Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da Yangzhou University Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially-Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project nella provincia di Jiangsu (Grant no. 2014-SWYY-016), e un progetto finanziato da il programma accademico prioritario sviluppo degli istituti di istruzione superiore di Jiangsu (medicina veterinaria). Ringraziamo il Testing Center dell'Università di Yangzhou per le analisi HPLC e MS dei flavonoidi.

1. Isolare l'RNA totale dai tessuti vegetali26,27
<ol><li>Omogeneizzare i tessuti vegetali.<ol>
<li>Raccogliere 100 mg di un tessuto vegetale fresco (ad esempio, piantine di 4 settimane dall'Arabidopsis thaliana). Congelare il tessuto e un pestello e malta con azoto liquido, seguito da macinare il tessuto in polvere.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento DELL'RNA (vedere Tabella deimateriali) nel mortaio. Il reagente ver...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

Una serie di studi si concentra sulla derivazione dei flavonomi a causa della loro potenziale applicazione nell'assistenza sanitaria e nell'industria alimentare. Tuttavia, l'estrazione tradizionale delle piante con solventi organici e la sintesi chimica possiedono svantaggi intrinseci, che ne limitano l'uso nella produzione di flavonomi. Qui, riportiamo un metodo dettagliato per produrre un flavonolo da un flavanone in un vaso stabilendo una cascata bienzimatica in vitro. I passaggi critici di questo protocollo sono: 1) ...

I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi vegetali e sono coinvolti nello sviluppo e nella pigmentazione delle piante1,2,3. Ancora più importante, questi composti possiedono una vasta gamma di attività per la salute-benefica, come anti-cancro4,5, anti-ossidativo6, anti-infiammatorio7, antiobesità8, anti-ipertensivo9 , e le proprietà di richiamo della memoria10, portando ad un gran numero di studi su questi metaboliti secondari derivati dalle piante. Tradizionalmente, questi composti sono principalmente derivati dall'estrazione delle piante utilizzando solventi organici. Tuttavia, a causa del loro bassissimo contenuto negli impianti11,12,13, il costo di produzione per la maggior parte dei flavonomi rimane elevato, che impone grandi restrizioni sulla loro applicazione nel settore sanitario e alimentare industria.
Nel corso degli ultimi decenni, gli scienziati hanno sviluppato un certo numero di metodi per derivare flavonoidi14,15. Tuttavia, la sintesi chimica di queste molecole complicate possiede una varietà di svantaggi intrinseci16. Richiede non solo reagenti tossici e condizioni di reazione estreme, ma anche molti passi per produrre un composto flavonoide bersaglio14,17. Inoltre, un'altra sfida importante in questa strategia è la sintesi chirale delle molecole flavonoidi attive. Pertanto, non è una strategia ideale per produrre flavonoidi su scala commerciale tramite sintesi chimica16,17.
Recentemente, gli scienziati hanno sviluppato una promettente strategia alternativa per produrre questi complicati composti naturali progettando microbi con un percorso per la biosintesi flavonoide18,19,20, 21 Mieto , 22, che è stato decifrato con successo nelle piante23. Ad esempio, Duan ealtri ha introdotto una via biosintetica nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae per produrre kaempferol (KMF)24. Malla et al. ha prodotto astragalina, un flavonolo glicosillato glicosylato, introducendo i geniflavanone 3-idrossislasi (f3h), la sinteassi di flavonol (fls1) e UDP-glucosioide:flavonoid 3-O-glucosyltransferase UGT78K1 Escherichia coliBL21(DE3)17. Anche se ci sono un bel po 'di paradigmi, non tutti i microbi geneticamente ingegnerizzati producono i prodotti di interesse a causa della complessità di una piattaforma cellulare, l'incompatibilità tra elementi genetici artificialmente sintetizzati e ospiti, l'inibitorio effetto dei prodotti di destinazione rispetto alle cellule ospiti e l'instabilità di un sistema cellulare ingegnerizzato stesso16.
Un'altra promettente strategia alternativa per la produzione di flavonoidi è quella di stabilire una cascata multienzimatica in vitro. Cheng et al. hanno riferito che i poliketi enterocin possono essere sintetizzati con successo assemblando un percorso enzimatico completo in un vaso25. Questa strategia sintetica senza cellule aggira le restrizioni di una fabbrica di produzione microbica ed è quindi fattibile per produrre alcuni flavonoidi in grande quantità16.
Recentemente, abbiamo sviluppato con successo un sistema sintetico bienzima per convertire la naringenina (NRN) in KMF in un vaso16. Qui, descriviamo questo sistema in dettagli e i metodi coinvolti nell'analisi dei prodotti. Presentiamo anche due esempi che utilizzano questo sistema per produrre KMF da NRN e quercetina (QRC) da eriodictyol (ERD). Inoltre, discutiamo i passaggi cruciali di questo metodo e le future direzioni di ricerca nella biosintesi dei flavonoidi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

