Name: visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00
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이 작품은 NIH (H.L.W.에 R01 AI43458)에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 하버드 의과 대학과 브리검 여성 병원의 동물 상임위원회에 의해 승인되었다, 프로토콜 2016N000230.
1. 실험에 사용되는 마우스
<ol><li>항체 혼합을 투여하기 위한 B6 배경에 8주 된 수컷 및 암컷 마우스를 사용한다.</li>
	<li>CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT 마우스를 사용하여 항체 혼합을 투여하지 않고 리포터 마우스에 전 생체 전체 LN 이미징을 적용할 수 있는지...

<ol>
	<li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+structure,+function,+and+histology+of+lymph+nodes.">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li><li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers.">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li><li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin,+Location,+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice.">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li><li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation.">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151 (2018).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo.">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).</li><li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models.">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo.">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns.">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li><li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation.">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li><li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress.">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li><li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids.">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function.">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles.">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li><li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes.">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).</li></ol>

분자 생물학 및 고차원 면역 phenotyping를 포함하여 그밖 기술과 화상 진찰의 조합은 그들의 본래 문맥에 있는 면역 세포를 조사하는 우리의 기능을 강화했습니다. 사실, 다른 접근법은 조직 소화와 세포 분리를 요구할 수 있지만 - 조직 무결성의 손실로 이어질 수 있습니다 - 생체 내 또는 생체 내 이미징의 사용은 지리적 방식으로 다른 세포 아류형을 조사하는 데 큰 이점을 부여합니다<sup class="xref"...

림프절 (LN)은 선천적이고 적응성 면역 반응을 연결하는 중요한 기능을 가진 몸 전체에 널리 존재하는 난형 형 기관입니다. LN은 이물질과 암세포를 식별하기 위해 림프를 걸루어면역 반응을 장착한다 1. 항원 제시 세포(APC), T 세포 및 B 세포는 항원 특이적 항체(체액성 면역) 및 세포독성 림프구(cellular immunity)를생성하여 이물질 및 암세포를 제거하기 위해 함께 작용한다 2. 따라서, 림프계에 존재하는 면역 세포의 역학을 이해하는 것은 백신 개발 및 암 면역 요법에 중요한 영향을 미칠 것이다.
새로운 공초점 및 초고해상도 현미경을 포함한 강력한 현미경의 출현은 다른 면역 세포 집단이 그들의 모국환경에서어떻게 행동하는지 이해하는 특별한 발전을 허용했습니다 3. 이제 특정 표적4,5의통제하에 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 마우스와 프로브의 조합을 사용하여 여러 동시 세포 아류형을 영상화할 수 있다. 실제로, 질량 세포 분석 및 다중 파라메트릭 흐름 분석을 포함한 고차원 기술은 건강과 질병의 다양한 면역 세포 구획화 및 기능에 대한 지식을 확장하는 데 매우 중요했습니다6, 7. 그러나, 이러한 기술에 대한 샘플을 준비하기 위해, 조직은 소화가 필요하고 세포는 세포 현탁액에서 분석될 수 있도록 천연 밀리외에서 분리된다. 이러한 한계를 능가하고 생물학에서 더 나은 번역을 허용하기 위해, 여기에 제안 된 프로토콜의 목표는 개선 된 속도, 조직의 이점으로 스톡 공초점 현미경을 사용하여 생체 전체 림프절을 이미지화하는 간단한 방법론을 적용하는 것입니다. 기존의 면역형광 염색에 비해 구조 보존 및 세포 생존능력. 이 접근법을 사용하여, 우리는 γδ T 세포에 대한 결핍 마우스가 병원체에 대하여 호스트 초기 방어에 관여하는T 림프구의 특수형 4, 야생 형 마우스에 비해 여포 및 T 세포 영역을 손상했다는 것을 보여줄 수 있었습니다. 이 사실 인정은 우리가 γδ T 세포가 림프기관 및 체액 성 면역 반응의 항상성에 있는 중요한역할을 한다는 것을 설명한 연구 결과를 추구하는 것을 허용했습니다 4. 또한, 이 프로토콜은 프로브와 항체가 림프절에 도달하기 위한 생리적 경로를 제공하며, 피하 투여되고 조직 림프순환을 통해 소멸되기 때문에, situ labeling에 사용된 이전 보고서에 근거하여 림프 관련 구조를 시각화하는 항체8,9,발아 중심 역학10,11,12,혈류에 쉽게 접근할 수 있는 표적13 ,14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV421 anti-CD4</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562891</td>
			<td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 anti-CD19</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564509</td>
			<td>1D3; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564418</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562603</td>
			<td>R35-38 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellview culture dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>627861</td>
			<td>35x10 mm with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>-</td>
			<td>Insulin U-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science Brand</td>
			<td>7557</td>
			<td>size 21 x 20 cm / 100 sheets per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved forceps</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>12.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved scissors</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>-</td>
			<td>30 gauge &#215; &#189; inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Te + A1R confocal head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-F4/80</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>565410</td>
			<td>T45-2342; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553930</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy

