Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

עבודה זו היה נתמך כספית על ידי אוניברסיטת יאנגז'ו מונה מיוחד פרופסור סטארט-up קרנות, ג'יאנגסו מונה מיוחד פרופסור סטארט-up קרנות, שישה כישרון פסגות פרויקט במחוז ג'יאנגסו (גרנט No. 2014-SWYY-016), ו פרויקט ממומן על ידי התוכנית האקדמית עדיפות פיתוח של ג'יאנגסו מוסדות השכלה גבוהה (רפואה וטרינרית). אנו מודים למרכז בדיקות של אוניברסיטת יאנגז'ו לבדיקות וניתוח MS של פלונונואידים.

1. לבודד RNA סך מרקמות הצמח26,27
<ol><li>המגון את רקמות הצמח.<ol>
<li>לאסוף 100 מ"ג של רקמת צמח טרי (למשל, 4-שבוע-שתילים הישן של Arabidopsis thaliana). הקפא את הרקמה ואת הטיט וחומר מליטה בחנקן נוזלי, ואחריו שפשוף הרקמה לאבקה.</li>
		<li>הוסף 1 mL של מגיב בידוד RNA (ראה טבלת חומרים</strong...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

די מספר מחקרים מתמקדים בנגזרת של פלאוולים בשל היישום הפוטנציאלי שלהם בתחום הבריאות והמזון. עם זאת, מיצוי הצמח המסורתי באמצעות ממיסים אורגניים וסינתזה כימית בעלי חסרונות פנימיים, אשר מגבילים את השימוש שלהם בייצור של פלאוולים. כאן, אנו מדווחים על שיטה מפורטת להפקת פלאורול מתוך flavanone בסיר אח...

פלאוולים הם מחלקת משנה מרכזית של פלאונואידים צמח והם מעורבים בפיתוח הצמח פיגמנטציה1,2,3. חשוב יותר, תרכובות אלה בעלי מגוון רחב של פעילויות בריאות מועילות, כגון אנטי סרטן4,5, נגד חמצוני6, אנטי דלקתיות7, אנטי השמנה8, נגד יתר לחץ דם9 , וזיכרון להיזכר מאפיינים10, המוביל למספר רב של מחקרים על אלה הצמח-מטבוליטים הנגזרים משני. באופן מסורתי, תרכובות אלה נגזרות בעיקר מחילוץ הצמח באמצעות ממיסים אורגניים. עם זאת, בשל התוכן הנמוך מאוד שלהם בצמחים11,12,13, עלות הייצור עבור רוב פלאוולים נשאר גבוה, אשר מטיל הגבלות גדולות על היישום שלהם בריאות ומזון תעשייה.
במהלך העשורים האחרונים, מדענים פיתחו מספר רב של שיטות כדי להפיק פלבונונואידים14,15. עם זאת, סינתזה כימית של אלה מולקולות מסובכות בעל מגוון של חסרונות פנימיים16. זה דורש לא רק ריאגנטים רעילים ותנאי תגובה קיצוניים, אלא גם צעדים רבים כדי לייצר מתחם פלאואיד מטרה14,17. יתר על כן, אתגר חשוב נוסף באסטרטגיה זו הוא סינתזה כיראאל של מולקולות פלאואיד פעיל. לכן, זה לא אסטרטגיה אידיאלית כדי לייצר פלבנואידים בקנה מידה מסחרי באמצעות סינתזה כימית16,17.
לאחרונה, מדענים פיתחו אסטרטגיה חלופית מבטיח לייצר אלה תרכובות טבעיות מסובך על ידי חיידקים הנדסה עם מסלול עבור ביואואיד ביולוגי18,19,20, מיכל בן 21 , 22, אשר פענחו בהצלחה בצמחים23. לדוגמה, דואן ואח ' הציגו מסלול ביוסינתטי בתוך הסרביסים שמרים לייצר kaempferol (kmf)24. מאלון ואח ' הופק אסטרגליב, פלאוסינט מניב, על-ידי החדרתflavanone 3-הידרוקסילאז (f3h), פאוננול סטנדרטים (fls1), ו-UDP-גלוקוז: פלונואיד 3-O-גלוקוסילאז UGT78K1 גנים לתוך האנהכיה קולי BL21 (DE3)17. למרות שיש די הרבה תפיסות, לא כל החיידקים מהונדסים גנטית לייצר את המוצרים של עניין בשל המורכבות של פלטפורמת הסלולר, אי התאמה בין אלמנטים גנטיים מסונתז מלאכותי מארחים, העכבות השפעה של מוצרי היעד נגד תאים מארחים, ואת חוסר היציבות של מערכת סלולרית הנדסה עצמה16.
עוד אסטרטגיה חלופית מבטיח ייצור פלונואיד היא להקים אשד רב אנזימטית בתוך מבחנה. צ ' נג ואח ' דיווחו כי בידור polyketides יכול להיות מסונתז בהצלחה על ידי הרכבת מסלול אנזימטי מלאה בסיר אחד25. זו אסטרטגיה סינתטית ללא תא לעקוף את ההגבלות של מפעל ייצור חיידקים וכך ניתן לייצר פלבנואידים כמות גדולה16.
לאחרונה, פיתחנו בהצלחה מערכת ביואנזים סינתטי כדי להמיר נרינגב (NRN) לתוך KMF בסיר אחד16. כאן, אנו מתארים את המערכת בפרטים הגדולים והשיטות הכרוכות בניתוח המוצרים. אנו מציגים גם שתי דוגמאות המשתמשות במערכת זו כדי לייצר kmf מ nrn ו-קוורצטין (qrc) מ eriodictyol (לורד). בנוסף, אנו דנים צעדים קריטיים של שיטה זו וכיווני מחקר עתידיים בביוסינתזה של פלבנואידים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