I flavonomi sono una sottoclasse importante dei flavonoidi con una varietà di attività biologiche e farmacologiche. Qui, forniamo un metodo per la sintesi ezimatica in vitro di un flavonolo. In questo metodo, Atf3h e Atfls1, due geni chiave nel percorso biosintetico dei flavonomi, sono clonati e sovraespressi in Escherichia coli. Gli enzimi ricombinanti vengono purificati tramite una colonna di affinità e quindi una cascata bienzimatica viene stabilita in uno specifico buffer sintetico. Due flavonomi sono sintetizzati in questo sistema come esempi e determinati dalle analisi TLC e HPLC/LC/MS. Il metodo mostra evidenti vantaggi nella derivazione dei flavonoli rispetto ad altri approcci. Si tratta di risparmio di tempo e manodopera e altamente conveniente. La reazione è facile da controllare con precisione e quindi scalare per la produzione di massa. Il prodotto di destinazione può essere purificato facilmente grazie ai semplici componenti del sistema. Tuttavia, questo sistema è di solito limitato alla produzione di un flavonolo da un flavanone.

F3H e FLS1 sono due importanti enzimi chiave nella conversione di un flavanone in un flavonolo nelle piante, come mostrato nella Figura 1. Sviluppare un sistema biosintetico in vitro per la produzione di un flavonolo da un flavanone, Atf3h (GenBank accession no. NM_114983.3) e Atfls1 (Nr. adesione del GenBank NM_120951.3) sono stati clonati dalle piantine di A. thaliana di 4 settimane in un vettore di espressione procariotica pET-32...

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Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

La derivazione di un flavonolo è fondamentale per la sua applicazione nel settore sanitario e dell'industria alimentare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per la biosintesi di un flavonolo da un flavanone e discutiamo i passi cruciali ei suoi vantaggi rispetto ad altri approcci.

Biosintesi di un flavonolo da un Flavanone stabilendo una cascata bienzimatica a un vaso

