Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Dette arbejde blev finansielt støttet af Yangzhou University Special udnævnt professor start-up fonde, Jiangsu specielt udnævnt professor start-up fonde, seks talent Peaks projekt i Jiangsu provinsen (Grant No. 2014-SWYY-016), og et projekt finansieret af den prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (veterinærmedicin). Vi takker test Center for Yangzhou University for HPLC og MS analyser af flavonoider.

1. Isoler totalt RNA fra plantevæv26,27
<ol><li>Homogenisere plante vævet.<ol>
<li>Saml 100 mg af et frisk plantevæv (f. eks. 4-ugers gamle frøplanter fra Arabidopsis thaliana). Fryse vævet og en Pestle og mørtel med flydende nitrogen, efterfulgt af slibning af vævet i pulver.</li>
		<li>Tilsæt 1 mL RNA-isolations reagens (Se tabel over materialer) til mørtel. Reagenset vil straks blive frosset. Vævsprøven homogeniseres med ...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

En hel række undersøgelser er fokuseret på derisering af flavonoler på grund af deres potentielle anvendelse i sundhedssektoren og fødevareindustrien. Men traditionel plante ekstraktion med organiske opløsningsmidler og kemisk syntese besidder iboende ulemper, som begrænser deres anvendelse i produktionen af flavonoler. Her rapporterer vi en detaljeret metode til fremstilling af en flavonol fra en flavanonglucosid i en gryde ved at etablere en in vitro bienzymatisk kaskade. De kritiske trin i denne protokol er: 1)...

Flavonoler er en stor under klasse af plante flavonoider og er involveret i plante udvikling og pigmentering1,2,3. Endnu vigtigere, disse forbindelser besidder en bred vifte af sundheds-gavnlige aktiviteter, såsom anti-cancer4,5, anti-oxidativ6, anti-inflammatorisk7, anti fedme8, anti-hypertensive9 og hukommelse Recall egenskaber10, hvilket fører til et stort antal undersøgelser af disse plante afledte sekundære metabolitter. Traditionelt er disse forbindelser hovedsageligt afledt af plante ekstraktion med organiske opløsningsmidler. Men på grund af deres meget lave indhold i planter11,12,13, produktionsomkostningerne for de fleste flavonoler fortsat høj, hvilket indebærer store begrænsninger på deres anvendelse i sundhedssektoren og fødevarer Industri.
I løbet af de seneste årtier, forskere har udviklet en hel række metoder til at udlede flavonoider14,15. Men, kemisk syntese af disse komplicerede molekyler besidder en række iboende ulemper16. Det kræver ikke kun giftige reagenser og ekstreme reaktionsbetingelser, men også mange skridt til at producere et mål flavonoid sammensatte14,17. Desuden er en anden vigtig udfordring i denne strategi er den chirale syntese af aktive flavonoid molekyler. Derfor er det ikke en ideel strategi at producere flavonoider i kommerciel målestok via kemisk syntese16,17.
For nylig har forskerne udviklet en lovende alternativ strategi for at producere disse komplicerede naturlige forbindelser ved hjælp af tekniske mikrober med en vej for flavonoid biosyntese18,19,20, 21 , 22, som med succes er blevet dechiseret i planter23. F. eks. indførte Duan et al. en biosyntetisk vej ind i den spirende gær Saccharomyces cerevisiae til fremstilling af kaempferol (kmf)24. Malla et al. produceret astragalin, en glykosyleret flavonol, ved at introducereflavanonglucosid 3-hydroxylase (f3h), flavonol syntase (fls1), og UDP-glucose: flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 gener i Escherichia coliBL21 (DE3)17. Selv om der er en hel del paradigmer, ikke alle genetisk manipulerede mikrober producere produkter af interesse på grund af kompleksiteten af en cellulære platform, uforenelighed mellem kunstigt syntetiserede genetiske elementer og værter, den hæmmende effekt af Target produkter mod værtsceller, og ustabilitet af en manipuleret cellulære system selv16.
En anden lovende alternativ strategi for flavonoid produktion er at etablere en multienzymatisk kaskade in vitro. Cheng et al. har rapporteret, at enterocin polyketides kan med succes syntetiseres ved at samle en komplet enzymatisk pathway i en pot25. Denne celle frie syntetiske strategi omgår begrænsningerne af en mikrobiel produktionsfabrik og er dermed gennemførlig til at producere nogle flavonoider i store mængder16.
For nylig har vi med succes udviklet et bienzym syntetisk system til at konvertere naringenin (NRN) til KMF i en pot16. Her beskriver vi dette system i store detaljer og de metoder, der er involveret i at analysere produkterne. Vi præsenterer også to eksempler, der bruger dette system til at producere KMF fra NRN og quercetin (QRC) fra eriodictyol (ERD). Derudover diskuterer vi vigtige trin i denne metode og fremtidige forskningsretninger i biosyntesen af flavonoider.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

