Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Detta arbete stöddes ekonomiskt av Yangzhou University särskilt utsedda professor start-up fonder, Jiangsu särskilt utsedda professor start-up fonder, sex Talent Peaks projekt i Jiangsu-provinsen (Grant No. 2014-SWYY-016), och ett projekt som finansieras av den prioriterade akademiska program utvecklingen i Jiangsu högre utbildningsanstalter (veterinärmedicin). Vi tackar testcentret för Yangzhou University för HPLC och MS analyser av flavonoider.

1. isolera totalt RNA från växt vävnader26,27
<ol><li>Homogenisera växternas vävnader.<ol>
<li>Samla 100 mg av en ny växtvävnad (t. ex., 4-veckors-gamla plantor från Arabidopsis thaliana). Frys vävnaden och en mortel och murbruk med flytande kväve, följt av slipning vävnaden i pulver.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL RNA-isoleringsreagens (se tabell över material) i murbruket. Reagensen kommer att frysas omedelbart. Homogenisera ...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

Ganska många studier är inriktade på härledning av flavonoler på grund av deras potentiella tillämpning inom hälso-och sjukvård och livsmedelsindustrin. Men traditionella växt utvinning med organiska lösningsmedel och kemisk syntes besitter inneboende nackdelar, som begränsar deras användning i produktionen av flavonoler. Här, Vi rapporterar en detaljerad metod för att producera en flavonol från en flavanone i en kruka genom att etablera en in vitro bienzymatisk kaskad. De kritiska stegen i detta protokoll...

Flavonoler är en stor underklass av växt flavonoider och är involverade i växternas utveckling och pigmentering1,2,3. Ännu viktigare, dessa föreningar besitter ett brett spektrum av hälso-positiva aktiviteter, såsom anti-cancer4,5, anti-oxidativ6, anti-inflammatorisk7, antifetma8, blodtryckssänkande9 och minnes återkallnings egenskaper10, vilket leder till ett stort antal studier av dessa växthärledda sekundära metaboliter. Traditionellt är dessa föreningar huvudsakligen härrör från växt utvinning med organiska lösningsmedel. Men på grund av deras mycket låga halter i växter11,12,13, produktionskostnaden för de flesta flavonoler fortfarande hög, vilket innebär stora restriktioner för deras tillämpning inom vården och livsmedels Industrin.
Under de senaste decennierna har forskarna utvecklat ett ganska antal metoder för att härleda flavonoider14,15. Emellertid, kemisk syntes av dessa komplicerade molekyler besitter en mängd inneboende nackdelar16. Det kräver inte bara giftiga reagenser och extrema reaktions förhållanden, men också många steg för att producera ett mål flavonoid förening14,17. Dessutom är en annan viktig utmaning i denna strategi den kirala syntesen av aktiva flavonoid molekyler. Därför är det inte en idealisk strategi för att producera flavonoider i kommersiell skala via kemisk syntes16,17.
Nyligen har forskarna utvecklat en lovande alternativ strategi för att producera dessa komplicerade naturliga föreningar genom att Engineering mikrober med en väg för flavonoid biosyntes18,19,20, 21 , 22, som framgångsrikt har dechiffrerats i växter23. Till exempel införde Duan et al. en biosyntetisk väg in i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae att producera kaempferol (KMF)24. Malla et al. producerade astragalin, en glykosylerad flavonol, genom att införaflavanone 3-hydroxylas (f3h), flavonol syntas (fls1), och UDP-glukos: flavonoid 3-O-glukosyltransferas UGT78K1 gener till Escherichia coliBL21 (de3)17. Även om det finns en hel del paradigm, inte alla genetiskt modifierade mikrober producera produkter av intresse på grund av komplexiteten i en cellulära plattform, inkompatibilitet mellan artificiellt syntetiserade genetiska element och värdar, den hämmande effekt av målprodukter mot värdceller, och instabilitet i en konstruerad cellulära systemet själv16.
En annan lovande alternativ strategi för flavonoid produktion är att etablera en multienzymatisk kaskad in vitro-. Cheng et al. har rapporterat att enterocin polypetider kan framgångsrikt syntetiseras genom att samla en komplett enzymatisk väg i en pott25. Denna cell-fri syntetisk strategi kringgår begränsningarna av en mikrobiell produktion fabriken och därmed är möjligt för att producera vissa flavonoider i stor mängd16.
Nyligen har vi framgångsrikt utvecklat ett bienzym syntetiskt system för att omvandla naringenin (NRN) till KMF i en pott16. Här beskriver vi detta system i stora detaljer och de metoder som ingår i analysering av produkterna. Vi presenterar också två exempel som använder detta system för att producera KMF från NRN och quercetin (QRC) från eriodictyol (ERD). Dessutom diskuterar vi viktiga steg i denna metod och framtida forsknings riktningar i biosyntesen av flavonoider.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

