Name: visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el NIH (R01 AI43458 a H.L.W.).

El protocolo fue aprobado por el Comité Permanente de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard y Brigham and Women's Hospital, protocolo 2016N000230.
1. Ratones utilizados para el experimento
<ol><li>Utilice ratones machos y hembras de 8 semanas de edad sobre el fondo B6 para administrar la mezcla de anticuerpos.</li>
	<li>Utilice ratones CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar si las imágenes de LN enteras ex vivo también se pueden aplicar a ratones reportero si...

<ol>
	<li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+structure,+function,+and+histology+of+lymph+nodes.">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li><li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers.">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li><li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin,+Location,+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice.">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li><li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation.">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151 (2018).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo.">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317 (2019).</li><li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models.">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li><li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system.">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li><li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo.">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li><li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity.">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li><li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns.">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li><li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation.">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li><li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress.">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li><li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport.">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li><li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids.">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li><li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function.">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li><li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+Genome+Editing+and+Beyond.">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li><li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles.">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li><li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes.">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012 (2013).</li></ol>

La combinación de imágenes con otras técnicas, incluida la biología molecular y el inmunofenotipado en alta dimensión, ha mejorado nuestra capacidad de investigar las células inmunitarias en su contexto nativo. De hecho, mientras que otros enfoques pueden requerir la digestión de los tejidos y el aislamiento celular, lo que puede conducir a la pérdida de la integridad del tejido, el uso de imágenes in vivo o ex vivo otorga una gran ventaja en la investigación de diferentes subtipos celulares de forma geográfic...

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos en forma de ovoide ampliamente presentes en todo el cuerpo con la función crucial de puentear las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Los LN filtran la linfa con el fin de identificar partículas extrañas y células cancerosas para montar una respuesta inmune contra ellos1. Las células que presentan antígenos (AAP), las células T y las células B trabajan junto con la generación de anticuerpos específicosde antígenos (inmunidad humoral) y linfocitos citotóxicos (inmunidad celular) para eliminar las partículas extrañas y las células cancerosas 2. Por lo tanto, comprender la dinámica de las células inmunitarias presentes en el sistema linfático tendrá importantes implicaciones para el desarrollo de la vacuna y la inmunoterapia contra el cáncer.
La llegada de poderosos microscopios -incluyendo nuevos microscopios confocales y de superresolución- ha permitido un avance extraordinario en la comprensión de cómo se comportan las diferentes poblaciones de células inmunitarias en su entorno nativo3. Ahora es posible crear una imagen de varios subtipos celulares simultáneos utilizando unacombinación de sondas con ratones modificados genéticamente que expresan proteínas fluorescentes bajo el control de objetivos específicos 4,5. De hecho, las técnicas de alta dimensión, incluida la citometría de masas y el análisis de flujo multiparamétrico han sido cruciales para ampliar nuestros conocimientos sobre la compartimentación y funcionalidad de diferentes células inmunitarias en la salud y la enfermedad6, 7. Sin embargo, para preparar muestras para estas técnicas, los tejidos necesitan digestión y las células se separan de su entorno natural para ser analizadas en suspensiones celulares. Para superar estas limitaciones y permitir una mejor traducción en biología, el objetivo del protocolo propuesto aquí es aplicar una metodología sencilla para la imagen de ganglios linfáticos enteros ex vivo utilizando microscopios confocales con el beneficio de la mejora de la velocidad, el tejido conservación de la estructura y viabilidad celular en comparación con la tinción de inmunofluorescencia convencional. Mediante el uso de este enfoque, pudimos demostrar que los ratones deficientes para las células T,un subtipo de linfocitos T involucrados en la defensa temprana del huésped contra patógenos 4, han comprometido folículos y zonas de células T en comparación con ratones de tipo salvaje. Estos hallazgos nos permitieron realizar un estudio en el que demostramos que las células T desempeñan un papel fundamental en la homeostasis de los órganos linfoides y la respuesta inmune humoral4. Además, este protocolo proporciona una vía fisiológica para que las sondas y los anticuerpos lleguen al ganglio linfático, ya que se administran por vía subcutánea y se disipan a través de la circulación linfática tisular, basándose en informes anteriores que se utilizan en el etiquetado in situ con anticuerpos para visualizar estructuras asociadas a linfáticos8,9, dinámica central germinal10,11,12, y objetivos fácilmente accesibles para el flujo sanguíneo13 ,14,15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BV421 anti-CD4</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562891</td>
			<td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 anti-CD19</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564509</td>
			<td>1D3; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564418</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562603</td>
			<td>R35-38 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellview culture dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>627861</td>
			<td>35x10 mm with glass bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>-</td>
			<td>Insulin U-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science Brand</td>
			<td>7557</td>
			<td>size 21 x 20 cm / 100 sheets per box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved forceps</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>12.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsurgery curved scissors</td>
			<td>WEP Surgical Instruments</td>
			<td>custom made</td>
			<td>11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>-</td>
			<td>30 gauge &#215; &#189; inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Te + A1R confocal head</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-F4/80</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>565410</td>
			<td>T45-2342; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Rat IgG2a, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553930</td>
			<td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing lymph node structure and cellular localization using ex-vivo confocal microscopy

