Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
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Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von yangzhou University Specially Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province (Grant No. 2014-SWYY-016) und einem Projekt, das von die vorrangige Entwicklung des Akademischen Programms der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (Veterinärmedizin). Wir danken dem Testing Center der Yangzhou University für HPLC- und MS-Analysen von Flavonoiden.

1. Isolieren der gesamten RNA aus Pflanzengeweben26,27
<ol><li>Homogenisieren Sie das Pflanzengewebe.<ol>
<li>Sammeln Sie 100 mg eines frischen Pflanzengewebes (z. B. 4 Wochen alte Sämlinge aus Arabidopsis thaliana). Einfrieren Sie das Gewebe und einen Stößel und Mörtel mit flüssigem Stickstoff, gefolgt von dem Schleifen des Gewebes in Pulver.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml RNA-Isolationsreagenz (siehe Materialtabelle)in den Mörtel e...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

Eine ganze Reihe von Studien konzentrieren sich auf die Ableitung von Flavonolen aufgrund ihrer möglichen Anwendung in der Gesundheits- und Lebensmittelindustrie. Die traditionelle Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln und der chemischen Synthese hat jedoch intrinsische Nachteile, die ihre Verwendung bei der Herstellung von Flavonolen einschränken. Hier berichten wir über eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon in einem Topf, indem wir eine in vitro bienzymatische Kask...

Flavonole sind eine wichtige Unterklasse von Pflanzenflavonoiden und sind an der Pflanzenentwicklung und Pigmentierung1,2,3beteiligt. Noch wichtiger ist, diese Verbindungen besitzen eine breite Palette von gesundheitsfördernden Aktivitäten, wie Anti-Krebs4,5, antioxidative6, entzündungshemmende7, Anti-Adipositas8, anti-hypertensive9 , und Speicher-Rückruf Eigenschaften10, was zu einer großen Anzahl von Studien über diese pflanzlichen abgeleiteten sekundären Metaboliten. Traditionell werden diese Verbindungen hauptsächlich aus der Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen. Aufgrund ihres sehr geringen Gehalts in den Werken11,12,13bleiben die Produktionskosten für die meisten Flavonole jedoch hoch, was ihre Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelversorgung stark eingeschränkt. industrie.
In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler eine ganze Reihe von Methoden entwickelt, um Flavonoide14,15abzuleiten. Die chemische Synthese dieser komplizierten Moleküle besitzt jedoch eine Vielzahl von intrinsischen Nachteilen16. Es erfordert nicht nur toxische Reagenzien und extreme Reaktionsbedingungen, sondern auch viele Schritte, um eine Ziel-Flavonoid-Verbindung14,17zu produzieren. Darüber hinaus ist eine weitere wichtige Herausforderung in dieser Strategie die chirale Synthese von aktiven Flavonoidmolekülen. Daher ist es keine ideale Strategie, Flavonoide im kommerziellen Maßstab über chemische Synthese16,17zu produzieren.
Kürzlich haben Wissenschaftler eine vielversprechende alternative Strategie entwickelt, um diese komplizierten natürlichen Verbindungen durch technische Mikroben mit einem Weg für Flavonoid-Biosynthese18,19,20, 21 , 22, die in Denbetrieben erfolgreich entziffert wurde23. Zum Beispiel, Duan et al. führte einen biosynthetischen Weg in die angehende Hefe Saccharomyces cerevisiae Kaempferol (KMF)24. Malla et al. produzierten Astragalin, ein glykosyliertes Flavonol, durch Einbringen vonFlavanon 3-Hydroxylase (f3h), Flavonol-Synthase (fls1) und UDP-Glucose:flavonoid 3-O-Glucosyltransferase UGT78K1-Genen in Escherichia coliBL21(DE3)17. Obwohl es eine ganze Reihe von Paradigmen gibt, produzieren nicht alle gentechnisch veränderten Mikroben die Produkte von Interesse aufgrund der Komplexität einer zellulären Plattform, der Inkompatibilität zwischen künstlich synthetisierten genetischen Elementen und Wirten, der hemmenden Wirkung von Zielprodukten gegen Wirtszellen und die Instabilität eines technischen Zellsystems selbst16.
Eine weitere vielversprechende Alternative zur Flavonoidproduktion ist die Etablierung einer multienzymatischen Kaskade in vitro. Cheng et al. haben berichtet, dass Enterocin-Polyketide erfolgreich synthetisiert werden können, indem sie einen kompletten enzymatischen Weg in einem Topf25zusammenstellen. Diese zellfreie synthetische Strategie umgeht die Beschränkungen einer mikrobiellen Produktionsfabrik und ist somit für die Herstellung einiger Flavonoide in großer Menge16machbar.
Kürzlich haben wir erfolgreich ein bienzym-synthetisches System entwickelt, um Naringenin (NRN) in KMF in einem Topf16umzuwandeln. Hier beschreiben wir dieses System ausführlich und die Methoden, die bei der Analyse der Produkte zum Einsatz kommen. Wir stellen auch zwei Beispiele vor, die dieses System verwenden, um KMF aus NRN und Quercetin (QRC) aus Eriodictyol (ERD) zu produzieren. Darüber hinaus diskutieren wir entscheidende Schritte dieser Methode und zukünftige Forschungsrichtungen in der Biosynthese von Flavonoiden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