Flavonoler är en stor subklass av flavonoider med en mängd olika biologiska och farmakologiska aktiviteter. Här, vi ger en metod för in vitro enzymatisk syntes av en flavonol. I denna metod, Atf3h och Atfls1, två viktiga gener i den biosyntetiska vägen av flavonoler, klonas och överuttrycks i Escherichia coli. De rekombinanta enzymerna renas via en affinitetskolonn och därefter etableras en bienzymatisk kaskad i en specifik syntetisk buffert. Två flavonoler syntetiseras i detta system som exempel och bestäms av TLC och HPLC/LC/MS analyser. Metoden visar uppenbara fördelar i härledning av flavonoler över andra metoder. Det är tid-och arbetsbesparande och mycket kostnadseffektivt. Reaktionen är lätt att kontrolleras noggrant och därmed skalas upp för massproduktion. Mål produkten kan renas enkelt på grund av de enkla komponenterna i systemet. Emellertid, detta system är vanligtvis begränsad till produktion av en flavonol från en flavanone.

F3H och FLS1 är två viktiga viktiga enzymer i omvandlingen av en flavanone till en flavonol i växter som visas i figur 1. Att utveckla ett in vitro-biosyntetiskt system för att framställa en flavonol från en flavanone, Atf3h (genbank anslutning nr. NM_ 114983.3) och Atfls1 (genbank-Anslutningsnr. NM_ 120951.3) gener klonas från plantor av 4-veckors gammal A. thaliana till ett prokaryotiskt uttryck vektor pET-32a (+). De rekom...

Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Härledningen av en flavonol är avgörande för dess tillämpning inom hälso-och sjukvården och livsmedelsindustrin. Här ger vi ett detaljerat protokoll för biosyntesen av en flavonol från en flavanone och diskutera de avgörande stegen och dess fördelar jämfört med andra metoder.

Biosyntes av en flavonol från en Flavanone genom att etablera en en-Pot Bienzymatisk kaskad

