágio inicial, também permite a exploração futura da criopreservação de esperma. A padronização dessa técnica fortalece a Astyanax mexicanus como um sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento precoce.

Research

JoVE Journal

Biology

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Seawater Sampling and Collection

A amostragem da água do mar e Cobrança

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Biologia

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

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