פלונוולים הם מחלקת מחשוב של פלונונואידים עם מגוון פעילויות ביולוגיות ופרמקולוגית. כאן אנו מספקים שיטה לסינתזה האנזימטית של פלאורול. בשיטה זו, Atf3h ו- Atfls1, שני גנים מרכזיים בשביל הביוסינתטי של פלאוולים, משובטים ומבוטאים בתוך אסאנכיה קולי. האנזימים הרקומביננטי מטוהרים באמצעות עמודת זיקה ומוקמת בתוך מאגר סינתטי מסוים. שני פלאוולים מסונתז במערכת זו כדוגמאות ונקבעים על-ידי הניתוח לבדיקות ובדיקות/מערכות המשך. השיטה מציגה יתרונות ברורים בנגזרת של פלאוולים על פני גישות אחרות. זה זמן וחסכון בעבודה. ומאוד חסכוני התגובה היא קלה להיות נשלט באופן מדויק ובכך מוקטן לייצור המוני. מוצר היעד ניתן לטהר בקלות בשל הרכיבים הפשוטים במערכת. עם זאת, מערכת זו מוגבלת בדרך כלל לייצור של פלאוננול מתוך flavanone.

F3H ו FLS1 הם שני אנזימים מפתח חשוב בהמרה של flavanone לתוך פלאורול בצמחים כמוצג באיור 1. לפתח מערכת ביוסינתטית מלאכותית להפקת פלאורול מתוך flavanone, Atf3h (גנבנק ההצטרפות לא. NM_ 114983.3) ו- Atfls1 (הצטרפותן של גנבנק לא. NM_ 120951.3) גנים שוכללו מן השתילים של בן 4 שבועות A. th...

Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

הנגזרת של פלברול היא חיונית ליישומו בתחום הבריאות ותעשיית המזון. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור יוסינטזה של פלאורול מן flavanone ולדון את הצעדים הקריטיים ואת יתרונותיה על פני גישות אחרות.

