Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

이 사업은 양주대학교 특별임명교수 창업기금, 장쑤특별교수 창업기금, 장쑤성 6대 인재피크 프로젝트(Grant No. 2014-SWYY-016) 및 기금 지원 사업으로 재정적으로 지원되었다. 강수 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발 (수의학). 우리는 HPLC및 플라보노이드의 MS 분석을 위한 양저우 대학의 시험 센터에 감사드립니다.

1. 식물 조직에서 총 RNA를 분리26,27
<ol><li>식물 조직을 균질화하십시오.<ol>
<li>신선한 식물 조직 100 mg을 수집하십시오 (예를 들어, 애기장대에서4 주 된 모종). 액체 질소로 조직과 유봉과 박격포를 동결한 다음 조직을 분말로 분쇄합니다.</li>
		<li>RNA 분리 시약 1mL를 첨가합니다(재료 표참조). 시약은 즉시 동결됩니다. 냉동 시약이 녹?...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

많은 연구가 건강 관리 및 식품 산업에서 잠재적 인 응용 프로그램으로 인해 플라보놀의 유도에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나, 유기 용매와 화학 합성을 사용하여 기존의 식물 추출은 플라보놀의 생산에 사용을 제한 본질적인 단점을 가지고. 여기서, 우리는 시험관 내 비엔자이체 캐스케이드를 확립하여 한 냄비에 플라바놀로부터 플라보놀을 제조하는 상세한 방법을 보고한다. 이 프로토콜의 ...

플라보놀은 식물 플라보노이드의 주요 하위 클래스이며 식물 개발 및색소 침착 1,2,3에관여합니다. 더 중요한 것은, 이 화합물은 항암제 4,5,산화6,항염증제 7, 항비만8,항고혈압 제 9와 같은 건강에 유익한 활동의 넓은 범위를 가지고 있습니다 , 및 메모리 리콜 속성10,이러한 식물 유래 보조 대사 산물에 대한 연구의 큰 숫자로 이어지는. 전통적으로, 이러한 화합물은 주로 유기 용매를 사용하여 식물 추출에서 파생됩니다. 그러나 식물11,12,13의함량이 매우 낮기 때문에 대부분의 플라보놀의 생산 비용은 여전히 높으며, 이는 의료 및 식품 분야에서의 적용에 큰 제한을 가합니다. 산업.
지난 수십 년 동안 과학자들은 플라보노이드14,15을파생하는 많은 방법을 개발했습니다. 그러나, 이러한 복잡한 분자의 화학적 합성은 다양한 본질적 단점을 가지고있다 16. 독성 시약 및 극단적인 반응 조건뿐만 아니라 표적 플라보노이드화합물(14,17)을생성하는 많은 단계도 필요하다. 더욱이, 이 전략에 있는 또 다른 중요한 도전은 액티브한 플라보노이드 분자의 키랄 종합입니다. 따라서 화학 합성16,17을통해 상업적 규모로 플라보노이드를 생산하는 것은 이상적인 전략이 아닙니다.
최근 과학자들은 플라보노이드 생합성 경로를 가진 미생물을 엔지니어링하여 이러한 복잡한 천연 화합물을 생산하는 유망한 대체 전략을 개발했습니다18,19,20, 21세 , 22,이는 성공적으로 식물23에서해독되었습니다. 예를 들어, Duan 등은 개화 효모 사카로미세세스 세레비시아에 생합성 경로를 도입하여 kaempferol(KMF)24를생산하였다. Malla et al. 아스트라갈린, 글리코실화 플라보놀,플라바노3-하이드록실라제(f3h),플라보놀 신타제(fls1), UDP-글루코골트랜스퍼라제:플라보노이드 3-O-글루코실 트랜스퍼랙타제 UGT78K1 유전자를 도입하여 대장균BL21 (DE3)17. 비록 꽤 많은 패러다임이 있지만, 모든 유전자 조작 미생물은 세포 플랫폼의 복잡성, 인위적으로 합성 된 유전 요소와 숙주 사이의 비호환성, 억제력으로 인해 관심있는 제품을 생산하지는 않습니다. 숙주 세포에 대한 표적 제품의 효과, 그리고 엔지니어링 된 세포 시스템 자체의 불안정성16.
플라보노이드 생산을 위한 또 다른 유망한 대안 전략은 시험관내에서 다중 효소 캐스케이드를 확립하는 것입니다. Cheng 외. 엔테로신 폴리케타이드는 하나의 냄비(25)에 완전한 효소 경로를 조립함으로써성공적으로 합성될 수 있다고 보고되었다. 이 무세포 합성 전략은 미생물 생산 공장의 제한을 우회하므로 일부 플라보노이드를 대량으로 생산할 수 있습니다16.
최근에는 나린게닌(NRN)을 한 냄비에 KMF로 변환하는 이효소합성 시스템을 성공적으로 개발했습니다. 여기에서는 이 시스템을 자세히 설명하고 제품 분석과 관련된 방법을 설명합니다. 우리는 또한 NRN에서 KMF를 생산하기 위해이 시스템을 사용하는 두 가지 예를 제시하고 eriodictyol에서 케르세틴 (QRC)(ERD). 또한, 우리는 플라보노이드의 생합성에 있는 이 방법의 중요한 단계 및 미래 연구 방향을 토론합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

