Name: visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).

Il protocollo è stato approvato dal Comitato permanente sugli animali della Harvard Medical School e Brigham and Women's Hospital, protocollo 2016N000230.
1. Topi usati per l'esperimento
<ol><li>Utilizzare 8-settimana vecchi topi maschi e femmine sullo sfondo B6 per somministrare il mix di anticorpi.</li>
	<li>Utilizzare i mouse CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT per determinare se l'imaging LN intero ex vivo può essere applicato anche ai topi reporter senza somministrare la misc...

<ol>
	<li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+structure,+function,+and+histology+of+lymph+nodes.">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li><li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers.">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li><li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin,+Location,+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice.">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li><li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation.">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151 (2018).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo.">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).</li><li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models.">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo.">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns.">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li><li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation.">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li><li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress.">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li><li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids.">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function.">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. 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La combinazione di imaging con altre tecniche, tra cui la biologia molecolare e l'immunofenofotipizzazione ad alta dimensione ha migliorato la nostra capacità di studiare le cellule immunitarie nel loro contesto nativo. Infatti, mentre altri approcci possono richiedere la digestione dei tessuti e l'isolamento cellulare – che può portare alla perdita di integrità tissutale – l'uso dell'imaging in vivo o ex vivo offre un grande vantaggio nello studio di diversi sottotipi di cellule in modo geografico<sup class="xref...

I linfonodi (LN) sono organi a forma di ovoide ampiamente presenti in tutto il corpo con la funzione cruciale di colmare le risposte immunitarie innate e adattative. Gli LN filtrano la linfa per identificare le particelle estranee e le cellule cancerose per montare una risposta immunitaria contro di loro1. Antigeni che presentano cellule (APC), cellule T e cellule B lavorano insieme per generare anticorpi specifici dell'antigene (immunità umoristica) e linfociti citotossici (immunità cellulare) per eliminare le particelle estranee e le cellule cancerose2. Pertanto, la comprensione della dinamica delle cellule immunitarie presenti nel sistema linfatico avrà importanti implicazioni per lo sviluppo del vaccino e l'immunoterapia del cancro.
L'avvento di potenti microscopi - tra cui nuovi microscopi confocali e super-risoluzione - ha permesso uno straordinario progresso nella comprensione di come si comportano le diverse popolazioni di cellule immunitarie nel loro ambiente nativo3. È ora possibile immaginare diversi sottotipi di cellule simultanee utilizzando una combinazione di sonde con topi geneticamente modificati che esprimono proteine fluorescenti sotto il controllo di specifici obiettivi4,5. Infatti, tecniche ad alta dimensione, tra cui citometria di massa e analisi del flusso multi-parametrico sono state cruciali per espandere le nostre conoscenze su diverse compartimentazioni e funzionalità delle cellule immunitarie nella salute e nella malattia6, 7. Tuttavia, per preparare campioni per queste tecniche, i tessuti hanno bisogno di digestione e le cellule sono separate dal loro ambiente naturale per essere analizzate nelle sospensioni cellulari. Per superare queste limitazioni e consentire una migliore traduzione in biologia, l'obiettivo del protocollo qui proposto è quello di applicare una metodologia semplice per immagini ex vivo interi linfonodi utilizzando microscopi confocali stock con il vantaggio di una migliore velocità, tessuto conservazione della struttura e vitalità cellulare rispetto alla colorazione dell'immunofluorescenza convenzionale. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di dimostrare che i topi carenti per le cellule T, un sottotipo di linfocito T coinvolto nella difesa precoce dell'ospite contro i patogeni4, hanno follicoli compromessi e zone di cellule T rispetto ai topi di tipo selvatico. Questi risultati ci hanno permesso di seguire uno studio in cui abbiamo dimostrato che le cellule T di z svolgono un ruolo critico nell'omeostasi degli organi linfoidi e nella risposta immunitaria umorale4. Inoltre, questo protocollo fornisce un percorso fisiologico per le sonde e gli anticorpi per raggiungere il linfonodo, in quanto vengono somministrati sottocutaneamente e dissipati attraverso la circolazione linfatica dei tessuti, basandosi su precedenti rapporti che hanno utilizzato nell'etichettatura situ con anticorpi per visualizzare strutture associate a linfatiche8,9, dinamica del centro germinale10,11,12, e bersagli facilmente accessibili al flusso sanguigno13 ,14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV421 anti-CD4</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562891</td>
			<td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 anti-CD19</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564509</td>
			<td>1D3; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564418</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562603</td>
			<td>R35-38 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellview culture dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>627861</td>
			<td>35x10 mm with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>-</td>
			<td>Insulin U-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science Brand</td>
			<td>7557</td>
			<td>size 21 x 20 cm / 100 sheets per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved forceps</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>12.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved scissors</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>-</td>
			<td>30 gauge &#215; &#189; inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Te + A1R confocal head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-F4/80</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>565410</td>
			<td>T45-2342; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553930</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy

I linfonodi (LN) sono organi sparsi all'interno del corpo, dove le risposte immunitarie innate possono connettersi con l'immunità adattiva. Infatti, le LN sono strategicamente interposte nel percorso dei vasi linfatici, permettendo il contatto intimo degli antigeni tissutali con tutte le cellule immunitarie residenti nella LN. Pertanto, la comprensione della composizione cellulare, della distribuzione, della posizione e dell'interazione utilizzando l'imaging LN intero ex vivo aggiungerà alla conoscenza di come il corpo coordina le risposte immunitarie locali e sistemiche. Questo protocollo mostra una strategia di imaging ex vivo a seguito di una somministrazione in vivo di anticorpi con etichetta fluorescente che consente una metodologia molto riproducibile e facile da eseguire utilizzando microscopi confocali convenzionali e reagenti di magazzino. Attraverso l'iniezione sottocutanea di anticorpi, è possibile etichettare diverse popolazioni di cellule in LN drenanti senza influenzare le strutture tissutali che possono essere potenzialmente danneggiate da una tecnica di microscopia immunofluorescenza convenzionale.

Questo manoscritto mostra le tecniche per rimuovere i linfonodi inguinali e poplitali senza danneggiarne la struttura a seguito dell'iniezione di anticorpi fluorescenti per macchiare specifiche popolazioni cellulari in questi organi (Figura 1 e Figura 2 ).
La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule LN con BV421 anti-CD4 e BB515 anti-CD19 e analisi dell'imaging confocale ha definito la localizzazione delle cellule T (...

