Name: biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Bu çalışma, Yangzhou Üniversitesi Özel Olarak Atanan Profesör Start-up Fonları, Jiangsu Özel Olarak Atanan Profesör Başlangıç Fonları, Jiangsu Eyaleti'ndeki Altı Yetenek Tepeleri Projesi (Grant No. 2014-SWYY-016) tarafından finanse edilen bir Proje tarafından finansal olarak desteklendi. Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (VeterinerHenhenk) Öncelikli Akademik Program Gelişimi. Biz Flavonoidler HPLC ve MS analizleri için Yangzhou Üniversitesi Test Merkezi teşekkür ederiz.

1. Toplam RNA'yı bitki dokularından izole et26,27
<ol><li>Bitki dokularını homojenize edin.<ol>
<li>Taze bir bitki dokusu (örneğin, Arabidopsis thaliana4 haftalık fideler) 100 mg toplamak. Doku ve sıvı azot ile bir havaneli ve harç dondurun, toz içine doku taşlama takip.</li>
		<li>Harcın içine 1 mL RNA izolasyon reaktifi ekleyin (Bkz. MalzemeTablosu). Reaktif hemen dondurulacak. Dondurulmuş reaktif eridiğinde doku örn...

<ol>
	<li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoids:+biosynthesis,+biological+functions,+and+biotechnological+applications.">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222 (2012).</li><li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development.">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+(L.)+sweet+pods.">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents:+Design,+synthesis,+and+evaluation+in+cell+models.">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells.">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li><li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+(Aesculus+turbinata+BLUME).">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li><li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults.">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li><li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats.">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li><li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure:+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials.">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li><li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer's+disease+patients.">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li><li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+determination+of+flavonoids,+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+(L.)+by+HPLC+analysis.">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li><li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition,+Antioxidant,+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey.">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li><li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species.">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li><li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Synthetic+Methods+of+Flavones.">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li><li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+(author's+transl).">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin.">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li><li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli.">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li><li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli.">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li><li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li><li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli.">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li><li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli.">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li><li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae.">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155 (2012).</li><li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics,+biochemistry,+cell+biology,+and+biotechnology.">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li><li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165 (2017).</li><li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides.">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li><li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol.">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction.">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1:+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase.">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+cloning+into+plasmid+vectors.">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters.">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2++Absorption+Chromatography.">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li><li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species.">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li><li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana.">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li></ol>

Pek çok çalışma, sağlık ve gıda endüstrisindeki potansiyel uygulamaları nedeniyle flavonollerin türemesi üzerine odaklanmıştır. Ancak, organik çözücüler ve kimyasal sentez kullanarak geleneksel bitki çıkarma flavonolüretiminde kullanımını kısıtlayan içsel dezavantajları vardır. Burada, bir in vitro bienzymatik kaskad kurarak bir tencerede bir flavanone flavonol üretmek için ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu protokoldeki kritik adımlar şunlardır: 1) yüksek aktivite ile saf rekombinant e...