플라보놀은 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가진 플라보노이드의 주요 하위 클래스입니다. 여기서, 우리는 플라보놀의 시험관 내 효소 합성을 위한 방법을 제공한다. 이 방법에서는 플라보놀의 생합성 경로에 있는 두 가지 주요 유전자인 Atf3h와 Atfls1이 대장균에서복제되고 과발화됩니다. 재조합 효소는 친화성 컬럼을 통해 정제되고 그 후 비엔자이매틱 캐스케이드가 특정 합성 완충제에 확립됩니다. 두 개의 플라보놀은 이 시스템에서 예로 합성되며 TLC 및 HPLC/LC/MS 분석에 의해 결정됩니다. 이 방법은 다른 접근법에 비해 플라보놀의 유도에 명백한 이점을 표시합니다. 그것은 시간과 노동 을 절약하고 매우 비용 효율적입니다. 반응은 정확하게 제어하기 쉽고 따라서 대량 생산을 위해 확장됩니다. 대상 제품은 시스템의 간단한 구성 요소로 인해 쉽게 정제 될 수 있습니다. 그러나,이 시스템은 일반적으로 플라바네에서 플라보놀의 생산으로 제한됩니다.

F3H 및 FLS1은 도1에 도시된 바와 같이 식물에서 플라바놀로 플라바놀을 변환하는 데 중요한 두 가지 중요한 효소이다. 플라바논으로부터 플라보놀을 제조하기 위한 생체외 생합성 시스템을 개발하기 위해, Atf3h(GenBank 수탁 없음. NM_114983.3) 및 Atfls1(GenBank 가입 없음) NM_120951.3) 유전자는 4주된 A. 탈리아나의 묘목으로부터 원핵발현 벡?...

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Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

플라보놀의 유도는 의료 및 식품 산업에서의 응용에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 플라바논의 플라보놀의 생합성을 위한 상세한 프로토콜을 제공하고 그밖 접근에 비해 중요한 단계 및 그것의 이점에 토론합니다.

