Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل جامعة يانغتشو المعين خصيصا أستاذ الصناديق الناشئة، جيانغسو المعين خصيصا أستاذ صناديق بدء التشغيل، ستة مشاريع قمم المواهب في مقاطعة جيانغسو (منحة رقم 2014-SWYY-016)، ومشروع ممول من قبل البرنامج الأكاديمي ذو الأولوية تطوير مؤسسات جيانغسو للتعليم العالي (الطب البيطري). نشكر مركز الاختبار في جامعة يانغتشو لتحليلات HPLC وMS من الفلافونويدات.

1. عزل مجموع الحمض النووي الريبي من الأنسجة النباتية26،27
<ol><li>تجانس أنسجة النبات.<ol>
<li>جمع 100 ملغ من الأنسجة النباتية الطازجة (على سبيل المثال، شتلات 4 أسابيع من أرابيدوبس ثاليانا). تجميد الأنسجة والآفات وقذائف الهاون مع النيتروجين السائل، تليها طحن الأن...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

ويركز عدد لا بأس به من الدراسات على اشتقاق الفلافونول بسبب تطبيقها المحتمل في الرعاية الصحية والصناعات الغذائية. ومع ذلك، فإن استخراج النباتات التقليدية باستخدام المذيبات العضوية والتوليف الكيميائي تمتلك عيوبا جوهرية، مما يحد من استخدامها في إنتاج الفلافونول. هنا، نبلغ عن طريقة مفصلة ل...

الفلافونول هي فئة فرعية رئيسية من الفلافونويدات النباتيةوتشارك في تطوير النبات والتصبغ 1،2،3. والأهم من ذلك، تمتلك هذه المركبات مجموعة واسعة من الأنشطةالصحية المفيدة، مثل مكافحة السرطان 4،5،المضادة للأكسدة6،المضادة للالتهابات7،الضدية8،المضادة لارتفاع ضغط الدم9 ، وخصائص استدعاء الذاكرة10، مما يؤدي إلى عدد كبير من الدراسات على هذه الأيض الثانوية المشتقة من النبات. تقليديا، هذه المركبات مشتقة أساسا من استخراج النبات باستخدام المذيبات العضوية. ومع ذلك، نظرا لمحتوياتها منخفضة جدا في النباتات11،12،13،وتكلفة الإنتاج لمعظم الفلافونول لا تزال مرتفعة، مما يفرض قيودا كبيرة على تطبيقها في الرعاية الصحية والغذاء الصناعه.
خلال العقود الماضية، وقد وضعت العلماء عدد لا بأس به من الطرق لاستخلاص الفلافونويدات14،15. ومع ذلك، فإن التركيب الكيميائي لهذه الجزيئات المعقدة تمتلك مجموعة متنوعة من العيوب الجوهرية16. فإنه يتطلب ليس فقط الكواشف السامة وظروف رد الفعل الشديد، ولكن أيضا العديد من الخطوات لإنتاج مركب الفلافونويد الهدف14،17. وعلاوة على ذلك، هناك تحد هام آخر في هذه الاستراتيجية هو التوليف تشيرال لجزيئات الفلافونويد النشطة. ولذلك، فإنه ليس استراتيجية مثالية لإنتاج الفلافونويدات على نطاق تجاري عن طريق التركيب الكيميائي16،17.
في الآونة الأخيرة، وضعت العلماء استراتيجية بديلة واعدة لإنتاج هذه المركبات الطبيعية المعقدة عن طريق الميكروبات الهندسية مع مسار للتخليق البيولوجي الفلافونويد18،19،20، 21 , 22، والتي تم فكها بنجاح في النباتات23. على سبيل المثال، قدم دوان وآخرون مسار احيائي التركيب ية في الخميرة الناشئة Saccharomyces سيريفيسياي لإنتاج kaempferol (KMF)24. مالا وآخرون أنتجت استراغالين، الفلافونول غليكوزيلاتيد، من خلال إدخالفلافانون 3-هيدروكسيلاز (f3h)،فلافونول synthase(fls1)،وUDP-الجلوكوز: الفلافونويد 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 الجينات في الجينات UGT78K1 إيتشيريشيا كوليBL21 (DE3)17. على الرغم من أن هناك عدد غير قليل من النماذج، وليس كل الميكروبات المهندسة وراثيا تنتج المنتجات ذات الأهمية بسبب تعقيد منصة الخلوية، وعدم التوافق بين العناصر الوراثية توليفها بشكل مصطنع والمضيفين، والمثبطة تأثير المنتجات المستهدفة ضد الخلايا المضيفة، وعدم استقرار النظام الخلوي المهندس نفسه16.
وثمة استراتيجية بديلة واعدة أخرى لإنتاج الفلافونويد هي إنشاء سلسلة متعددة الأنزيمات في المختبر. وقد ذكرت تشنغ وآخرون أن الإنتروزين polyketides يمكن توليفها بنجاح عن طريق تجميع مسار الأنزيمية كاملة في وعاء واحد25. هذه الاستراتيجية الاصطناعية خالية من الخلايا يتحايل على القيود المفروضة على مصنع إنتاج الميكروبات، وبالتالي هو ممكن لإنتاج بعض الفلافونويدات في كمية كبيرة16.
في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير بنجاح نظام ثنائي الإنزيم الاصطناعية لتحويل naringenin (NRN) إلى KMF في وعاء واحد16. هنا، ونحن نصف هذا النظام في تفاصيل كبيرة والأساليب التي ينطوي عليها تحليل المنتجات. كما نقدم مثالين يستخدمان هذا النظام لإنتاج KMF من NRN وquercetin (QRC) من eriodictyol (ERD). وبالإضافة إلى ذلك، نناقش الخطوات الحاسمة لهذا الأسلوب والاتجاهات البحثية المستقبلية في التركيب الحيوي للفلافونويدات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