Flavonole sind eine der wichtigsten Unterklassen von Flavonoiden mit einer Vielzahl von biologischen und pharmakologischen Aktivitäten. Hier bieten wir eine Methode zur in vitro enzymatischen Synthese eines Flavonols. Bei dieser Methode werden Atf3h und Atfls1, zwei Schlüsselgene im biosynthetischen Weg der Flavonole, geklont und in Escherichia coliüberexprimiert. Die rekombinanten Enzyme werden über eine Affinitätssäule gereinigt und dann wird in einem spezifischen synthetischen Puffer eine bienzymatische Kaskade aufgebaut. Zwei Flavonole werden in diesem System als Beispiele synthetisiert und durch TLC- und HPLC/LC/MS-Analysen bestimmt. Die Methode zeigt offensichtliche Vorteile bei der Ableitung von Flavonolen gegenüber anderen Ansätzen. Es ist zeit- und arbeitssparend und sehr kostengünstig. Die Reaktion lässt sich einfach genau steuern und somit für die Massenproduktion hochskalieren. Das Zielprodukt lässt sich durch die einfachen Komponenten im System einfach reinigen. Jedoch, Dieses System ist in der Regel auf die Herstellung eines Flavonolaus aus einem Flavanon beschränkt.

F3H und FLS1 sind zwei wichtige Schlüsselenzyme bei der Umwandlung eines Flavanons in ein Flavonol in Pflanzen, wie in Abbildung 1dargestellt. Entwicklung eines in vitro biosynthetischen Systems zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon, Atf3h (GenBank-Beitritt Nr. NM_114983.3) und Atfls1 (GenBank-Beitritt Nr. NM_120951.3) Gene wurden aus den Sämlingen des 4 Wochen alten A. thaliana zu einem prokaryotischen Expressionsvek...

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Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Die Ableitung eines Flavonols ist entscheidend für seine Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelindustrie. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon zur Verfügung und diskutieren die entscheidenden Schritte und seine Vorteile gegenüber anderen Ansätzen.

Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon durch Die Etablierung einer Ein-Topf-Bienzymatischen Kaskade