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Med hjälp av detta protokoll kan vi enkelt producera ganska många flavonoler från flavanones i en pott. Denna teknik är arbets-och tidsbesparande, mycket kostnadseffektivt, och lätt att kontrollera, så det har en enorm industrialisering potential. Ja, denna metod kan ge insikt i ekonomisk produktion av andra sekundära metaboliter, men det behöver vissa ändringar när de tillämpas på den.Han kommer vanligtvis att få ingenting eller mycket låg avkastning. Mitt råd är att hantera rekombinanta enzymer på is och lägga till 10%glycerin till stamlösningen av enzymer. Det beror på att endast genom visuell demonstration kan en ny hand förstå de viktiga detaljerna och sanningen som påverkar det framgångsrika genomförandet av experimentet.Förbered först buffertar. Gör två gånger syntetisk buffert genom att lösa upp lämplig mängd TRIS-bas, natriumaskorbat, alfaketoglutarsyra till avjoniserat vatten, och pipettera lämplig mängd glycerol till lösningen. Använd en pipett för att lägga till saltsyra för att justera pH-värdet till 7.2, och justera volymen genom att tillsätta avjoniserat vatten.Förvara de två gånger syntetiska bufferten vid fyra grader Celsius för framtida bruk. Gör sedan en 100 gånger stamlösning genom att lösa upp järnsulfat heptahydrat i avjoniserat vatten. Gör en stamlösning på 25 millimolar flavonoid genom att lösa upp flavonoid i metanol, och förvara lösningen på minus 20 grader Celsius.Det mest kritiska steget är att inrätta ett syntetiskt system. För att inrätta ett syntetiskt system för att framställa en flavanol från ett flavanon, först förbereda det syntetiska systemet i en två milliliter rör enligt de reagenser som anges i denna tabell. Placera det öppna röret i ett skakande värmeblock vid 40 grader Celsius, vid 600 rpm i fyrtio minuter.Därefter avsluta reaktionen genom att tillsätta 10 mikroliter av ättiksyra, och 100 mikroliter av etylacetat. Två timmar senare, använd en pipett för att tranfer den översta organiska fasen till en 1,5 milliliter rör, och placera röret i en huva för lufttorkning vid rumstemperatur. För att utföra TLC-analys, hämta först rören från huven, och redissolve det flavanoida pulvret i 160 mikroliter metanol i ett rör.Bered autentiska flavonoidprover med seriekoncentrationer, genom att späda ut stamlösningen på 25 millimolar flavonoid i metanol. Ladda en mikroliter av det återsvalade reaktionsprovet, och en mikroliter av det autentiska flavonoida provet, på en polyamidplatta. Gör samma sak för de andra koncentrationerna av autentisk flavonoid på samma platta.Lägg sedan i en draghuv provets lastade platta i en kromatograficylinder fylld med ett lösningsmedelssystem. Fäst plattan på botten av cylindern, och kör plattan i lösningsmedlet systemet i 20 minuter. Lufttorka plattorna i rumstemperatur.Med en spruta flaska, spraya plattorna med 1%etanollösning av aluminiumklorid, följt av lufttorkning igen vid rumstemperatur i 30 minuter. Visualisera fläckarna på plattorna under ett UV-ljus vid 254 nanometer, och ta bilder, sedan på datorn, öppna programvaran ImageJ. Klicka på fil, öppna, för att öppna bilden som ska analyseras.Klicka på det vänstra mest rektangulära markeringsverktyget i Användargränssnittet i ImageJ. Dra en disposition över avkastningen på investeringen i bilden med musen och tryck på en för att ge den första avkastningen på investeringen en etikett. Flytta den rektangulära markeringen med musen till höger till nästa ROI, och tryck på två för att märka den andra roi.Upprepa för att märka alla andra ROIs genom att trycka på två. Tryck på tre för att generera profilytter för alla ROIs, i ett popup-fönster. Använd sedan verktyget för val av rak linje för att släppa baslinjer så att ett stängt område för varje topp av intresse definieras.Aktivera trollstavsverktyget, genom att klicka på motsvarande ikon i ImageJ-användargränssnittet. Klicka inuti toppen för att visa resultat för alla toppar i ett popup-fönster. Därefter, i Excel, rita de grå värdena från popup-fönstret mot motsvarande flavonoid koncentrationer, att göra en TLC baserad standardkurva av den autentiska flavonoid.Beräkna sedan avkastningen av flavonoid av intresse som produceras i detta protokoll, enligt den resulterande formeln. Använd en spruta för att bearbeta varje prov sekventiellt genom