Name: visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01 AI43458 para H.L.W.).

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Permanente de animais da faculdade de medicina de Harvard e do hospital Brigham and Women, protocolo 2016N000230.
1. camundongos utilizados para o experimento
<ol><li>Use ratos machos e fêmeas velhos de 8 semanas no fundo B6 para administrar a mistura do anticorpo.</li>
	<li>Use camundongos CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar se a imagem latente completa ex vivo de ln pode igualmente ser aplicada aos ratos do repórter sem admin...

<ol>
	<li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+structure,+function,+and+histology+of+lymph+nodes.">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li><li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers.">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li><li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin,+Location,+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice.">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li><li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation.">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151 (2018).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo.">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).</li><li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models.">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo.">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns.">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li><li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation.">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li><li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress.">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li><li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids.">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function.">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles.">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li><li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes.">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).</li></ol>

A combinação da imagem latente com outras técnicas, incluindo a biologia molecular e o imunofenotipagem dimensional elevado realçou nossa habilidade de investigar pilhas imunes em seu contexto nativo. Na verdade, enquanto outras abordagens podem requerer digestão tecidual e isolamento celular-o que pode levar à perda de integridade tecidual-o uso de imagens in vivo ou ex vivo concede uma grande vantagem na investigação de diferentes subtipos de células em uma forma geográfica3 ,</su...

Os gânglios linfáticos (LNs) são órgãos em forma de ovóide amplamente presentes em todo o corpo com a função crucial de colmatar as respostas imunes inatas e adaptativas. Os LNs filtram a linfa a fim identificar partículas extrangeiras e pilhas cancerosas para montar uma resposta imune de encontro a elas1. Células de apresentação de antígeno (APCs), células T e células B trabalham ao lado para gerar anticorpos antígeno-específicos (imunidade humoral) e linfócitos citotóxicos (imunidade celular) para eliminar as partículas estrangeiras e células cancerosas2. Assim, compreender a dinâmica das células imunes presentes no sistema linfático terá implicações importantes para o desenvolvimento da vacina e a imunoterapia do câncer.
O advento de microscópios poderosos-incluindo novos microscópios confocais e de super resolução-permitiu um avanço extraordinário na compreensão de como diferentes populações de células imunes se comportam em seu ambiente nativo3. Agora é possível a imagem de vários subtipos de células simultâneas usando uma combinação de sondas com camundongos geneticamente modificados que expressam proteínas fluorescentes controle de alvos específicos4,5. De fato, técnicas de alta dimensão, incluindo citometria de massas e análise de fluxo Multiparamétrico, têm sido cruciais para ampliar nosso conhecimento sobre diferentes compartimentos e funcionalidades da célula imune na saúde e na doença6, 7. no entanto, para preparar amostras para estas técnicas, os tecidos necessitam de digestão e as células são separadas do seu ambiente natural para serem analisadas em suspensões celulares. Para superar essas limitações e permitir uma melhor tradução em biologia, o objetivo do protocolo proposto aqui é aplicar uma metodologia direta para a imagem de linfonodos inteiros ex vivo usando microscópios confocais de estoque com o benefício de velocidade melhorada, tecido preservação da estrutura, e viabilidade da pilha comparada à mancha convencional da imunofluorescência. Usando esta aproximação, nós pudemos mostrar que os ratos deficientes para as pilhas de ltγδ T, um SubType do linfócito de T envolvidos na defesa adiantada do anfitrião de encontro aos micróbios patogénicos4, têm os folículos comprometidos e as zonas da pilha de t em comparação aos ratos selvagens do tipo. Estes resultados permitiram que nós prosseguisse um estudo em que nós demonstramos que as pilhas de ltγδ T jogam um papel crítico na homeostase de órgãos lymphoid e da resposta imune humoral4. Além disso, este protocolo fornece um caminho fisiológico para sondas e anticorpos para alcançar o linfonodo, como eles são administrados por via subcutânea e dissipar-se através da circulação linfática do tecido, com base em relatos prévios que utilizaram a rotulagem in situ com anticorpos para visualizar as estruturas linfáticas-associadas8,9, adinâmica do centro germinais10,11,12, e alvos prontamente acessíveis ao fluxo sanguíneo13 ,14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV421 anti-CD4</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562891</td>
			<td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 anti-CD19</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564509</td>
			<td>1D3; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564418</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562603</td>
			<td>R35-38 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellview culture dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>627861</td>
			<td>35x10 mm with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>-</td>
			<td>Insulin U-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science Brand</td>
			<td>7557</td>
			<td>size 21 x 20 cm / 100 sheets per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved forceps</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>12.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved scissors</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>-</td>
			<td>30 gauge &#215; &#189; inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Te + A1R confocal head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-F4/80</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>565410</td>
			<td>T45-2342; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553930</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy

Linfonodos (LNs) são órgãos espalhados dentro do corpo, onde as respostas imunes inatas podem se conectar com a imunidade adaptativa. Na verdade, os LNs são estrategicamente interpostos no caminho dos vasos linfáticos, permitindo o contato íntimo de antígenos de tecido com todas as células imunes residentes no LN. Assim, compreender a composição celular, a distribuição, a localização e a interação usando imagens de LN inteiras ex vivo acrescentarão ao conhecimento sobre como o corpo coordena as respostas imunes locais e sistêmicas. Este protocolo mostra uma estratégia ex vivo da imagem latente depois de uma administração in vivo de anticorpos fluorescente-etiquetados que permita uma metodologia muito reprodutível e fácil de executar usando microscópios confocal convencionais e reagentes do estoque. Através da injeção subcutânea de anticorpos, é possível rotular diferentes populações de células na drenagem de LNs sem afetar as estruturas teciduais que podem ser potencialmente danificadas por uma técnica de microscopia de imunofluorescência convencional.