ביוסינתזה של פלאנונול מתוך Flavanone על ידי הקמת מדורגת ביאנזיטית בסיר אחד

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים בקלות לייצר לא מעט פלבנולים מ flavanones בסיר אחד. טכניקה זו היא חיסכון בעבודה ובזמן, חסכונית מאוד וקלה לשליטה, כך שיש לה פוטנציאל תיעוש עצום. כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה על הייצור הכלכלי של מטבוליטים משניים אחרים, אבל זה צריך כמה שינויים כאשר מוחל על זה.הוא בדרך כלל לא יקבל כלום או תשואה נמוכה מאוד. העצה שלי היא לטפל באנזימים רקומביננטיים על קרח ולהוסיף 10% גליצרין לפתרון המלאי של אנזימים. זאת משום שרק באמצעות הדגמה חזותית יכולה יד חדשה להבין את הפרטים החשובים ואת האמת המשפיעים על הביצוע המוצלח של הניסוי.ראשית להכין מאגרים. הפוך פעמיים חיץ סינתטי על ידי המסת כמות מתאימה של TRIS בסיס, אסקורבט נתרן, חומצה אלפא ketoglutaric לתוך מים מיונים דה, ואת כמות מתאימה פיפטה של גליצרול לפתרון. השתמש פיפטה כדי להוסיף חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה- pH ל 7.2, ולהתאים את עוצמת הקול על ידי הוספת מים מיוננת.אחסן את המאגר הסינטטי פעמיים בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. ואז לעשות פתרון מלאי 100 פעמים על ידי המסת heptahydrate ברזלי גופרית במים deionized. הפוך פתרון מלאי של פלבנואיד 25 מילימולארי על ידי המסת פלבנואיד במתנול, ולאחסן את הפתרון במינוס 20 מעלות צלזיוס.הצעד הקריטי ביותר הוא להקים מערכת סינתטית. כדי להקים מערכת סינתטית כדי לייצר flavanol מ flavanone, תחילה להכין את המערכת הסינתטית בצינור שני מיליליטר על פי reagents המפורטים בטבלה זו. מניחים את הצינור הפתוח בבלוק חום רועד ב 40 מעלות צלזיוס, ב 600 סל"ד במשך ארבעים דקות.לאחר מכן, לסיים את התגובה על ידי הוספת 10 microliters של חומצה אצטית, ו 100 microliters של אתיל אצטט. שעתיים לאחר מכן, השתמשו בפיגט כדי להפוך את השלב האורגני העליון לצינור של 1.5 מיליליטר, והם מניחים את הצינור במכסה המנוע לייבוש אוויר בטמפרטורת החדר. כדי לבצע ניתוח TLC, לאחזר תחילה את הצינורות מהמכסה המנוע, ולהמיס מחדש את אבקת flavanoid ב 160 microliters של מתנול בצינור.הכן דגימות פלבנואיד אותנטי עם ריכוזים סדרתיים, על ידי דילול 25 מילימולר פלבנואיד פתרון מלאי מתנול. טען מיקרוליטר אחד של דגימת התגובה המופתרת מחדש, ומיקרוליטר אחד של דגימת הפלבנואידים האותנטית, על לוח פוליאמיד. לעשות את אותו הדבר עבור ריכוזים אחרים של פלבנואיד אותנטי על אותה צלחת.ואז במכסה המנוע אדים, לשים את צלחת טעון מדגם בצילינדר כרומטוגרפיה מלא במערכת ממס. חבר את הצלחת לתחתית הצילינדר, והפעל את הצלחת במערכת הממס במשך 20 דקות. האוויר מייבש את הצלחות בטמפרטורת החדר.עם בקבוק מרסס, לרסס את הצלחות עם 1% פתרון אתנול של אלומיניום כלורי, ואחריו אוויר ייבוש שוב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לדמיין את הכתמים על הלוחות תחת אור UV ב 254 ננומטר, ולצלם, ולאחר מכן במחשב, לפתוח את התוכנה ImageJ. לחץ על קובץ, פתח, כדי לפתוח את התמונה שיש לנתח.לחצו על כלי הבחירה המלבני השמאלי ביותר בממשק המשתמש ImageJ. מיתאר את ה- ROI בתמונה באמצעות העכבר והקש על אחד מהם כדי להוסיף תווית ל- ROI הראשון. הזז את הבחירה המלבנית עם העכבר ימינה להזזה הבאה, והקש על שתיים כדי להוסיף תווית ל- ROI השני.חזור על הפעולה כדי לתייג את כל תווי ההשקעה האחרים על-ידי הקשה על שניים. הקש שלוש כדי ליצור התוויות פרופיל עבור כל תווי ההשקעה, בחלון מוקפץ. לאחר מכן, השתמש בכלי בחירת הקו הישר כדי להוריד תוכניות בסיסיות כדי להגדיר אזור סגור עבור כל שיא של עניין.