en 0,45 mikrometer och 0,22 mikrometerfilter. Ladda proverna i ett HPLC-MS-system genom sugmunstycke, och separera proverna i 30 grader Celsius med hjälp av en C18-kolonn.Elute kolonnen på en milliliter per minut med en lutning på 10 till 85 volym acetyl nitril i vatten, och övervaka absorbansen av eluatet från 200 till 800 nanometer. Utför LC-MS-analysen i ett negativt jonläge, med ett torkningsgasväveflöde på 10 liter per minut vid 300 grader Celsius, i ett ljt gasflöde på sju liter per minut vid 250 grader Celsius, och samla in data med hjälp av en inbyggd programvara. För att extrahera enstaka våglängdkromatografer, öppna programmet för kvalitativ analys och klicka på fil, öppna datafil.Välj filen som ska analyseras i det öppna datafilsfönstret och klicka på Öppna för att öppna filen. Högerklicka med musen i kromatogramresultatfönstret och extrahera sedan kromatogram i en popup-meny. I typlistan klickar du på andra kromatogram.I detektorn kombinationsruta, välj DAD1, klicka sedan okej för att visa HPLC resultat i kromatogram resultatfönstret. Klicka på den manuella integrationsikonen som dockas överst i resultatfönstret för kromatogram. Rita baslinje för den topp som krävs för manuell integrationsanalys med musen.Klicka på vy, integration topplista, för att visa resultaten. Kopiera resultaten av toppområdena till Excel, och rita en HPLC baserad standardkurva av den autentiska flavonoid mot motsvarande flavonoidkoncentrationer, beräkna sedan avkastningen av flavonoid av intresse som produceras i detta protokoll enligt den resulterande formeln. Upprepa sedan samma procedurer för att extrahera enstaka våglängdkromatogram för att analysera MS-data för den exakta massan av flavonoidföreningar.Klicka på ikonen för intervallval i chromatogramresultatens verktygsfält. Välj toppen av intresse. Högerklicka med musen i det markerade området och klicka på extrahera MS-spektret i popup-menyn för att visa resultaten i fönstret MS-spektrumresultat.För att avgöra om detta in vitro-system kan användas för omvandling av ett flavanone till en flavonol, lades NRN in i systemet. Det fanns två nya fläckar fram på en polyamid TLC plattan. En plats visade en flyttningsavstånd liknande dhk, och de andra liknar KMF.Ytterligare analys av HPLC och LC-MS visat att den nya kemikalien visade en retentionstid på 12 minuter och 20 minuter respektive, i en kvasi-molekylär jon topp M över Z vid 287 och 285 som var identiska med dem i DHK och KMF. För att avgöra om systemet kan användas för omvandling av andra flavanones till deras motsvarande flavonoler, lades ERD in i systemet. Två nya fläckar på en polyamid TLC-platta visade en migrationssträcka som liknar DHQ respektive QRC.HPLC och LC-MS analyser visat att dessa nya kemikalier visade en retentionstid på 10 minuter och 16 minuter respektive, och en kvasi-molekylär jon topp M över Z vid 303 och 301, som exakt motsvarade de dhq och QRC. När du förbereder det syntetiska systemet, bör du lägga till enzymet sist, och tillsätt järnsulfat sekund till sist. Ja, det ger en guide för den ekonomiska produktionen av andra sekundära metaboliter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

En skräddarsydd HPLC reningsprotokoll som ger hög renhet Amyloid Beta 42 och Amyloid Beta 40 Peptider som kan oligomerbildning

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Mätning av proteinbindning till F-aktin genom sam-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolys av en Ni-Schiff-Base Complex Använda betingelser som är lämpliga för Bibehållande av syralabil skydds Grupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film infraröd elektrokemi visat för studie av H2 Oxidation av en [NiFe] Hydrogenase

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

En jäst 2-Hybrid skärm i Batch att jämföra proteininteraktioner

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Detektion av protein ubiquitination platser av peptidanrikning och masspektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Isolering av Lipoproteinpartiklar från kyckling äggula för studiet av bakteriell patogen fettsyra inkorporering i Membranfosfolipider

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Avlägsnande och ersättning av endogena ligander från lipidbundna proteiner och allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...