Los ganglios linfáticos (LN) son órganos diseminados dentro del cuerpo, donde las respuestas inmunitarias innatas pueden conectarse con la inmunidad adaptativa. De hecho, los LN están estratégicamente interpuestos en la trayectoria de los vasos linfáticos, permitiendo el contacto íntimo de antígenos tisulares con todas las células inmunitarias residentes en el LN. Por lo tanto, la comprensión de la composición celular, distribución, ubicación e interacción utilizando imágenes LN enteras ex vivo saque a la forma en que el cuerpo coordina las respuestas inmunitarias locales y sistémicas. Este protocolo muestra una estrategia de imagen ex vivo después de una administración in vivo de anticuerpos con etiqueta fluorescente que permite una metodología muy reproducible y fácil de realizar mediante el uso de microscopios confocales convencionales y reactivos de stock. A través de la inyección subcutánea de anticuerpos, es posible etiquetar diferentes poblaciones celulares en lNes drenantes sin afectar a las estructuras tisulares que pueden ser potencialmente dañadas por una técnica de microscopía de inmunofluorescencia convencional.

Este manuscrito muestra técnicas para eliminar los ganglios linfáticos inguinales y popliteales sin dañar su estructura después de la inyección de anticuerpos con etiqueta fluorescente para manchar poblaciones celulares específicas en estos órganos (Figura1 y Figura 2 ).
La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células LN con BV421 anti-CD4 y BB515 anti-CD19 y análisis de imágenes confocales definió la localización ...

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Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Visualización de la estructura de los ganglios linfáticos y la localización celular mediante la microscopía confocal Ex-Vivo

Este protocolo describe una técnica para tomar imágenes de diferentes poblaciones celulares en el drenaje de los ganglios linfáticos sin alteraciones en la estructura del órgano.