Flavonoler er en stor under klasse af flavonoider med en række biologiske og farmakologiske aktiviteter. Her, vi giver en metode til in vitro enzymatiske syntese af en flavonol. I denne metode, Atf3h og Atfls1, to vigtige gener i den biosyntetiske vej af flavonoler, er klonet og overudtrykt i Escherichia coli. De rekombinante enzymer renses via en affinitets kolonne, og derefter etableres en bienzymatisk kaskade i en specifik syntetisk buffer. To flavonoler syntetiseres i dette system som eksempler og bestemmes af TLC og HPLC/LC/MS analyser. Metoden viser indlysende fordele i afledningen af flavonoler over andre tilgange. Det er tid-og arbejdsbesparende og meget omkostningseffektiv. Reaktionen er let at blive præcist kontrolleret og dermed opskaleret til masseproduktion. Målproduktet kan renses let på grund af de enkle komponenter i systemet. Men dette system er normalt begrænset til produktion af en flavonol fra en flavanone.

F3H og FLS1 er to vigtige nøgle enzymer i omdannelsen af en flavanonglucosid til en flavonol i planter som vist i figur 1. At udvikle et in vitro biosyntetisk system til fremstilling af en flavonol fra en flavanone, Atf3h (genbank tiltraedelsesnr. NM_ 114983.3) og Atfls1 (genbanks tiltraedelsesnr. Nm_ 120951.3) gener blev klonet fra frøplanterne af 4-ugers-gamle A. thaliana i en prokaryote udtryk vektor pET-32a (+). De rekombinant...

Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Afledningen af en flavonol er afgørende for dens anvendelse i sundhedssektoren og fødevareindustrien. Her giver vi en detaljeret protokol for biosyntesen af en flavonol fra en flavanonglucosid og diskuterer de afgørende skridt og dens fordele i forhold til andre tilgange.