림프절 (LN)은 타고난 면역 반응이 적응 면역과 연결할 수있는 신체 내에서 퍼지는 기관입니다. 사실, LN은 전략적으로 림프관의 경로에 개입되어 LN의 모든 상주 면역 세포와 조직 항원과 친밀한 접촉을 허용합니다. 따라서, 전 생체 내 LN 이미징을 사용하여 세포 조성, 분포, 위치 및 상호 작용을 이해하는 것은 신체가 국소 및 전신 면역 반응을 어떻게 조정시키는지에 대한 지식을 추가할 것이다. 이 프로토콜은 기존의 공초점 현미경 및 재고 시약을 사용하여 매우 재현 가능하고 수행하기 쉬운 방법론을 허용하는 형광 표지 항체의 생체 내 투여 에 따른 생체 내 이미징 전략을 보여줍니다. 항체의 피하 주입을 통해, 기존의 면역 형광 현미경 기술에 의해 잠재적으로 손상될 수 있는 조직 구조에 영향을 미치지 않고 배수 LN에 있는 다른 세포 인구를 표지하는 것이 가능합니다.

이 원고는 이러한 장기의 특정 세포 집단을 염색하기 위해 형광 표지 된 항체를 주입 한 후 구조를 손상시키지 않고 인과 성 림프절을 제거하는 기술을 보여줍니다 (그림1 및 그림 2 ).
LN 세포의 면역 라벨링과 BV421 항 CD4 및 BB515 항 CD19 및 공초점 이미징 분석의 강력한 조합은 인과 및 포퓰리터 LN에서 T 세포 (CD4+) 및 B 세포 (CD19+)의 국...

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Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

이 프로토콜은 장기 구조의 변화없이 림프절을 배출하는 다른 세포 집단을 이미지화하는 기술을 설명합니다.