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Utilizzando questo protocollo, possiamo facilmente produrre un bel numero di flavonoli da flavanone in un unico vaso. Questa tecnica consente di risparmiare manodopera e tempo, è altamente economica e facile da controllare, quindi ha un enorme potenziale di industrializzazione. Sì, questo metodo può fornire informazioni sulla produzione economica di altri metaboliti secondari, ma ha bisogno di alcune modifiche se applicato ad esso.Di solito non otteniamo nulla o un rendimento molto basso. Il mio consiglio è di gestire gli enzimi ricombinanti sul ghiaccio e aggiungere il 10% di glicerina alla soluzione stock di enzimi. Questo perché solo attraverso la dimostrazione visiva una nuova mano può comprendere i dettagli importanti e la verità che influenzano l'esecuzione riuscita dell'esperimento.Preparare innanzitutto i buffer. Fare due volte tampone sintetico sciogliendo la quantità appropriata di base TRIS, ascorbato di sodio, acido chetoglutarico alfa in acqua deionizzata e pipetta quantità appropriata di glicerolo alla soluzione. Utilizzare una pipetta per aggiungere acido cloridrico per regolare il pH a 7,2 e regolare il volume aggiungendo acqua deionizzata.Conservare il buffer due volte sintetico a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Quindi fare una soluzione 100 volte stock sciogliendo l'eptaidrato di solfato ferroso in acqua deionizzata. Fare una soluzione stock di flavonoide millimolare sciogliendo il flavonoide nel metanolo e conservare la soluzione a meno 20 gradi Celsius.Il passo più critico è quello di creare un sistema sintetico. Per impostare un sistema sintetico per produrre un flavanolo da un flavanone, preparare prima il sistema sintetico in un tubo a due millilitri secondo i reagenti elencati in questa tabella. Posizionare il tubo aperto in un blocco di calore tremante a 40 gradi Celsius, a 600 giri/min per quaranta minuti.Successivamente, terminare la reazione aggiungendo 10 microlitri di acido acetico e 100 microlitri di acetato di etile. Due ore dopo, utilizzare una pipetta per trasferare la fase organica superiore a un tubo da 1,5 millilitri e posizionare il tubo in una cappa per l'asciugatura ad aria a temperatura ambiente. Per eseguire l'analisi TLC, recuperare prima i tubi dalla cappa e riassolvere la polvere flavanoide in 160 microlitri di metanolo in un tubo.Preparare autentici campioni di flavonoidi con concentrazioni seriali, diluire la soluzione di 25 millimolare di materiale flavonoide in metanolo. Caricare un microlitro del campione di reazione riassociato e un microlitro dell'autentico campione di flavonoide su una piastra di poliammide. Fare lo stesso per le altre concentrazioni di flavonoide autentico sulla stessa piastra.Quindi, in una cappa aspirante, mettere la piastra caricata nel campione in un cilindro di cromatografia riempito con un sistema a solvente. Attaccare la piastra sul fondo del cilindro e far funzionare la piastra nel sistema solvente per 20 minuti. Asciugare all'aria le piastre a temperatura ambiente.Con un flacone spruzzatore, spruzzare le piastre con soluzione etanolalica all'1% di cloruro di alluminio, seguita da asciugatura ad aria di nuovo a temperatura ambiente per 30 minuti. Visualizza le macchie sulle piastre sotto una luce UV a 254 nanometri e scatta immagini, quindi sul computer, apri il software ImageJ. Fare clic su file, apri, per aprire l'immagine da analizzare.Fare clic nello strumento di selezione più rettangolare a sinistra nell'interfaccia utente ImageJ. Delineare il ROI nell'immagine con il mouse e premerne uno per etichettare il primo ROI. Spostare la selezione rettangolare con il mouse a destra sul ROI successivo e premere due per etichettare il secondo ROI.Ripetere l'etichetta per etichettare tutte le altre ROM premendo due. Premere tre per generare grafici di profili per tutte le ROM, in una finestra popup. Quindi, utilizzare lo strumento di selezione della linea retta per rilasciare le linee di base in modo da definire un'area chiusa per ogni picco di interesse.Attivare lo strumento bacchetta, facendo clic sull'icona corrispondente nell'interfaccia utente imagej. Fare clic all'interno del picco per visualizzare i risultati per tutti i picchi in una finestra popup. Successivamente, in Excel, tracciare i valori grigi dalla finestra pop-up rispetto alle corrispondenti concentrazioni flavonoidi, per creare una curva standard basata su TLC del flavonoide autentico.Quindi calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo, secondo la formula risultante. Utilizzare una siringa per elaborare ogni campione in sequenza