Biosyntese af en flavonol fra en Flavanone ved at etablere en en-pot Bienzymatisk kaskade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Ved hjælp af denne protokol, kan vi nemt producere en lang række flavonoler fra flavanones i en gryde. Denne teknik er arbejdskraft-og tidsbesparende, meget omkostningseffektiv, og let at kontrollere, så det har et enormt industrialiseringspotentiale. Ja, denne metode kan give indsigt i den økonomiske produktion af andre sekundære metabolitter, men det har brug for nogle ændringer, når de anvendes på det.Han vil normalt få noget eller meget lavt udbytte. Mit råd er at håndtere rekombinant enzymer på is og tilføje 10% glycerin til bestanden opløsning af enzymer. Det skyldes, at kun gennem visuel demonstration kan en ny hånd forstå de vigtige detaljer og sandhed, der påvirker en vellykket udførelse af eksperimentet.Først forberede buffere. Lav to gange syntetisk buffer ved at opløse passende mængde TRIS-base, natrium ascorbat, alfa ketoglutarisk syre i de-ioniseret vand, og pipette passende mængde glycerol til opløsningen. Brug en pipette til at tilsætte saltsyre til at justere pH til 7,2, og juster volumen ved at tilsætte de-ioniseret vand.Opbevar den to gange syntetiske buffer ved fire grader Celsius til fremtidig brug. Derefter laves en 100 gange lageropløsning ved at opløse jernsulfat heptahydrat i deioniseret vand. Lav en lageropløsning på 25 millimolar flavonoid ved opløsning af flavonoid i methanol, og opbevar opløsningen ved minus 20 grader Celsius.Det mest kritiske skridt er at oprette et syntetisk system. For at oprette et syntetisk system til fremstilling af en flavanol fra en flavanone skal det syntetiske system først fremstilles i et rør med to milliliter i henhold til de reagenser, der er anført i denne tabel. Placer det åbne rør i en rystende varmeblok ved 40 grader Celsius, ved 600 rpm i fyrre minutter.Derefter afsluttes reaktionen ved at tilsætte 10 mikroliter eddikesyre og 100 mikroliter ethylacetat. To timer senere, bruge en pipette til at tranfer den øverste organiske fase til en 1,5 milliliter rør, og placere røret i en hætte til lufttørring ved stuetemperatur. For at udføre TLC-analyse skal du først hente rørene fra emhætten og genså det flavanoide pulver i 160 mikroliter methanol i et rør.Der forbered autentiske flavonoidprøver med serielle koncentrationer ved at fortynde 25 millimolar flavonoidbestandopløsningen i methanol. Der indlæses en mikroliter af den gensolisolerede reaktionsprøve og en mikroliter af den autentiske flavonoidprøve på en polyamidplade. Gør det samme for de andre koncentrationer af autentisk flavonoid på samme plade.Derefter i en røghætte, sætte prøven lastet plade i en kromatografi cylinder fyldt med et opløsningsmiddel system. Fastgør pladen til bunden af cylinderen, og kør pladen i opløsningsmiddelsystemet i 20 minutter. Lufttørre pladerne ved stuetemperatur.Med en sprøjteflaske, spray pladerne med 1% ethanolisk opløsning af aluminiumchlorid, efterfulgt af lufttørring igen ved stuetemperatur i 30 minutter. Visualiser pletterne på pladerne under et UV-lys ved 254 nanometer, og tag billeder, derefter på computeren, skal du åbne softwaren ImageJ. Klik på fil, åbn, for at åbne det billede, der skal analyseres.Klik på det mest rektangulære markeringsværktøj til venstre i brugergrænsefladen ImageJ. Kontur investeringsafkastet i billedet med musen, og tryk på en for at mærke det første investeringsafkast. Flyt den rektangulære markering med musen direkte til det næste investeringsafkast, og tryk på to for at mærke det andet investeringsafkast.Gentag for at mærke alle andre ROI'er ved at trykke på to. Tryk på tre for at generere profilområder for alle ROI'er i et pop op-vindue. Brug derefter værktøjet til lige linjemarkering til at droppe grundlinjer for at definere et lukket område for hver interessetop.Aktiver tryllestavsværktøjet ved at klikke på det tilsvarende ikon i ImageJ-brugergrænsefladen. Klik inde i toppen for at få vist resultater for alle toppe i et pop op-vindue. Dernæst afbilde de grå værdier fra pop-up-vinduet i Excel i forhold til de tilsvarende flavonoidkoncentrationer for at lave en TLC-baseret standardkurve af den autentiske flavonoid.Derefter beregne