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Mit diesem Protokoll können wir leicht eine ganze Reihe von Flavonolen aus Flavanonen in einem Topf produzieren. Diese Technik ist arbeits- und zeitsparend, sehr kostengünstig und leicht zu kontrollieren, so dass sie ein enormes Industrialisierungspotenzial hat. Ja, diese Methode kann Einblick in die wirtschaftliche Produktion anderer sekundärer Metaboliten geben, aber sie erfordert einige Änderungen, wenn sie angewendet wird.Er wird in der Regel nichts oder sehr geringe Ausbeute bekommen. Mein Rat ist, rekombinante Enzyme auf Eis zu behandeln und 10% Glycerin in die Stammlösung von Enzymen hinzuzufügen. Das liegt daran, dass nur durch visuelle Demonstration eine neue Hand die wichtigen Details und Wahrheiten verstehen kann, die die erfolgreiche Durchführung des Experiments beeinflussen.Bereiten Sie zunächst Puffer vor. Machen Sie zweimal synthetischepuffer, indem Sie die entsprechende Menge an TRIS-Basis, Natriumascorbat, Alpha-Ketoglutersäure in entionisiertes Wasser und Pipette entsprechend viel Glycerin für die Lösung auflösen. Verwenden Sie eine Pipette, um Salzsäure hinzuzufügen, um den pH-Wert auf 7,2 einzustellen, und passen Sie die Lautstärke durch Zugabe von entionisiertem Wasser an.Bewahren Sie den zweifachen synthetischen Puffer bei vier Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf. Dann machen Sie eine 100-fache Stammlösung, indem Sie Eisensulfat-Heptahydrat in entionisiertem Wasser auflösen. Machen Sie eine Lagerlösung von 25 Millimolar Flavonoid durch Lösen von Flavonoid in Methanol, und speichern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius.Der wichtigste Schritt ist die Einrichtung eines synthetischen Systems. Um ein synthetisches System zur Herstellung eines Flavanols aus einem Flavanon einzurichten, bereiten Sie zunächst das synthetische System in einem Zwei-Milliliter-Rohr gemäß den in dieser Tabelle aufgeführten Reagenzien vor. Legen Sie das offene Rohr in einem schüttelnden Wärmeblock bei 40 Grad Celsius, bei 600 U/min für vierzig Minuten.Danach beenden Sie die Reaktion, indem Sie 10 Mikroliter Essigsäure und 100 Mikroliter Ethylacetat hinzufügen. Zwei Stunden später verwenden Sie eine Pipette, um die obere organische Phase auf ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen, und legen Sie das Rohr in eine Haube für die Lufttrocknung bei Raumtemperatur. Um eine TLC-Analyse durchzuführen, rufen Sie zunächst die Rohre aus der Haube ab und lösen Sie das Flavanoidpulver in 160 Mikroliter Methanol in einem Rohr wieder auf.Bereiten Sie authentische Flavonoidproben mit seriellen Konzentrationen vor, indem Sie die 25 Millimolar Flavonoid-Stammlösung in Methanol verdünnen. Einen Mikroliter der wieder aufgelösten Reaktionsprobe und einen Mikroliter der authentischen Flavonoidprobe auf eine Polyamidplatte laden. Tun Sie das gleiche für die anderen Konzentrationen von authentischem Flavonoid auf der gleichen Platte.Dann in einer Dunstabzugshaube die Probenplatte in einen Chromatographiezylinder geben, der mit einem Lösungsmittelsystem gefüllt ist. Befestigen Sie die Platte an der Unterseite des Zylinders, und führen Sie die Platte 20 Minuten lang im Lösungsmittelsystem aus. Die Platten werden bei Raumtemperatur an die Luft trocknen.Mit einer Sprühflasche die Platten mit 1%ethanolischer Lösung aus Aluminiumchlorid besprühen, gefolgt von der Lufttrocknung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Visualisieren Sie die Flecken auf den Platten unter einem UV-Licht bei 254 Nanometern, und nehmen Sie Bilder auf, dann öffnen Sie auf dem Computer die Software ImageJ. Klicken Sie auf Datei, öffnen Sie, um das zu analysierende Bild zu öffnen.Klicken Sie auf das rechteckigste Auswahlwerkzeug links in der ImageJ-Benutzeroberfläche. Umreißen Sie den ROI im Bild mit der Maus, und drücken Sie einen, um den ersten ROI zu beschriften. Verschieben Sie die rechteckige Auswahl mit der Maus nach rechts zum nächsten ROI, und drücken Sie zwei, um den zweiten ROI zu beschriften.Wiederholen Sie diesen Vorgang, um alle anderen ROIs zu beschriften, indem Sie zwei drücken. Drücken Sie drei, um Profildiagramme für alle ROIs in einem Popupfenster zu generieren. Verwenden Sie dann das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um Basislinien zu löschen, um einen geschlossenen Bereich für jeden Spitzenwert zu definieren.Aktivieren Sie das Zauberstab-Tool, indem Sie auf das entsprechende Symbol in der ImageJ-Benutzeroberfläche klicken. Klicken Sie in die Spitze, um die Ergebnisse für alle Spitzen in einem Popupfenster anzuzeigen. Als Nächstes zeichnen Sie in