Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
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この研究は、揚州大学特任教授スタートアップファンド、江蘇特別任教授スタートアップファンド、江蘇省6つのタレントピークプロジェクト(助成金第2014-SWYY-016)、およびプロジェクトが資金提供を受けて財政的に支援されました。江蘇省高等教育機関(獣医学)の優先学術プログラム開発我々は、フラボノイドのHPLCとMS分析のための陽州大学のテストセンターに感謝します。

1. 植物組織から総RNAを分離26,27
<ol><li>植物組織を均質化する。<ol>
<li>新鮮な植物組織の100 mgを収集します(例えば、アラビドプシスタリアナから4週齢の苗)。液体窒素で組織と害虫とモルタルを凍結し、続いて組織を粉末に粉砕する。</li>
		<li>モルタルにRNA単離試薬の1 mL(材料の表を参照)を追加します。試薬はすぐに凍結されま?...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

かなりの数の研究は、ヘルスケアや食品業界での潜在的なアプリケーションにフラボノールの誘導に焦点を当てています。しかし、有機溶剤を用いた従来の植物抽出や化学合成には固有の欠点があり、フラボノールの製造に対する使用が制限されています。ここでは、インビエンザイマティックカスケードを確立することにより、フラバノンからフラボノールを1ポットで製造する詳細な方法...

フラボノールは、植物フラボノイドの主要なサブクラスであり、植物の開発と色素沈着1、2、3に関与しています。さらに重要なことに、これらの化合物は、抗癌4、5、抗酸化6、抗炎症7、抗肥満8、抗高血圧症などの健康に有益な活動の広い範囲を有する、および記憶リコール特性10は、これらの植物由来二次代謝産物に関する多数の研究につながる。伝統的に、これらの化合物は、主に有機溶媒を用いた植物抽出に由来する。しかし、植物11、12、13の中身が非常に低いため、ほとんどのフラボノールの生産コストは高いままで、ヘルスケアや食品への応用に大きな制限を課しています。業界。
過去数十年の間に、科学者はフラボノイド14、15を導き出す方法のかなりの数を開発しました。しかしながら、これらの複雑な分子の化学合成は、種々の固有の欠点を有する16.それは有毒な試薬および極度な反応条件だけでなく、標的フラボノイド化合物14、17を産生するための多くのステップを必要とする。さらに、この戦略のもう一つの重要な課題は、活性フラボノイド分子のキラル合成です。したがって、化学合成16、17を介して商業規模でフラボノイドを生産することは理想的な戦略ではありません。
最近、科学者は、フラボノイド生合成18、19、20のための経路を持つ微生物を工学的にすることによって、これらの複雑な天然化合物を生成するための有望な代替戦略を開発しました。21歳,22は、植物23で正常に解読された。例えば、Duanらは、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエに生合成経路を導入し、カエンフェロール(KMF)24を産生した。Mallaららは、グリコシル化フラボノールであるアストラガリンを産生し、フラバノン3-ヒドロキシラーゼ(f3h)、フラボノール合成酵素(fls1)、およびUDP-グルコース:フラボノイド3-O-グルコシルトランスフェラーゼUGT78K1遺伝子を導入した。エシェリヒア大腸菌BL21(DE3)17.かなりの数のパラダイムがあるにもかかわらず、すべての遺伝子組み換え微生物が細胞プラットフォームの複雑さ、人工的に合成された遺伝元素と宿主との間の非互換性のために関心のある製品を生成するわけではない。宿主細胞に対する標的産物の影響、および工学的細胞系自体の不安定性 16.
フラボノイド生産のためのもう一つの有望な代替戦略は、インビトロで多酵素カスケードを確立することです.Chengらは、エンテロシンポリケチドが1ポット25に完全な酵素経路を組み立てることによって正常に合成することができると報告している。この無細胞合成戦略は、微生物生産工場の制限を回避し、したがって、大量16でいくつかのフラボノイドを生産するために実現可能である。
最近では、ナリンゲニン(NRN)を1ポット16でKMFに変換するバイザイム合成システムの開発に成功しました。ここでは、このシステムについて詳しく説明し、製品の分析に関わる方法について説明します。また、このシステムを用いてNRNからKMFを生成し、エリオジチオール(ERD)からケルセチン(QRC)を生成する2つの例を示す。また、この方法の重要なステップと、フラボノイドの生合成における今後の研究の方向性についても議論する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

フラボノールは、様々な生物学的および薬理学的活動を伴うフラボノイドの主要なサブクラスである。ここでは、フラボノールのインビトロ酵素合成の方法を提供する。この方法では、Atf3hおよびAtfls1は、フラボノールの生合成経路における2つの主要遺伝子を、エシェリヒア大腸菌においてクローニングおよび過剰発現する。組換え酵素は、アフィニティカラムを介して精製され、その後、特定の合成バッファーにビエンザイマティックカスケードが確立されます。2つのフラボノールは、例としてこのシステムで合成され、TLCおよびHPLC/LC/MS分析によって決定される。この方法は、他のアプローチよりもフラボノールの誘導に明らかな利点を表示します。それは時間と省力化および非常に費用効果が大きい。反応は正確に制御され易く、従って大量生産のためにスケールアップされる。対象製品は、システム内の単純なコンポーネントにより、簡単に精製できます。しかし, このシステムは、通常、フラバノンからフラボノールの生産に制限されます。.