الفلافونول هي فئة فرعية رئيسية من الفلافونويدات مع مجموعة متنوعة من الأنشطة البيولوجية والدوائية. هنا، ونحن نقدم طريقة للتوليف الأنزيمي في المختبر من الفلافونول. في هذه الطريقة ، يتم استنساخ Atf3h و Atfls1، وهما الجينات الرئيسية في المسار التركيبي الحيوي للفلافونول ، ومبالغ فيها في الإشريكية القولونية. يتم تنقية الإنزيمات المؤتلفة عن طريق عمود تقارب ثم يتم إنشاء سلسلة بينزيمية في مخزن اصطناعي محدد. يتم تصنيع اثنين من الفلافونول في هذا النظام كأمثلة ويتم تحديدها من قبل تحليل TLC وHPLC/LC/MS. طريقة يظهر مزايا واضحة في اشتقاق الفلافونول على النهج الأخرى. وهو موفر للوقت والعمالة وعالي الفعالية من حيث التكلفة. رد الفعل من السهل أن يتم التحكم فيها بدقة وبالتالي رفع مستوى الإنتاج الضخم. يمكن تنقية المنتج المستهدف بسهولة بسبب المكونات البسيطة في النظام. ومع ذلك، عادة ما يقتصر هذا النظام على إنتاج الفلافونول من الفلافانون.

F3H و FLS1 هما الإنزيمات الرئيسية الهامة في تحويل فلافانون إلى فلافونول في النباتات كما هو مبين في الشكل 1. تطوير نظام التركيب الحيوي في المختبر لإنتاج الفلافونول من الفلافانون، Atf3h (انضمام GenBank لا. NM_114983.3) وAtfls1 (انضمام GenBank رقم تم استنساخ الجينات NM_12095...

Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

اشتقاق الفلافونول أمر بالغ الأهمية لتطبيقه في الرعاية الصحية وصناعة الأغذية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للتخليق البيولوجي للفلافونول من الفلافانون ومناقشة الخطوات الحاسمة ومزاياه على النهج الأخرى.