플라바놀에서 플라보놀의 생합성은 원팟 비엔자이매틱 캐스케이드를 확립하여

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 쉽게 한 냄비에 플라바놀에서 플라보놀의 꽤 많은 을 생산할 수 있습니다. 이 기술은 인건비와 시간 절약, 매우 비용 효율적이며 제어하기 쉽기 때문에 거대한 산업화 잠재력을 가지고 있습니다. 예,이 방법은 다른 보조 대사 산물의 경제 생산에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 적용 할 때 약간의 수정이 필요합니다.그는 일반적으로 아무것도 또는 매우 낮은 수율을 얻을 것이다. 내 조언은 얼음에 재조합 효소를 처리하고 효소의 재고 용액에 10 %의 글리세린을 추가하는 것입니다. 시각적 데모를 통해서만 새로운 손이 실험의 성공적인 실행에 영향을 미치는 중요한 세부 사항과 진실을 이해할 수 있기 때문입니다.먼저 버퍼를 준비합니다. 적량의 TRIS 베이스, 아스코르바트 나트륨, 알파 케토글루타릭 산을 이온화 된 물로 용액에 적절한 양의 글리세롤을 용액에 용해시킴으로써 두 번 합성 버퍼를 만듭니다. 파이펫을 사용하여 염산을 추가하여 pH를 7.2로 조정하고, 이온화 된 물을 추가하여 부피를 조정합니다.향후 사용을 위해 두 번의 합성 버퍼를 섭씨 4도에 저장합니다. 그런 다음 탈온화 된 물에 철 황산염 heptahydrate를 용해하여 100 배 의 재고 솔루션을 만듭니다. 메탄올에 플라보노이드를 용해시켜 25 밀리머 플라보노이드의 스톡 솔루션을 만들고, 영하 20도의 용액을 저장합니다.가장 중요한 단계는 합성 시스템을 설정하는 것입니다. 플라바놀에서 플라바놀을 생산하기 위해 합성 시스템을 설정하려면 먼저이 표에 나열된 시약에 따라 2 밀리리터 튜브에서 합성 시스템을 준비하십시오. 오픈 튜브를 섭씨 40도에서 600rpm에 400rpm에 흔들어 놓습니다.그 후, 아세트산의 10 마이크로리터와 에틸 아세테이트 100 마이크로리터를 추가하여 반응을 종료한다. 2시간 후 파이펫을 사용하여 상단 유기상을 1.5밀리리터 튜브로 트랜퍼링하고 튜브를 후드에 배치하여 실온에서 공기 건조를 합니다. TLC 분석을 수행하기 위해 먼저 후드에서 튜브를 회수하고 튜브에서 메탄올 160 마이크로 리터에서 플라바노이드 분말을 재해석하십시오.메탄올에 25 밀리머 플라보노이드 스톡 솔루션을 희석하여 본격적인 플라보노이드 샘플을 시리얼 농도로 준비합니다. 재용된 반응 샘플의 마이크로리터 1개, 정통 플라보노이드 샘플의 마이크로리터 1개를 폴리아미드 플레이트에 적재합니다. 같은 접시에 정통 플라보노이드의 다른 농도에 대해 동일한 작업을 수행합니다.그런 다음 연기 후드에 용매 시스템으로 채워진 크로마토그래피 실린더에 샘플로드 플레이트를 넣습니다. 플레이트를 실린더 바닥에 부착하고 용매 시스템에서 플레이트를 20분 동안 실행합니다. 공기는 실온에서 접시를 건조.분무기 병으로 알루미늄 염화물의 1 % 에탄올릭 용액으로 접시를 분사한 다음 실온에서 30 분 동안 다시 공기 건조를합니다. 254 나노미터에서 UV 빛 아래 플레이트의 반점을 시각화하고 이미지를 촬영한 다음 컴퓨터에서 소프트웨어를 ImageJ로 엽니다. 파일을 클릭하여 열고 분석할 이미지를 엽니다.ImageJ 사용자 인터페이스에서 왼쪽 대부분의 직사각형 선택 도구를 클릭합니다. 이미지의 ROI를 마우스로 윤곽을 지정하고 첫 번째 ROI에 레이블을 지정합니다. 마우스오른쪽마우스로 직사각형 선택을 다음 ROI로 이동하고 두 번째 ROI에 레이블을 지정하려면 두 개를 누릅니다.두 개를 눌러 다른 모든 ROI에 레이블을 반복합니다. 팝업 창에서 모든 ROI에 대한 프로필 플롯을 생성하려면 세 가지를 누릅니다. 그런 다음 직선 선택 도구를 사용하여 각 관심 피크에 대해 닫힌 영역을 정의하도록 기준선을 삭제합니다.ImageJ 사용자 인터페이스에서 해당 아이콘을 클릭하여 지팡이 도구를 활성화합니다. 피크 내부를 클릭하여 팝업 창의 모든 피크에 대한 결과를 표시합니다. 다음으로, Excel에서 팝업 창에서 해당 플라보노이드 농도에 대해 회색 값을 플롯하여 본격적인 플라보노이드의 TLC 기반 표준 곡선을 만듭니다.