attraverso filtri da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri. Caricare i campioni in un sistema HPLC-MS tramite ugello di aspirazione e separare i campioni a 30 gradi Celsius utilizzando una colonna C18.Elute la colonna a un millilitro al minuto con un gradiente di 10-85 volume per cento di nitrile di acetile in acqua, e monitorare l'assorbanza dell'eluato da 200 a 800 nanometri. Eseguire l'analisi LC-MS in modalità ionica negativa, con un flusso di azoto essiccante di 10 litri al minuto a 300 gradi Celsius, in un flusso di gas di focaia di sette litri al minuto a 250 gradi Celsius, e raccogliere dati utilizzando un software integrato. Per estrarre cromatografi a lunghezza d'onda singola, aprire il programma di analisi qualitativa e fare clic su file, aprire datafile.Selezionare il file da analizzare nella finestra del file di dati aperto e fare clic su apri per aprire il file. Fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra dei risultati del cromatogramma, quindi estrarre i cromatogrammi in un menu a comparsa. Nell'elenco dei tipi fare clic su altri cromatogrammi.Nella casella combinata rilevatore selezionare DAD1, quindi fare clic su OK per visualizzare i risultati HPLC nella finestra dei risultati del cromatogramma. Fare clic sull'icona di integrazione manuale ancorata nella parte superiore della finestra dei risultati del cromatogramma. Disegnare la linea di base per il picco richiesto per l'analisi manuale dell'integrazione con il mouse.Fare clic su visualizza, elenco picchi di integrazione, per visualizzare i risultati. Copiare i risultati delle aree di picco in Excel e tracciare una curva standard basata su HPLC del flavonoide autentico rispetto alle corrispondenti concentrazioni flavonoidi, quindi calcolare la resa del flavonoide di interesse prodotto in questo protocollo secondo la formula risultante. Quindi ripetere le stesse procedure per estrarre cromatogrammi a lunghezza d'onda singola per analizzare i dati MS per la massa esatta dei composti flavonoidi.Fare clic sull'icona di selezione dell'intervallo sulla barra degli strumenti dei risultati del cromatogramma. Selezionare il picco di interesse. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'intervallo selezionato e scegliere lo spettro MS estratto nel menu a comparsa per visualizzare i risultati nella finestra dei risultati dello spettro MS.Per determinare se questo sistema in vitro può essere utilizzato per la conversione di un flavanone in un flavonolo, la RRN è stata aggiunta al sistema. Ci sono stati due nuovi punti emersi su una piastra TLC poliammide. Un punto mostrava una distanza di migrazione simile a quella della DHK, e gli altri simili a quella del KMF.Ulteriori analisi di HPLC e LC-MS hanno dimostrato che la nuova sostanza chimica ha mostrato un tempo di ritenzione rispettivamente di 12 minuti e 20 minuti, in un picco ionico quasi molecolare M su Z a 287 e 285 che erano identici a quelli di DHK e KMF. Per determinare se il sistema può essere utilizzato per la conversione di altri flavanoni nei loro flavonoli corrispondenti, l'ERD è stato aggiunto al sistema. Due nuovi punti su una piastra TLC poliammide mostrava una distanza di migrazione simile a quella di DHQ e QRC rispettivamente.Le analisi HPLC e LC-MS hanno dimostrato che queste nuove sostanze chimiche hanno rivelato rispettivamente un tempo di ritenzione di 10 minuti e 16 minuti, e un picco ionico quasi molecolare M su Z a 303 e 301, che corrispondeva esattamente a quelli del DHQ e del QRC. Quando si prepara il sistema sintetico, è necessario aggiungere l'enzima infine e aggiungere il solfato ferroso dal secondo all'ultimo. Sì, fornisce una guida per la produzione economica di altri metaboliti secondari.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Un Tailored HPLC purificazione protocollo che i rendimenti di elevata purezza beta-amiloide 42 e beta amiloide 40 peptidi, in grado di Oligomer Formazione

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Ricerca

Biochimica

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Idrolisi di un Ni-Schiff-Base complessi utilizzando le condizioni adatte per la conservazione di acido-labile gruppi protettori

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

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Proteina pellicola infrarossa elettrochimica ha dimostrato per lo studio di H2 ossidazione da un'idrogenasi [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Rilevamento di siti di Ubiquitinazione proteica mediante arricchimento dei peptidi e spettrometria di massa

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...