Flavonoller bitki flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır ve bitkigeliştirme ve pigmentasyon 1,2,3katılır. Daha da önemlisi, bu bileşikler sağlık açısından yararlı faaliyetleri geniş bir yelpazede sahip, anti-kanser gibi4,5, anti-oksidatif6, anti-inflamatuar7, antiobezite8, anti-hipertansif9 , ve bellek hatırlama özellikleri10, bu bitki kaynaklı ikincil metabolitleri üzerinde çalışmalar çok sayıda yol açan. Geleneksel olarak, bu bileşikler esas olarak organik çözücüler kullanılarak bitki çıkarma elde edilir. Ancak, bitkilerde çok düşük içeriği nedeniyle11,12,13, en flavonoller için üretim maliyeti yüksek kalır, hangi sağlık ve gıda uygulamaları üzerinde büyük kısıtlamalar empoze Sanayi.
Son yıllarda, bilim adamları flavonoidler 14,15türetmek için yöntemler oldukça sayıda geliştirdik. Ancak, bu karmaşık moleküllerin kimyasal sentezi içsel dezavantajları çeşitli sahip16. Sadece toksik reaktifler ve aşırı reaksiyon koşulları gerektirir, ama aynı zamanda bir hedef flavonoid bileşik üretmek için birçok adım14,17. Ayrıca, bu stratejide bir diğer önemli sorun aktif flavonoid moleküllerin chiral sentezidir. Bu nedenle, kimyasal sentez ihrama yoluyla ticari bir ölçekte flavonoidler üretmek için ideal bir strateji değildir16,17.
Son zamanlarda, bilim adamları flavonoid biyosentez için bir yol ile mühendislik mikroplartarafından bu karmaşık doğal bileşikler üretmek için umut verici bir alternatif strateji geliştirdik18,19,20, 21.000 , 22, hangi başarıyla bitkilerde deşifre edilmiştir23. Örneğin, Duan ve ark kaempferol üretmek için tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae içine biyosentetik bir yol tanıttı (KMF)24. Malla ve ark.flavanone 3-hidroksilaz (f3h),flavonol synthase(fls1)ve UDP-glukoz:flavonoid 3-O-glukoziltransferaz UGT78K1 genleri ile tanıştırarak, glikozile flavonol, bir glikozile flavonol üretti Escherichia coliBL21(DE3)17. Oldukça az paradigma olmasına rağmen, tüm genetiği değiştirilmiş mikroplar hücresel bir platformun karmaşıklığı, yapay olarak sentezlenen genetik elementler ve konaklar arasındaki uyumsuzluk, inhibitör nedeniyle ilgi ürünleri üretmek konak hücrelere karşı hedef ürünlerin etkisi ve tasarlanmış bir hücresel sistemin kendisi istikrarsızlığı16.
Flavonoid üretimi için umut verici bir alternatif strateji in vitro multienzymatik bir basamak kurmaktır. Cheng ve ark. enterocin poliketides başarıyla bir pot25tam bir enzimatik yol montajı ile sentezlenebilir bildirdin. Bu hücre içermeyen sentetik strateji bir mikrobiyal üretim fabrikasının kısıtlamaları afordan ve böylece büyük miktardabazı flavonoidler üretmek için mümkün 16 .
Son zamanlarda, naringenin dönüştürmek için bir bienzim sentetik sistem geliştirdik (NRN) kmf içine bir pot16. Burada, bu sistemi büyük ayrıntılarla ve ürünlerin analizinde yer alan yöntemlerle tanımlıyoruz. Ayrıca bu sistemi eriodictyol'dan NRN ve quercetin (QRC) kmf üretmek için kullanan iki örnek salıyoruz. Buna ek olarak, flavonoidlerin biyosentezinde bu yöntemin önemli adımlarını ve gelecekteki araştırma yönlerini tartışıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#215; Pfu MasterMix</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0717A</td>
			<td>PCR amplification of genes with high fidelity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydrokaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>91216</td>
			<td>intermediate product for producing kaempferol from naringenin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dihydroquercetin</td>
			<td>Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine</td>
			<td>PCS0371</td>
			<td>intermediate product for producing quercetin from eriodictyol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean-up Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2301</td>
			<td>purification of PCR-amplified or gel-purified DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eriodictyol</td>
			<td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>B21160</td>
			<td>substrate for producing quercetin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0809</td>
			<td>bacteria strain for expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0808</td>
			<td>bacteria strain for plasmid proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System</td>
			<td>Labconco Corporation</td>
			<td>7740020</td>
			<td>an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Extraction Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW2302</td>
			<td>purification of a DNA band from an agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging System</td>
			<td>Shanghai Tanon Science &#38; Technology Co. Ltd.</td>
			<td>Tanon- 
			2500</td>
			<td>an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenElute Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>PLN350-1KT</td>
			<td>minipreparation of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kaempferol</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>60010</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04)</td>
			<td>Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC/LC/MS data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-8000-GL</td>
			<td>an equipment for determination of DNA/RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>naringenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td>
			<td>N5893</td>
			<td>substrate for producing kaempferol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-IDA Agarose Resin</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0010</td>
			<td>purification of His-tagged fusion proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-32a(+)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69015-3</td>
			<td>plasmid for cloning and expressing target genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid sequencing</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>sequencing of recombinant plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primer synthesis</td>
			<td>GENEWIZ Suzhou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>synthesis of PCR primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quercetin</td>
			<td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td>
			<td>Q111273</td>
			<td>final reaction product and standard substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperRT cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td>
			<td>CW0741</td>
			<td>synthesis of the first strand of cDNA from total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EL0016</td>
			<td>ligation of an insert into a linearized vector DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td>isolation of total RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector NTI Advance</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605099</td>
			<td>a software for PCR primer design and DNA sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur v2.0.7</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td>a software for analysis of HPLC data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biosynthesis of a flavonol from a flavanone by establishing a one-pot bienzymatic cascade

Flavonoller çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktivitelere sahip flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır. Burada, bir flavonol in vitro enzimatik sentezi için bir yöntem sağlar. Bu yöntemde, Atf3h ve Atfls1, flavonollerin biyosentetik yolu iki anahtar genler, klonlanmış ve Escherichia coliaşırı ifade edilir. Rekombinant enzimler bir yakınlık sütunu ile saflaştırılır ve daha sonra belirli bir sentetik tampon da bienzimatik basamak kurulur. Bu sistemde iki flavonol örnek olarak sentezlenir ve TLC ve HPLC/LC/MS analizleri ile belirlenir. Yöntem diğer yaklaşımlar üzerinde flavonoller türeyen belirgin avantajlar görüntüler. Bu zaman ve emek tasarrufu ve son derece uygun maliyetli. Reaksiyonun doğru bir şekilde kontrol edilmesi kolaydır ve böylece seri üretim için ölçeklendirilir. Hedef ürün, sistemdeki basit bileşenler sayesinde kolayca saflaştırılabilir. Ancak, Bu sistem genellikle bir flavanon bir flavonol üretimi ile sınırlıdır.