הפעל את כלי השרביט, על-ידי לחיצה על הסמל המתאים בממשק המשתמש של ImageJ. לחץ בתוך השיא כדי להציג תוצאות עבור כל הפסגות בחלון מוקפץ. לאחר מכן, ב- Excel, התווה את הערכים האפורים מהחלון המוקפץ כנגד ריכוזי הפלבנואידים המתאימים, כדי ליצור עקומה סטנדרטית מבוססת TLC של הפלבנואיד האותנטי.לאחר מכן לחשב את התשואה של פלבנואיד של ריבית המיוצר בפרוטוקול זה, על פי הנוסחה וכתוצאה מכך. השתמש במזרק כדי לעבד כל דגימה ברצף באמצעות מסנני מיקרומטר ו- 0.22 מיקרומטר. טען את הדגימות למערכת HPLC-MS באמצעות חריר יניקה והפרד את הדגימות ב- 30 מעלות צלזיוס באמצעות עמודת C18.אלר את העמודה במיליליטר אחד לדקה על ידי שיפוע של 10 עד 85 נפח אחוז אצטיל ניטריל במים, ולפקח על ספיגת ההתרומםות מ 200 עד 800 ננומטר. בצע את ניתוח LC-MS במצב יון שלילי, עם זרימת חנקן ייבוש של 10 ליטר לדקה ב 300 מעלות צלזיוס, בזרימת גז נדן של שבעה ליטר לדקה ב 250 מעלות צלזיוס, ולאסוף נתונים באמצעות תוכנה מובנית. כדי לחלץ כרומטוגרפים באורך גל יחיד, פתח את תוכנית הניתוח האיכותי ולחץ על קובץ, פתח קובץ נתונים.בחר את הקובץ שיש לנתח בחלון קובץ הנתונים הפתוח ולחץ על פתח כדי לפתוח את הקובץ. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בחלון תוצאות הכרומטוגרמה ולאחר מכן חלץ כרומטוגרמות בתפריט נפתח. ברשימת הסוגים, לחץ על כרומטוגרמות אחרות.בתיבה המשולבת של הגלאי, בחר DAD1 ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להציג את תוצאות HPLC בחלון תוצאות הכרומטוגרמה. לחץ על סמל השילוב הידני שעגן בחלק העליון של חלון תוצאות הכרומטוגרמה. צייר קו בסיס עבור השיא הנדרש לניתוח שילוב ידני עם העכבר.לחץ על תצוגה, רשימת שיא שילוב, כדי להציג את התוצאות. העתק את התוצאות של אזורי השיא ל- Excel, והתוות עקומה סטנדרטית מבוססת HPLC של הפלבנואיד האותנטי כנגד ריכוזי הפלבנואידים המתאימים, ולאחר מכן חשב את התשואה של פלבנואיד העניין המיוצר בפרוטוקול זה בהתאם לנוסחה המתקבלת. ואז לחזור על אותם הליכים כדי לחלץ כרומטוגרמות באורך גל יחיד כדי לנתח את נתוני MS עבור המסה המדויקת של תרכובות פלבנואידים.לחץ על סמל בחירת הטווח בסרגל הכלים של תוצאות הכרומטוגרמה. בחר את שיא העניין. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בטווח הנבחר ולחץ על ספקטרום החילוץ MS בתפריט הנפתח כדי להציג את התוצאות בחלון תוצאות ספקטרום MS.כדי לקבוע אם מערכת זו במבחנה ניתן להשתמש עבור המרה של flavanone לתוך פלבנול, NRN נוסף לתוך המערכת. היו שני כתמים חדשים הופיעו על צלחת TLC פוליאמיד. נקודה אחת הראתה מרחק הגירה דומה לזה של DHK, והאחרים דומים לזה של KMF.ניתוח נוסף של HPLC ו- LC-MS הראה כי הכימיקל החדש הראה זמן שמירה של 12 דקות ו -20 דקות בהתאמה, בשיא יון מעין מולקולרי M מעל Z ב 287 ו 285 שהיו זהים לאלה של DHK ו KMF. כדי לקבוע אם המערכת יכולה לשמש להמרה של flavanones אחרים לתוך פלבנולים המתאימים שלהם, ERD נוספה לתוך המערכת. שני כתמים חדשים על לוח TLC פוליאמיד הציג מרחק הגירה דומה לזה של DHQ ו QRC בהתאמה.ניתוחי HPLC ו- LC-MS הראו כי כימיקלים חדשים אלה חשפו זמן שמירה של 10 דקות ו -16 דקות בהתאמה, ושיא יון מעין מולקולרי M מעל Z ב 303 ו - 301, אשר התאים בדיוק לאלה של DHQ ו- QRC. בעת הכנת המערכת הסינתטית, אתה צריך להוסיף את האנזים לבסוף, ולהוסיף את sulfate ברזלי השני אחרון. כן, הוא מספק מדריך לייצור חסכוני של מטבוליטים משניים אחרים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

הידרוליזה של תנאי Ni-שיף-Base מורכבים באמצעות מתאים שמירת חומצה-רָפִיף קבוצות הגנה

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

בידוד של חלקיקי ליפופרוטאין מעוף חלמון ביצה לחקר הפתוגן חומצות שומן בקטריאלי התאגדות לתוך ממברנה פוספוליפידים

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...