Excel die Grauwerte aus dem Pop-up-Fenster mit den entsprechenden Flavonoidkonzentrationen, um eine TLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids zu erstellen.Berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids, entsprechend der resultierenden Formel. Verwenden Sie eine Spritze, um jede Probe sequenziell durch einen 0,45-Mikrometer- und 0,22-Mikrometer-Filter zu verarbeiten. Laden Sie die Proben durch Saugdüse in ein HPLC-MS-System und trennen Sie die Proben bei 30 Grad Celsius mit einer C18-Säule.Elute die Säule bei einem Milliliter pro Minute durch einen Gradienten von 10 bis 85 Volumen pro Prozent Acetyl Nitril in Wasser, und überwachen Sie die Absorption des Eluats von 200 bis 800 Nanometer. Führen Sie die LC-MS-Analyse im negativen Ionenmodus mit einem trocknenden Stickstoffstrom von 10 Litern pro Minute bei 300 Grad Celsius in einem Mantelgasstrom von sieben Litern pro Minute bei 250 Grad Celsius durch und sammeln Sie Daten mit einer eingebauten Software. Um Chromatographen mit einer Wellenlänge zu extrahieren, öffnen Sie das qualitative Analyseprogramm, und klicken Sie auf Datei, öffnen Sie die Datendatei.Wählen Sie die zu analysierende Datei im Fenster "Geöffnete Datendatei" aus, und klicken Sie auf Öffnen, um die Datei zu öffnen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste im Chromatogramm-Ergebnisfenster und extrahieren Sie dann Chromatogramme in einem Popup-Menü. Klicken Sie in der Typenliste auf andere Chromatogramme.Wählen Sie im Feld Detektorkombination DAD1 aus, und klicken Sie dann auf OKAY, um die HPLC-Ergebnisse im Chromatogrammergebnisfenster anzuzeigen. Klicken Sie auf das manuelle Integrationssymbol, das oben im Chromatogramm-Ergebnisfenster angedockt ist. Zeichnen Sie die Basislinie für die Spitze, die für die manuelle Integrationsanalyse mit der Maus erforderlich ist.Klicken Sie auf Ansicht, Integrations-Peak-Liste, um die Ergebnisse anzuzeigen. Kopieren Sie die Ergebnisse der Spitzenbereiche nach Excel, und zeichnen Sie eine HPLC-basierte Standardkurve des authentischen Flavonoids gegen die entsprechenden Flavonoidkonzentrationen, und berechnen Sie dann die Ausbeute des in diesem Protokoll erzeugten Flavonoids gemäß der resultierenden Formel. Wiederholen Sie dann die gleichen Verfahren, um Chromatogramme mit einer Wellenlänge zu extrahieren, um die MS-Daten auf die genaue Masse der Flavonoidverbindungen zu analysieren.Klicken Sie auf das Bereichsauswahlsymbol auf der Symbolleiste der Chromatogrammergebnisse. Wählen Sie den Höhepunkt des Interesses aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in den ausgewählten Bereich, und klicken Sie im Popup-Menü auf das MS-Spektrum extrahieren, um die Ergebnisse im Ergebnisfenster des MS-Spektrums anzuzeigen.Um festzustellen, ob dieses In-vitro-System für die Umwandlung eines Flavanons in ein Flavonol verwendet werden kann, wurde NRN in das System aufgenommen. Auf einer Polyamid-TLC-Platte entstanden zwei neue Flecken. Ein Punkt zeigte eine Migrationsentfernung ähnlich der von DHK, und die anderen ähnlich der von KMF.Weitere Analysen von HPLC und LC-MS zeigten, dass die neue Chemikalie eine Retentionszeit von 12 bzw. 20 Minuten bei einem quasi-molekularen IonenspitzenWert M über Z bei 287 und 285 aufwies, die mit denen von DHK und KMF identisch waren. Um festzustellen, ob das System für die Umwandlung anderer Flavanone in die entsprechenden Flavonole verwendet werden kann, wurde ERD in das System aufgenommen. Zwei neue Flecken auf einer Polyamid-TLC-Platte zeigten einen Migrationsabstand ähnlich dem von DHQ bzw. QRC.HPLC- und LC-MS-Analysen zeigten, dass diese neuen Chemikalien eine Retentionszeit von 10 bzw. 16 Minuten und einen quasi-molekularen IonenspitzenWert M über Z bei 303 und 301 aufwiesen, der genau denen von DHQ und QRC entsprach. Bei der Vorbereitung des synthetischen Systems sollten Sie das Enzym zuletzt hinzufügen und das Eisensulfat vorletzter Hinzufügen. Ja, es bietet einen Leitfaden für die wirtschaftliche Produktion von anderen sekundären Metaboliten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Forschung

Biochemie

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolyse eines Ni-Schiff-Base-Komplex unter Verwendung von Bedingungen, die für Retention von säurelabilen Schutzgruppen

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrarot-Elektrochemie für Studie der H2 Oxidation durch ein [NiFe] Hydrogenase unter Beweis gestellt

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Eine Hefe 2-Hybrid Bildschirm im Batch Proteininteraktionen vergleichen

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...