F3HおよびFLS1は、図1に示すように、フラバノンを植物のフラボノールに変換する上で2つの重要な酵素である。フラバノンからフラボノールを製造するためのインビトロ生合成システムを開発するために、Atf3h(GenBank加盟No. NM_114983.3) とAtfls1 (GenBank アクセシビリティ No.NM_120951.3)遺伝子を4週齢のA.タリアナの苗から原核発現ベク?...

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Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

フラボノールの誘導は、ヘルスケアおよび食品産業におけるその応用に不可欠です。ここでは、フラバノンからのフラボノールの生合成のための詳細なプロトコルを提供し、他のアプローチに対する重要なステップとその利点について議論する。

ワンポットビエンツマティックカスケードを確立することにより、フラバノンからのフラボノールの生合成

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

このプロトコルを使用すると、フラバノンからかなりの数のフラボノールを1つのポットで簡単に生成できます。この技術は、人手と時間を節約し、非常に費用対効果が高く、制御が容易であるため、巨大な工業化の可能性を秘めています。はい、この方法は、他の二次代謝産物の経済生産に関する洞察を提供することができますが、それに適用すると、いくつかの変更が必要です。彼は通常、何も得られないか、非常に低い収量を得るでしょう。私のアドバイスは、氷上の組換え酵素を処理し、酵素のストック溶液に10%グリセリンを加える方法です。これは、視覚的なデモンストレーションを通じてのみ、実験の成功に影響を与える重要な詳細と真実を新しい手で理解できるからです。まずバッファを準備します。適量のTRIS塩基、アスコルビン酸ナトリウム、αケトグルタル酸を脱イオン水に溶解し、ピペット適量のグリセロールを溶液に溶解して、2倍の合成バッファーを作ります。ピペットを使用して塩酸を加えてpHを7.2に調整し、脱イオン水を加えて体積を調整します。将来の使用のために摂氏4度で2倍の合成バッファーを保管してください。次いで、脱イオン水に硫酸ヘプタハイドレートを溶解して100回ストック液を作ります。フラボノイドをメタノールに溶解させて25ミリモルフラボノイドのストック溶液を作り、マイナス20°Cで保存します。最も重要なステップは、合成システムを設定することです。フラバノンからフラバノールを製造する合成システムをセットアップするには、まず、この表に記載されている試薬に従って合成系を2ミリリットルチューブで調製します。開いたチューブを摂氏40度、600rpmで40分間揺れるヒートブロックに入れます。その後、酢酸10マイクロリットル、酢酸エチル100マイクロリットルを添加して反応を終了する。2時間後、ピペットを使用して、上部の有機相を1.5ミリリットルチューブにトランファーし、室温で空気乾燥するためにフードにチューブを入れます。TLC分析を行うために、まずフードからチューブを取り出し、フラバノイド粉末を160マイクロリットルのメタノールでチューブに再溶解します。25ミリモルフラボノイドストック溶液をメタノールで希釈することにより、シリアル濃度の本格的なフラボノイドサンプルを調製します。再溶解した反応試料の1マイクロリットル、および本物のフラボノイド試料の1マイクロリットルをポリアミドプレートにロードする。同じプレート上の本物のフラボノイドの他の濃度にも同じことを行います。次にヒュームフードに、サンプルを装填したプレートを、溶媒系で満たされたクロマトグラフィーシリンダーに入れます。プレートをシリンダーの底に取り付け、20分間、溶媒系でプレートを実行します。空気はプレートを室温で乾燥させます。噴霧器ボトルで、塩化アルミニウムの1%エタノール溶液でプレートをスプレーし、続いて室温で30分間空気乾燥を行います。254ナノメートルでUV光の下でプレート上のスポットを視覚化し、画像を撮り、コンピュータ上でソフトウェアImageJを開きます。ファイルをクリックして開き、分析する画像を開きます。ImageJ ユーザーインターフェイスで、最も長方形の選択ツールをクリックします。イメージの ROI の概要をマウスで囲み、1 を押して最初の ROI にラベルを付けます。マウスを右に移動して四角形の選択を移動し、2 番目の ROI にラベルを付けるには 2 を押します。2 を押して、他のすべての ROI にラベルを付ける場合は、この手順を繰り返します。3 を押すと、ポップアップ ウィンドウにすべての ROI のプロファイル プロットが生成されます。次に、直線選択ツールを使用して、対象の各ピークに対して閉じた領域を定義するように、ベースラインをドロップします。