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Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Questo protocollo riproducibile e facile da eseguire utilizza una strategia di imaging dei linfonodi ex vivo per tracciare il drenaggio degli anticorpi fluorescenti etichettati fluorescenti somministrati in vivo agli organi linfoidi secondari locali. La dimostrazione di questa tecnica consente una visualizzazione specifica della procedura, che può facilitare un'esecuzione riuscita del protocollo. Questa è una tecnica molto semplice e diretta che può essere eseguita da chiunque.L'unico aspetto impegnativo è la gestione del mouse, che richiede un po 'di allenamento. Questa tecnica ha il vantaggio di una migliore conservazione dello sforzo tissutale a velocità e della vitalità cellulare rispetto ai metodi di colorazione fluorescente convenzionali. Ad allenare la procedura sarebbe Bruna Tatematsu, una tecnico del laboratorio.Diluire gli anticorpi di interesse, coniugati con i fluorofori appropriati, in 100 microlitri di PBS per l'imaging di linfonodi inguinali o 50 microlitri di PBS per l'imaging dei linfonodi poplitei. Per l'imaging dei linfonodi inguinali, caricare 100 microlitri del cocktail di anticorpi in una siringa per insulina millilitro, dotata di un ago da 30 gauge per mezzo pollice e iniettare sottocutaneamente gli anticorpi nella coscia interna del topo sperimentale. Per l'imaging dei linfonodi poplitei, iniettare 50 microlitri del cocktail di anticorpi per via sottocutanea in una zampa dell'animale sperimentale.Quindi riportare l'animale nella sua scatola di casa. Per la raccolta del linfonodo drenante inguinale, dopo aver atteso almeno tre ore dall'iniezione, immobilizzare il mouse sullo stadio acrilico con nastro adesivo e applicare olio minerale sulla pelle addominale. Utilizzare forbici di microchirurgia standard e forcette curve di microchirurgia per fare un'incisione della pelle mediana nell'addome dal pube al processo xifoide e dissociare la muscolatura addominale dalla pelle.Effettuare incisioni cutanee orizzontali nella parte superiore e inferiore della linea di incisione verticale, per creare lembi della pelle sul lato dell'iniezione e ritrarre la pelle per visualizzare il linfonodo. Fissare il lembo cutaneo alla piastra acrilica e utilizzare le forcep per rimuovere il linfonodo traslucido, di solito bilobulare sferico drenante inguinale. Per la raccolta dei linfonodi drenante poplitea, almeno 12 ore dopo l'iniezione, immobilizzare il topo in posizione prona su uno stadio acrilico.Applicare olio minerale sul polpaccio e sul ginocchio sul lato iniettato dell'animale. Successivamente, fare un'incisione della linea mediana nel polpaccio dal tallone al ginocchio e dissociare la muscolatura del polpaccio dalla pelle. Esponi la fossa poplitea.Il linfonodo popliteo apparirà come una sfera traslucida all'interno della fossa. Quindi, rimuovere il linfonodo con le forcep curve di microchirurgia. Per preparare il linfonodo per l'imaging, posizionare gli organi interi in un piatto di coltura di 35 per 10 millimetri con un fondo di vetro e utilizzare le forcelle per rimuovere qualsiasi grasso che circonda il tessuto.Centrare l'organo al centro del piatto e coprire il tessuto con un pezzo di tergicristallo delicato intriso di salina. Per l'imaging ex vivo, posizionare il piatto nello slot del microscopio confocale invertito e utilizzare la luce convenzionale del microscopio confocale e l'obiettivo 4-10X per ottenere la messa a fuoco corretta. Passare dalla funzione di luce alla modalità laser e utilizzare un campione macchiato di isotopi, non macchiato o non fluorescente per regolare la potenza, l'offset e il guadagno laser per rimuovere la fluorescenza automatica e qualsiasi colorazione non specificata.Acquisire immagini sotto gli obiettivi 4, 10 e 20X concentrandosi sulla struttura dei linfonodi e sulla distribuzione cellulare e utilizzando una definizione di 1024 per 1024 pixel. Quindi, utilizzare un programma software di analisi dell'imaging appropriato per separare i canali, aggiungere la scala e i colori di interesse e ricostruire la vista 3D. La potente combinazione di immunoetichettatura delle cellule linfonodo con anticorpi anti-CD4 e anti-CD19 e analisi di imaging confocale consente la localizzazione delle cellule T e B all'interno dei linfonodi inguinali.Nei linfonodi poplitei, come nel tessuto inguinale, i follicoli cellulari B sono circondati da popolazioni di cellule T, un segno distintivo della struttura dei linfonodi. Come osservato in queste immagini, i fagociti non interiorizzano gli anticorpi iniettati, indicando che la colorazione delle cellule B e T è specifica. Inoltre, la ri-ricostruzione dell'etichettatura indica che la colorazione delle celle T e B non si sovrappone, confermando ulteriormente la specificità della colorazione.Le cellule monocellulari si osservano in tutto il linfonodo inguinale, incluso il seno subcapsulare. Con la maggior parte delle cellule mononucleari che esprimono CX3XR1, seguite da cellule doppie positive CCR2 e CXCR31CCR2. Lo stesso modello di distribuzione cellulare e fenotipi cellulari si osserva nel linfonodo popliteo.Entrambi i linfonodi mostrano anche regioni scure senza espressione del recettore delle cellule mononucleari occupate dai linfociti. Inoltre, le cellule mononucleari sono scarse all'interno dell'area interna dei linfonodi, rimanendo concentrate nelle aree esterne del tessuto, indicando che queste cellule occupano principalmente il seno subcapsulare del linfonodo. La miscela di anticorpi deve essere iniettata con precisione nel tessuto sottocutaneo affinché il sistema linfatico scarichi correttamente gli anticorpi sul linfonodo.Questo metodo può essere applicato alla biodistribuzione di farmaci etichettati fluorescenti e agli studi di targeting cellulare di nanoparticelle etichettate fluorescenti.

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