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Este protocolo reproducible y fácil de realizar utiliza una estrategia de imágenes de ganglios linfáticos ex-vivo para rastrear el drenaje de anticuerpos fluorescentes administrados in vivo etiquetados a órganos linfoides secundarios locales. La demostración de esta técnica permite una visualización específica del procedimiento, lo que puede facilitar una ejecución exitosa del protocolo. Esta es una técnica muy simple y directa que puede ser realizada por cualquier persona.El único aspecto desafiante es el manejo del ratón, que requiere un poco de entrenamiento. Esta técnica tiene el beneficio de una mejor preservación del esfuerzo del tejido de velocidad y la viabilidad celular en comparación con los métodos de tinción fluorescente convencionales. El entrenamiento del procedimiento sería Bruna Tatematsu, una técnica del laboratorio.Diluir los anticuerpos de interés, conjugados con los fluoróforos apropiados, en 100 microlitros de PBS para la toma de imágenes de ganglios linfáticos inguinales, o 50 microlitros de PBS para la toma de imágenes de ganglios linfáticos popliteales. Para la toma de imágenes de ganglios linfáticos inguinales, cargue 100 microlitros del cóctel de anticuerpos en una jeringa de insulina de un mililitro, equipada con una aguja de calibre 30 por media pulgada, e inyecte por vía subcutánea los anticuerpos en el muslo interno del ratón experimental. Para la toma de imágenes de ganglios linfáticos popliteales, inyecte 50 microlitros del cóctel de anticuerpos por vía subcutánea en una almohadilla de pata del animal experimental.A continuación, devuelva el animal a su caja de origen. Para la recolección inguinal de los ganglios linfáticos drenantes, después de esperar al menos tres horas de la inyección, inmovilizar el ratón en la etapa acrílica con cinta adhesiva y aplicar aceite mineral sobre la piel abdominal. Utilice tijeras de microcirugía estándar y fórceps curvos de microcirugía para hacer una incisión de la piel de línea media en el abdomen desde el pubis hasta el proceso de xifoide, y disociar la musculatura abdominal de la piel.Hacer incisiones horizontales de la piel en la parte superior e inferior de la línea de incisión vertical, para crear colgajos de la piel en el lado de la inyección, y retraer la piel para visualizar el ganglio linfático. Asegure el colgajo de la piel a la placa de acrílico, y utilice los fórceps para extraer el ganglio linfático de drenaje inguinal esférico translúcido, generalmente bilobular. Para la cosecha popliteal de ganglios linfáticos drenantes, al menos 12 horas después de la inyección, inmovilizar al ratón en la posición propensa en una etapa acrílica.Aplicar aceite mineral sobre la pantorrilla y la rodilla en el lado inyectado del animal. A continuación, haz una incisión en la línea media en la pantorrilla desde el talón hasta la rodilla, y disocia la musculatura de la pantorrilla de la piel. Exponga a la fosa popliteal.El ganglio linfático popliteal aparecerá como una esfera translúcida dentro de la fosa. A continuación, extrae el ganglio linfático con los fórceps curvos de microcirugía. Para preparar el ganglio linfático para la toma de imágenes, coloque los órganos enteros en un plato de cultivo de 35 por 10 milímetros con un fondo de vidrio, y use fórceps para eliminar cualquier grasa que lo rodea.Centra el órgano en el centro del plato y cubre el tejido con un pedazo de limpiaparabrisas delicado empapado en solución salina. Para la toma de imágenes ex vivo, coloque el plato en la ranura del microscopio confocal invertido y utilice la luz convencional del microscopio confocal y el objetivo 4-10X para obtener el enfoque correcto. Cambie de la función de luz al modo láser y utilice una muestra de isótopo, no manchada o no fluorescente para ajustar la potencia, el desplazamiento y la ganancia del láser para eliminar la fluorescencia automática y cualquier tinción no especificada.Adquiere imágenes bajo los objetivos 4, 10 y 20X centrándote en la estructura de los ganglios linfáticos y la distribución celular y usando una definición de 1024 por 1024 píxeles. A continuación, utilice un programa de software de análisis de imágenes adecuado para separar los canales, agregar la escala y los colores de interés y reconstruir la vista 3D. La poderosa combinación de inmunoetiquetado de células de ganglios linfáticos con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD19 y análisis de imágenes confocales permite la localización de células T y B dentro de los ganglios linfáticos inguinales.En los ganglios linfáticos popliteales, como en el tejido inguinal, los folículos de células B están rodeados por poblaciones de células T, un sello distintivo de la estructura de los ganglios linfáticos. Como se observa en estas imágenes, los fagocitos no internalizan los anticuerpos inyectados, lo que indica que la tinción de los células B y T es específica. Además, la re-reconstrucción del etiquetado indica que la tinción de las células T y B no se superpone, lo que confirma aún más la especificidad de la tinción.Las células monocelulares se observan a lo largo del ganglio linfático inguinal, incluyendo el seno subcapsular. Con la mayoría de las células mononucleares que expresan CX3XR1, seguidas de las células doblemente positivas CCR2 y CXCR31CCR2. El mismo patrón de distribución celular y fenotipos celulares se observa en el ganglio linfático popliteal.Ambos ganglios linfáticos también exhiben regiones oscuras sin expresión del receptor de células mononucleares que están ocupadas por linfocitos. Además, las células mononucleares son escasas dentro del área interna de los ganglios linfáticos, permaneciendo concentradas en las áreas externas del tejido, lo que indica que estas células ocupan principalmente el seno subcapsular del ganglio linfático. La mezcla de anticuerpos debe inyectarse con precisión en el tejido subcutáneo para que el sistema linfático drene adecuadamente los anticuerpos contra el ganglio linfático.Este método se puede aplicar a la biodistribución de fármacos con etiqueta fluorescente y a los estudios de orientación celular de nanopartículas con etiqueta fluorescente.

Research

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