Este manuscrito mostra técnicas para remover linfonodos inguinal e poplítea sem prejudicar sua estrutura após a injeção de anticorpos fluorescentes rotulados para manchar populações de células específicas nesses órgãos (Figura 1 e Figura 2 ).
A combinação poderosa de Immunolabeling de pilhas de ln com BV421 anti-CD4 e BB515 a análise da imagem latente de CD19 e confocal definiu a localização de pilhas de T (CD4 +) e de...

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Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Este protocolo reprodutível e fácil de executar usa uma estratégia de imagem de linfonodo ex-vivo para rastrear a drenagem de anticorpos fluorescentes administrados in vivo para órgãos linfoides secundários locais. Demonstrar essa técnica permite uma visualização específica do procedimento, o que pode facilitar uma execução bem sucedida do protocolo. Esta é uma técnica muito simples e simples que pode ser realizada por qualquer pessoa.O único aspecto desafiador é o manuseio do mouse, que requer algum treinamento. Esta técnica tem o benefício de uma melhor preservação do esforço do tecido de velocidade e viabilidade celular em comparação com os métodos convencionais de coloração fluorescente. O treinamento do procedimento seria Bruna Tatematsu, técnica do laboratório.Diluir os anticorpos de interesse, conjugados aos fluoroforos apropriados, em 100 microliters de PBS para imagem de linfonodo inguinal, ou 50 microliters de PBS para imagem de linfonodo popliteal. Para imagens de linfonodos inguinais, carregue 100 microlitadores do coquetel de anticorpos em uma seringa de insulina de um mililitro, equipada com uma agulha de 30 bitola por meia polegada, e injete subcutâneamente os anticorpos na parte interna do rato experimental. Para imagens de linfonodos popliteal, injete 50 microliters do coquetel de anticorpos subcutânea em uma pata do animal experimental.Então devolva o animal para sua caixa de casa. Para a colheita do linfonodo de drenagem inguinal, depois de esperar pelo menos três horas da injeção, imobilize o rato no estágio acrílico com fita adesiva e aplique óleo mineral na pele abdominal. Use tesouras de microcirurgia padrão e fórceps curvos de microcirurgia para fazer uma incisão de pele média no abdômen do púbis para o processo xifoide, e dissociar a musculatura abdominal da pele.Faça incisões horizontais na parte superior e inferior da linha de incisão vertical, para criar retalhos de pele na lateral da injeção, e retrair a pele para visualizar o linfonodo. Fixar a aba da pele na placa acrílica e usar os fórceps para remover o linfonodo inguinal translúcido, geralmente bilobular e esguio. Para a colheita do linfonodo de drenagem popliteal, pelo menos 12 horas após a injeção, imobilize o rato na posição propensa em um estágio acrílico.Aplique óleo mineral na panturrilha e joelho no lado injetado do animal. Em seguida, faça uma incisão na panturrilha do calcanhar até o joelho, e dissocia a musculatura da panturrilha da pele. Exponha a fossa popliteal.O linfonodo popliteal aparecerá como uma esfera translúcida dentro da fossa. Em seguida, remova o linfonodo com as fórceps curvas da microcirurgia. Para preparar o linfonodo para imagem, coloque os órgãos inteiros em um prato de cultura de 35 por 10 milímetros com um fundo de vidro, e use fórceps para remover qualquer gordura ao redor do tecido.Centralizar o órgão no meio do prato, e cobrir o tecido com um pedaço de limpador de tarefas delicadas encharcados de soro fisiológico. Para imagens ex vivo, posicione o prato no slot de microscópio confocal invertido e use a luz convencional do microscópio confocal e o objetivo 4-10X para obter o foco correto. Mude da função de luz para o modo laser e use uma amostra manchada de isótopo, não manchada ou não fluorescente para ajustar a potência do laser, compensar e ganhar para remover a fluorescência automática e qualquer coloração não especificada.Adquira imagens sob os objetivos 4, 10 e 20X com foco na estrutura do linfonodo e distribuição celular e usando uma definição de 1024 por 1024 pixels. Em seguida, use um programa de análise de imagem apropriado para separar os canais, adicionar a escala e cores de interesse e reconstruir a exibição 3D. A poderosa combinação de imunolabeling de células linfáticas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD19 e análise de imagem confocal permite a localização de células T e B dentro dos linfonodos inguinais.Nos linfonodos popliteis, como no tecido inguinal, os folículos de células B são cercados por populações de células T, uma marca registrada da estrutura do linfonodo. Como observado nessas imagens, os fagocitos não internalizam os anticorpos injetados, indicando que a coloração das células B e T é específica. Além disso, a reconstrução da rotulagem indica que as manchas de células T e B não se sobrepõem, confirmando ainda mais a especificidade da coloração.Células monocelulares são observadas em todo o linfonodo inguinal, incluindo o seio subcapsular. Com a maioria das células mononucleares expressando CX3XR1, seguidas pelas células CCR2 e CXCR31CCR2 dupla positiva. O mesmo padrão de distribuição celular e fenótipos celulares é observado no linfonodo popliteal.Ambos os linfonodos também apresentam regiões escuras sem expressão de receptor de célula mononuclear que são ocupadas por linfócitos. Além disso, as células mononucleares são escassas dentro da área interna dos linfonodos, permanecendo concentradas nas áreas externas do tecido, indicando que essas células ocupam principalmente o sinusular do linfonodo. A mistura de anticorpos precisa ser injetada precisamente no tecido subcutâneo para o sistema linfático drenar adequadamente os anticorpos para o linfonodo.Este método pode ser aplicado à biodistribução de drogas rotuladas fluorescentes, e a estudos de segmentação celular de nanopartículas rotuladas fluorescentes.

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