ImageJ ユーザーインターフェイスの対応するアイコンをクリックして、杖ツールをアクティブにします。ピークの内側をクリックすると、ポップアップ ウィンドウにすべてのピークの結果が表示されます。次に、Excelで、ポップアップウィンドウから対応するフラボノイド濃度に対してグレーの値をプロットし、本格的なフラボノイドのTLCベースの標準曲線を作ります。次に、このプロトコルで生成された目的のフラボノイドの収率を、得られた式に従って計算する。0.45マイクロメートルと0.22マイクロメートルのフィルターを通して各サンプルを連続して処理するためにシリンジを使用してください。サンプルを吸引ノズルを通してHPLC-MSシステムにロードし、C18カラムを使用して30°Cでサンプルを分離します。1分間に1ミリリットルのアセチルニトリルを水中に10~85体積%の勾配で1ミリリットルでエルプルし、200~800ナノメートルの溶出性の吸光度を監視します。LC-MS解析は、摂氏300度で毎分10リットルの乾燥窒素流を摂氏250度で1分あたり10リットルのシースガスフローで、250°Cのソフトウェアを使用してデータを収集する、負イオンモードで行います。単一波長クロマトグラフを抽出するには、定性解析プログラムを開き、ファイルをクリックしてデータファイルを開きます。開いているデータ ファイル ウィンドウで分析するファイルを選択し、[開く] をクリックしてファイルを開きます。クロマトグラムの結果ウィンドウでマウスを右クリックし、ポップアップメニューでクロマトグラムを抽出します。タイプリストで、他のクロマトグラムをクリックします。検出器コンボボックスで、DAD1を選択し、次に[大丈夫]をクリックして、HPLCの結果をクロマトグラム結果ウィンドウに表示します。クロマトグラムの結果ウィンドウの上部にドッキングされている手動統合アイコンをクリックします。マウスを使用した手動統合解析に必要なピークのベースラインを描画します。[ビュー]、統合ピークリストをクリックして結果を表示します。ピーク領域の結果をExcelにコピーし、本物のフラボノイドのHPLCベースの標準曲線を対応するフラボノイド濃度に対してプロットし、次いで、このプロトコルで生成された目的のフラボノイドの収率を、得られた式に従って計算する。その後、同じ手順を繰り返して単一波長クロマトグラムを抽出し、フラボノイド化合物の正確な質量のMSデータを分析します。クロマトグラム結果ツールバーの範囲選択アイコンをクリックします。対象のピークを選択します。選択した範囲でマウスを右クリックし、ポップアップメニューで抽出 MS スペクトルをクリックして、結果を MS スペクトル結果ウィンドウに表示します。このインビトロシステムをフラバノロンからフラボノールへの変換に使用できるかどうかを判断するために、NRNをシステムに追加した。ポリアミドTLCプレートには2つの新しいスポットが出現しました。あるスポットはDHKと同様の移動距離を示し、他のスポットはKMFと同様の移動距離を示した。HPLCとLC-MSによるさらなる分析は、新しい化学物質がDHKおよびKMFのものと同一であった287および285のZ上の準分子イオンピークMで、それぞれ12分と20分の保持時間を示したことを示した。他のフラバノンを対応するフラバノールに変換するためにシステムを使用できるかどうかを判断するために、ERDをシステムに追加した。ポリアミドTLCプレート上の2つの新しいスポットは、それぞれDHQとQRCのそれと同様の移動距離を示した。HPLCおよびLC-MS分析は、これらの新しい化学物質がそれぞれ10分と16分の保持時間を明らかにし、303と301のZ上の準分子イオンピークMがDHQおよびQRCのものと正確に一致することを実証した。合成系を調製する際には、最後に酵素を添加し、硫酸第二の鉄を最後に加える必要があります。はい、それは他の二次代謝産物の経済的生産のためのガイドを提供します。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

共沈降によるF-アクチンへのタンパク質結合の測定

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

酸に不安定な保護基を保持するのに適したNi-シッフ塩基錯体の使用条件の加水分解

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

タンパク質フィルム赤外線電気化学 [NiFe] ヒドロゲナーゼによって H2酸化反応に関する研究の実証

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

脂質結合タンパク質およびアレルゲンからの内因性リガンドの除去と置換

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...