التركيب الحيوي للفلافونول من فلافانون عن طريق إنشاء تتالي بينزيماتي واحد وعاء

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

باستخدام هذا البروتوكول، يمكننا بسهولة إنتاج عدد كبير من الفلافونول من فلافانونيس في وعاء واحد. هذه التقنية هي توفير العمالة والوقت، وفعالة للغاية من حيث التكلفة، وسهلة للسيطرة، لذلك لديها إمكانات التصنيع ضخمة. نعم، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في الإنتاج الاقتصادي من الأيض الثانوية الأخرى، لكنه يحتاج إلى بعض التعديلات عند تطبيقها عليه.وقال انه عادة ما تحصل على أي شيء أو منخفضة جدا العائد. نصيحتي هي التعامل مع الإنزيمات المؤتلفة على الجليد وإضافة 10٪ الجلسرين إلى محلول الأسهم من الإنزيمات. وذلك لأنه فقط من خلال مظاهرة بصرية يمكن اليد الجديدة فهم التفاصيل الهامة والحقيقة التي تؤثر على التنفيذ الناجح للتجربة.أولاً إعداد المخازن المؤقتة. جعل العازلة الاصطناعية مرتين عن طريق حل كمية مناسبة من TRIS-قاعدة، أسكوربات الصوديوم، حمض ألفا كيتوغلوتاريك في المياه دي المؤين، وماصة كمية مناسبة من الجلسرين إلى الحل. استخدام ماصة لإضافة حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة إلى 7.2، وضبط حجم بإضافة المياه دي المتأينة.تخزين العازلة الاصطناعية مرتين في أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل. ثم جعل حل الأسهم 100 مرات عن طريق حل كبريتات الحديد في المياه ديونيد. جعل حل الأسهم من 25 مليمولار الفلافونويد عن طريق حل الفلافونويد في الميثانول، وتخزين الحل في ناقص 20 درجة مئوية.الخطوة الأكثر أهمية هي إنشاء نظام اصطناعي. لإنشاء نظام اصطناعي لإنتاج فلافانول من فلافانون ، قم أولاً بإعداد النظام الصناعي في أنبوب ملليلتر وفقًا للكاشيف المدرجة في هذا الجدول. ضع الأنبوب المفتوح في كتلة حرارة تهتز عند 40 درجة مئوية ، عند 600 دورة في الدقيقة لمدة أربعين دقيقة.بعد ذلك، إنهاء التفاعل بإضافة 10 ميكرولترات من حمض الخليك، و 100 ميكرولترات من خلات الإيثيل. بعد ساعتين، استخدم ماصة لتعقّد المرحلة العضوية العليا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر، ووضع الأنبوب في غطاء للتجفيف في درجة حرارة الغرفة. لأداء تحليل TLC ، أول استرداد الأنابيب من غطاء محرك السيارة ، وإعادة الذوبان مسحوق فلافانويد في 160 ميكرولترات من الميثانول في أنبوب.إعداد عينات الفلافونويد أصيلة مع تركيزات تسلسلية، عن طريق تخفيف 25 ملولار محلول مخزون الفلافونويد في الميثانول. تحميل ميكرولتر واحد من عينة رد فعل redissolved، وميكر واحد من عينة الفلافونويد أصيلة، على لوحة بوليميد. تفعل الشيء نفسه بالنسبة لتركيزات أخرى من الفلافونويد أصيلة على نفس لوحة.ثم في غطاء الدخان، ووضع لوحة عينة محملة في اسطوانة الكروماتوغرافيا مليئة نظام المذيبات. إرفاق لوحة إلى الجزء السفلي من الاسطوانة، وتشغيل لوحة في نظام المذيبات لمدة 20 دقيقة. الهواء يجف الأطباق في درجة حرارة الغرفة.مع زجاجة بخاخ، رش لوحات مع 1٪ حل إيثانول من كلوريد الألومنيوم، تليها تجفيف الهواء مرة أخرى في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تصور البقع على لوحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر، واتخاذ الصور، ثم على الكمبيوتر، وفتح برنامج ImageJ. انقر فوق الملف، فتح، لفتح الصورة ليتم تحليلها.انقر فوق أداة التحديد المستطيلة على اليسار في واجهة مستخدم ImageJ. Outline في صورة العائد على الاستثمار مع الماوس ، واضغط على واحد لتسمية أول عائد الاستثمار. حرك التحديد المستطيل مع الماوس إلى عائد الاستثمار التالي، واضغط على اثنين لتسمية عائد الاستثمار الثاني.كرر تسمية كافة ROIs الأخرى عن طريق الضغط على اثنين. اضغط على ثلاثة لإنشاء مخططات ملف تعريفي لجميع ROIs ، في نافذة منبثقة. ثم استخدم أداة تحديد الخط المستقيم لإسقاط خطوط الأساس لتحديد منطقة مغلقة لكل ذروة اهتمام.قم بتنشيط أداة العصا، عن طريق النقر على الرمز المقابل في واجهة مستخدم ImageJ. انقر داخل القمة لعرض نتائج جميع القمم في نافذة منبثقة. بعد ذلك ، في إكسيل ، رسم القيم الرمادية من النافذة المنبثقة ضد تركيزات الفلافونويد المقابلة ، لجعل منحنى معيار TLC أساسها من الفلافونويد أصيلة.