그런 다음 결과 수식에 따라 이 프로토콜에서 생산되는 관심의 플라보노이드의 수율을 계산합니다. 주사기를 사용하여 0.45 마이크로미터 및 0.22 마이크로미터 필터를 통해 각 샘플을 순차적으로 처리합니다. 흡입 노즐을 통해 샘플을 HPLC-MS 시스템에 로드하고 C18 열을 사용하여 샘플을 섭씨 30도에서 분리합니다.물에서 10~85%의 아세틸 니트릴의 그라데이션으로 분당 1밀리리터로 컬럼을 엘테우트하고, 200~800나노미터의 용액의 흡수도를 모니터링한다. LC-MS 분석을 음의 이온 모드에서 수행하여 분당 10리터의 건조 질소 흐름이 섭씨 300도에서 250°C에서 분당 7리터의 시스 가스 흐름으로, 내장된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다. 단일 파장 크로마토그래프를 추출하려면 질적 분석 프로그램을 열고 파일을 클릭하여 데이터 파일을 엽니다.열린 데이터 파일 창에서 분석할 파일을 선택하고 파일을 열어 보려면 열어 보도록 클릭합니다. 크로마토그램 결과 창에서 마우스를 마우스로 클릭한 다음 팝업 메뉴에서 크로마토그램을 추출합니다. 유형 목록에서 다른 크로마토그램을 클릭합니다.검출기 콤보 상자에서 DAD1을 선택한 다음 확인을 클릭하여 HPLC 결과를 크로마토그램 결과 창에 표시합니다. 크로마토그램 결과 창 상단에 도킹된 수동 통합 아이콘을 클릭합니다. 마우스와의 수동 통합 분석에 필요한 피크에 대한 기준선을 그립니다.결과를 표시하려면 보기, 통합 피크 목록을 클릭합니다. 피크 영역의 결과를 Excel에 복사하고, 해당 플라보노이드 농도에 대한 정통 플라보노이드의 HPLC 기반 표준 곡선을 플롯한 다음, 결과 수식에 따라 이 프로토콜에서 생성된 관심있는 플라보노이드의 수율을 계산한다. 그런 다음 동일한 절차를 반복하여 단일 파장 크로마토그램을 추출하여 플라보노이드 화합물의 정확한 질량에 대한 MS 데이터를 분석합니다.크로마토그램 결과 도구 모음에서 범위 선택 아이콘을 클릭합니다. 관심의 절정을 선택합니다. 선택한 범위에서 마우스를 마우스오른쪽단추로 클릭하고 팝업 메뉴에서 추출 MS 스펙트럼을 클릭하여 MS 스펙트럼 결과 창에 결과를 표시합니다.이 체외 시스템이 플라보놀로 플라바놀을 변환하는 데 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 NRN이 시스템에 추가되었습니다. 폴리아미드 TLC 플레이트에 두 개의 새로운 반점이 나타났습니다. 한 지점은 DHK와 유사한 마이그레이션 거리를 보였으며 다른 지점은 KMF와 비슷합니다.HPLC와 LC-MS에 의한 추가 분석은 새로운 화학 물질이 DHK와 KMF와 동일했던 287 및 285에서 Z를 통해 준 분자 이온 피크 M에서 각각 12 분 및 20 분의 보존 시간을 보였다는 것을 보여주었습니다. 시스템이 다른 플라바놀을 해당 플라보놀로 변환하는 데 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 ERD가 시스템에 추가되었습니다. 폴리아미드 TLC 플레이트의 두 개의 새로운 스팟은 각각 DHQ 및 QRC와 유사한 이동 거리를 표시했습니다.HPLC와 LC-MS 분석은 이 새로운 화학 물질이 각각 10 분 및 16 분의 보존 시간을 드러냈으며, 303 및 301에서 Z를 통해 준 분자 이온 피크 M이 정확히 DHQ 및 QRC에 해당한다는 것을 입증했습니다. 합성 시스템을 준비할 때, 마지막으로 효소를 추가하고, 마지막으로 두 번째로 철 황산염을 추가해야 합니다. 예, 그것은 다른 이차 대사 산물의 경제적 생산에 대한 가이드를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

연구

생화학

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

보호 그룹 산 - 불안정의 보존에 적합한 니켈 쉬프 - 자료의 가수 분해 복잡한 사용 조건

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

단백질 영화 적외선 전기 화학 [NiFe] Hydrogenase에 의해 H2 산화의 연구에 대 한 설명

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...