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

이 재현 가능하고 수행하기 쉬운 프로토콜은 전 생체 임파선 이미징 전략을 사용하여 생체 내 투여 형광 표시 항체를 국소 이차 림프성 장기로 배출하는 것을 추적합니다. 이 기술을 시연하면 프로시저의 특정 시각화를 허용하므로 프로토콜을 성공적으로 실행할 수 있습니다. 이것은 누구나 수행 할 수있는 매우 간단하고 간단한 기술입니다.유일한 어려운 측면은 몇 가지 교육이 필요한 마우스 처리입니다. 이 기술은 기존의 형광 염색 방법에 비해 향상된 속도 조직 노력 보존 및 세포 생존력의 이점을 갖는다. 절차를 훈련하는 것은 브루나 다테마츠, 실험실에서 기술자가 될 것입니다.응모 림프절 이미징을 위한 PBS의 100 마이크로리터 또는 포라이트 림프절 이미징을 위한 PBS의 50 마이크로리터에서 적절한 형광에 컨쥬게이징된 관심 있는 항체를 희석시. 잉구림프 이미징의 경우 항체 칵테일 100마이크로리터를 1밀리리터 인슐린 주사기에 적재하고, 반인치 바늘로 30게이지를 장착하고, 실험마우스의 내부 허벅지에 항체를 피하한다. 포라이트 림프절 이미징의 경우, 실험 동물의 한 발 패드에 항체 칵테일 의 50 마이크로 리터를 피하로 주입하십시오.그런 다음 동물을 홈 박스로 돌려보습니다. 림프절 수확을 위해, 주입으로부터 적어도 3 시간을 기다린 후, 접착 테이프로 아크릴 단계에서 마우스를 고정하고 복부 피부에 미네랄 오일을 적용합니다. 표준 미세 수술 가위와 미세 수술 곡선 집게를 사용하여 pubis에서 xyphoid 과정에 복부 근육에 중간 라인 피부 절개를하고 피부에서 복부 근육을 분리합니다.수직 절개 라인의 상단과 하단에 수평 피부 절개를 만들고, 주입 측면에 피부 플랩을 만들고, 림프절을 시각화하기 위해 피부를 철회합니다. 아크릴 플레이트에 피부 플랩을 고정하고, 반투명, 일반적으로 담즙 구형 구형 구형 배수 림프절을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 포플라이트 배수 림프절 수확의 경우, 주입 후 적어도 12 시간, 아크릴 단계에서 경향이 위치에서 마우스를 고정.동물의 주입 측에 송아지와 무릎에 미네랄 오일을 바치게 한다. 다음으로, 발뒤꿈치에서 무릎까지 종아리에 중간 절개를 하고, 피부에서 종아리 근육을 분리한다. 포라이트 포사노출.포라이트 림프절은 포사 내의 반투명 구로 나타납니다. 그런 다음, 미세 수술 곡선 집게와 림프절을 제거합니다. 이미징을 위해 림프절을 준비하려면 전체 장기를 유리 바닥으로 35 x 10mm 배양 접시에 넣고 집게를 사용하여 조직을 둘러싼 지방을 제거합니다.접시 중간에 오르간을 중앙에 두고, 식염수에 흠뻑 젖은 섬세한 작업 와이퍼로 조직을 덮습니다. 전 생체 내 이미징의 경우, 반전된 공초점 현미경 슬롯에 접시를 배치하고 공초점 현미경및 4-10X 목표의 종래의 빛을 사용하여 올바른 초점을 얻습니다. 광 기능에서 레이저 모드로 변경하고 동위원소 염색, 비염색, 또는 비형광 샘플을 사용하여 레이저 전력, 오프셋 및 게인을 조정하여 자동 형광 및 불특정 염색을 제거합니다.림프절 구조 및 셀룰러 분포에 초점을 맞추고 1024 x 1024 픽셀 정의를 사용하여 4, 10 및 20X 목표에 따라 이미지를 획득합니다. 그런 다음 적절한 이미징 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 채널을 분리하고, 관심 있는 규모와 색상을 추가하고, 3D 뷰를 재구성합니다. 항 CD4 및 항 CD19 항체 및 공초점 이미징 분석을 통해 림프절 세포의 면역 라벨링의 강력한 조합은 잉구림프절 내의 T 및 B 세포의 국소화를 가능하게 합니다.포클레아 림프절에서, 잉구 조직에서와 같이, B 세포 여포는 T 세포 인구, 림프절 구조의 특징에 둘러싸여 있습니다. 이러한 심상에서 관찰된 바와 같이, phagocytes는 주입된 항체를 내면화하지 않으며, 이는 B 및 T 세포 염색이 특이하다는 것을 나타낸다. 더욱이, 라벨링의 재재구성은 T 및 B 세포 염색이 겹치지 않는다는 것을 나타내며, 염색의 특이성을 더욱 확인한다.단일 세포 세포는 캡슐 부비동을 포함하여 잉구 림프절 전체에서 관찰됩니다. CX3XR1을 발현하는 단일핵 세포의 대다수와 함께 CCR2 및 CXCR31CCR2 이중 양성 세포가 그 뒤를 이었다. 동일한 세포 분포 및 세포 표현형의 패턴이 포플라이트 림프절에서 관찰된다.두 림프절은 또한 림프구에 의해 점유되는 단핵 세포 수용체 발현없이 어두운 영역을 전시한다. 더욱이, 단일핵 세포는 림프절의 내부 영역 내에서 부족하며, 조직의 외부 영역에 집중되어 있으며, 이는 이들 세포가 주로 림프절 캡캡슐 부동을 차지하고 있음을 나타낸다. 항체 혼합물은 림프절에 항체를 적절히 배출하기 위해 림프계를 위한 피하 조직내로 정밀하게 주입되어야 한다.이 방법은 형광 표지 약물의 생체 분포에 적용될 수 있고, 형광 표시 나노 입자의 세포 표적 연구에 적용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

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연구

생물학

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위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

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