ثم حساب العائد من الفلافونويد من الفائدة المنتجة في هذا البروتوكول، وفقا للصيغة الناتجة. استخدام حقنة لمعالجة كل عينة بالتسلسل من خلال 0.45 ميكرومتر و 0.22 مرشحات ميكرومتر. قم بتحميل العينات في نظام HPLC-MS من خلال فوهة الشفط، ثم افصل العينات عند 30 درجة مئوية باستخدام عمود C18.Elute العمود في ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة من قبل تدرج من 10 إلى 85 في المائة حجم نيتريل أسيتيل في الماء، ورصد امتصاص من eluate من 200 إلى 800 نانومتر. إجراء تحليل LC-MS في وضع أيون سالب، مع تدفق النيتروجين تجفيف 10 لترات في الدقيقة الواحدة في 300 درجة مئوية، في تدفق الغاز غدد من سبعة لترات في الدقيقة الواحدة في 250 درجة مئوية، وجمع البيانات باستخدام بنيت في البرامج. لاستخراج كروماتوغرافية أحادية الطول الموجي، افتح برنامج التحليل النوعي، وانقر فوق ملف، افتح ملف البيانات.حدد الملف الذي سيتم تحليله في إطار ملف البيانات المفتوح، وانقر فوق فتح لفتح الملف. انقر بزر الماوس الأيمن في نافذة نتائج الكروماتوغرام ثم استخراج الكروماتوجرامات في القائمة المنبثقة. في قائمة الأنواع، انقر على الكروماتوجرامات الأخرى.في مربع التحرير والسرد للكشف عن ، حدد DAD1 ، ثم انقر فوق موافق لعرض النتائج HPLC في إطار نتائج الكروماتوجرام. انقر فوق رمز التكامل اليدوي المرسو في أعلى نافذة نتائج الكروماتوغرام. رسم خط الأساس للذروة المطلوبة لتحليل التكامل اليدوي باستخدام الماوس.انقر فوق عرض ، قائمة الذروة التكامل ، لعرض النتائج. نسخ نتائج مناطق الذروة إلى Excel، ومؤامرة منحنى HPLC القياسية القائمة على الفلافونويد أصيلة ضد تركيزات الفلافونويد المقابلة، ثم حساب العائد من الفلافونويد من الفائدة المنتجة في هذا البروتوكول وفقا للصيغة الناتجة. ثم كرر نفس الإجراءات لاستخراج الكروماتوجرامات أحادية الطول الموجي لتحليل بيانات التصلب المتعدد للكتلة الدقيقة لمركبات الفلافونويد.انقر فوق رمز تحديد النطاق على شريط أدوات نتائج الكروماتوغرام. حدد ذروة الفائدة. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس في النطاق المحدد، وانقر على مستخلصات MS الطيف في القائمة المنبثقة لعرض النتائج في نافذة نتائج الطيف MS.لتحديد ما إذا كان هذا النظام في المختبر يمكن استخدامها لتحويل فلافانون إلى فلافونول، تم إضافة NRN إلى النظام. وظهرت بقعتان جديدتان على لوحة من البولي أميد TLC. وأظهرت إحدى البقعة مسافة هجرة مماثلة للمسافة التي تفصل بين وزارة الصحة وتكفّل الأخرى بمسافة هجرة مماثلة لتلك التي كانت في منطقة KMF.وقد أظهر تحليل آخر أجراه كل من HPLC وLC-MS أن المادة الكيميائية الجديدة أظهرت وقت احتفاظ بـ 12 دقيقة و20 دقيقة على التوالي، في ذروة أيونات شبه جزيئية M على Z عند 287 و285 والتي كانت مطابقة لتلك التي في DHK و KMF. ولتحديد ما إذا كان النظام يمكن استخدامه لتحويل الفلافونات الأخرى إلى فلافونولاتها المقابلة، تمت إضافة ERD إلى النظام. اثنين من البقع الجديدة على لوحة TLC بوليميد عرض مسافة الهجرة مماثلة لتلك التي من DHQ وQRC على التوالي.وقد أظهرت تحليلات HPLC وLC-MS أن هذه المواد الكيميائية الجديدة كشفت عن وقت احتفاظ قدره 10 دقائق و16 دقيقة على التوالي، وذرية شبه جزيئية أيون M على Z في 303 و301، والتي تتوافق تماما مع تلك DHQ وQRC. عند إعداد النظام الاصطناعية، يجب إضافة إنزيم أخيرا، وإضافة كبريتات الحديد الثاني إلى الماضي. نعم، فإنه يوفر دليلا للإنتاج الاقتصادي من المستقلبات الثانوية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

بروتوكول تنقية مصممة HPLC أن ينتج عالية النقاء اميلويد بيتا اميلويد بيتا 42 و 40 الببتيدات، قادرة على قليل وحدات تشكيل

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

التحلل من شيف-قاعدة ني مجمع الظروف عن طريق مناسبة للاحتباس حماية المجموعات حمض عطوب

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

البروتين فيلم الأشعة تحت الحمراء كهربية أبداه Hydrogenase [NiFe] للدراسة لأكسدة2 ح

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

إزالة واستبدال الليغندات الذاتية من البروتينات والمواد المسببة للحساسية المرتبطة بالدهون

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...