udbyttet af flavonoid af interesse produceret i denne protokol, i henhold til den resulterende formel. Brug en sprøjte til at behandle hver prøve sekventielt gennem et 0,45 mikrometer og 0,22 mikrometerfiltre. Prøverne indbelæssles i et HPLC-MS-system gennem sugedysen, og prøven adskilles ved 30 grader Celsius ved hjælp af en C18-kolonne.Kolonnen elueres med en milliliter pr. minut med en gradient på 10 til 85 volumen procent acetylnitril i vand, og absorbering af eluatet fra 200 til 800 nanometer overvåges. Udfør LC-MS-analysen i en negativ iontilstand med en tørring af nitrogenstrøm på 10 liter i minuttet ved 300 grader Celsius, i en kappegasstrøm på syv liter i minuttet ved 250 grader Celsius, og indsaml data ved hjælp af en indbygget software. Hvis du vil udtrække kromatografer med en bølgelængde, skal du åbne det kvalitative analyseprogram og klikke på fil, åbne datafilen.Vælg den fil, der skal analyseres i det åbne datafilvindue, og klik på åbn for at åbne filen. Højreklik med musen i vinduet med resultater for kromatogrammet, og udpkæmp derefter kromatogrammer i en pop op-menu. Klik på andre kromatogrammer på typelisten.Vælg DAD1 i kombinationsboksen detektor, og klik derefter på okay for at få vist HPLC-resultaterne i vinduet med resultater af kromatogrammet. Klik på ikonet for manuel integration, der er forankret øverst i vinduet med kromatogramresultater. Tegn basislinje for den spidsbelastning, der kræves til manuel integrationsanalyse med musen.Klik på visning, integration peak liste, for at få vist resultaterne. Kopier resultaterne af topområderne til Excel, og plot en HPLC-baseret standardkurve af den autentiske flavonoid mod de tilsvarende flavonoidkoncentrationer, og beregn derefter udbyttet af den interesse, der produceres i denne protokol i henhold til den resulterende formel. Gentag derefter de samme procedurer for at udtrække enkelte bølgelængdekromatogrammer for at analysere MS-data for den nøjagtige masse af flavonoidforbindelser.Klik på ikonet for valg af område på værktøjslinjen kromatogramresultater. Vælg toppen af interesse. Højreklik med musen i det valgte område, og klik på ekstrakt MS-spektret i pop op-menuen for at få vist resultaterne i vinduet med resultater for MS-spektrum.For at afgøre, om dette in vitro-system kan anvendes til omdannelse af en flavanone til en flavonol, blev NRN tilføjet til systemet. Der var to nye pletter opstået på en polyamid TLC plade. Et sted viste en migrationsafstand svarende til DHK, og de andre ligner kmf.Yderligere analyser foretaget af HPLC og LC-MS viste, at det nye kemikalie viste en retentionstid på henholdsvis 12 minutter og 20 minutter i en kvasikylær iontop M over Z ved 287 og 285, som var identiske med DHK's og KMF's. For at afgøre, om systemet kan bruges til omdannelse af andre flavanoner til deres tilsvarende flavonoler, blev ERD tilføjet til systemet. To nye pletter på en polyamid TLC plade viste en migrationsafstand svarende til DHQ og QRC hhv.HPLC- og LC-MS-analyser viste, at disse nye kemikalier afslørede en retentionstid på henholdsvis 10 minutter og 16 minutter og en kvasi-molekylær iontop M over Z ved 303 og 301, hvilket nøjagtigt svarede til DHQ's og QRC's. Når du forbereder det syntetiske system, skal du tilføje enzymet til sidst, og tilsæt jernsulfat sekunder til sidste. Ja, det giver en vejledning for den økonomiske produktion af andre sekundære metabolitter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En skræddersyet HPLC Oprensning protokol, der giver høj renhed Amyloid Beta 42 og Amyloid Beta 40 Peptider, der kan oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyseprodukter af en Ni-Schiff-Base Complex Brug af betingelser egnet til Bevarelse af syrelabile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infrarød elektrokemi demonstrerede for undersøgelse af H2 Oxidation af en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

En gær 2-Hybrid skærm i Batch for at sammenligne Protein interaktioner

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering af lipoprotein partikler fra hønseæg æggeblomme til undersøgelse af bakteriel Patogenchlorid fedtsyre inkorporering i membran Fosfolipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...