F3H ve FLS1, Şekil1'de gösterildiği gibi bitkilerde flavanonun flavonole dönüştürülmesinde iki önemli anahtar enzimdir. Bir flavanone bir flavonol üretmek için bir in vitro biyosentetik sistem geliştirmek için, Atf3h (GenBank katılım no. NM_114983.3) ve Atfls1 (GenBank katılım no. NM_120951.3) genleri 4 haftalık A. thaliana fidelerinden prokaryotik ekspresyon vektörü pET-32a(+) içine klonlandı. Rekombinant plaz...

Watch this Scientific Journal Video about Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade at JoVE.com

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Bir flavonol türevi sağlık ve gıda sektöründe uygulanması için çok önemlidir. Burada, flavanondan bir flavonolün biyosentezi için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz ve diğer yaklaşımlara göre önemli adımları ve avantajlarını tartışıyoruz.

Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Bu protokolü kullanarak, flavanone'lerden bir tencerede çok sayıda flavonol üretebiliriz. Bu teknik emek ve zaman tasarrufu, son derece uygun maliyetli ve kontrol edilmesi kolay, bu yüzden büyük bir sanayileşme potansiyeline sahiptir. Evet, bu yöntem diğer ikincil metabolitlerin ekonomik üretimi hakkında bilgi sağlayabilir, ancak uygulandığında bazı değişiklikler gerekir.O genellikle hiçbir şey ya da çok düşük verim alırsınız. Benim tavsiyem buz üzerinde rekombinant enzimler işlemek ve enzimlerin stok çözeltisi% 10 gliserin eklemek. Çünkü sadece görsel gösteri yoluyla yeni bir el, deneyin başarılı bir şekilde yürütülmesini etkileyen önemli ayrıntıları ve gerçeği anlayabilir.Önce arabellek hazırlayın. Tris-baz uygun miktarda eriterek iki kez sentetik tampon olun, sodyum askorbat, de-iyonize suya alfa ketoglutarik asit, ve çözeltiye gliserol uygun miktarda pipet. PH'ı 7,2'ye ayarlamak için hidroklorik asit eklemek ve iyonize su ekleyerek hacmi ayarlamak için bir pipet kullanın.İki kez sentetik tamponu ileride kullanılmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Sonra deiyonize suda demir sülfat heptahidrat eriterek 100 kez stok çözeltisi olun. Metanolflavonoid eriterek 25 milimoler flavonoid bir stok çözüm olun ve eksi 20 santigrat derece de çözüm saklayın.En kritik adım sentetik bir sistem kurmaktır. Bir flavanondan flavanol üretmek için sentetik bir sistem kurmak için, ilk bu tabloda listelenen reaktifler göre iki mililitrelik bir tüp sentetik sistem hazırlamak. Açık tüpü 40 santigrat derecede, 600 rpm'de kırk dakika sallayarak Bir ısı bloğuna yerleştirin.Bundan sonra, asetik asit 10 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu sona erdirmek, ve etil asetat 100 mikrolitre. İki saat sonra, üst organik fazı 1,5 mililitrelik bir tüpe tranfer etmek için bir pipet kullanın ve tüpü oda sıcaklığında hava kurutmak için bir kaputa yerleştirin. TLC analizini yapmak için, önce tüpleri kaputtan alın ve flavanoid tozu 160 mikrolitre metanoltüpte yeniden çözün.Metanol 25 milimolar flavonoid stok çözeltisi seyrelterek, seri konsantrasyonları ile otantik flavonoid örnekleri hazırlayın. Yeniden çözünmüş reaksiyon örneğinin bir mikrolitresini ve otantik flavonoid örneğinin bir mikrolitresini poliamid plakasına yükleyin. Aynı plaka üzerinde otantik flavonoid diğer konsantrasyonları için aynı şeyi yapın.Sonra bir duman kaputunda, bir çözücü sistemi ile dolu bir kromatografi silindiri örnek yüklü plaka koyun. Plakayı silindirin altına takın ve plakayı 20 dakika boyunca çözücü sisteminde çalıştırın. Oda sıcaklığında tabakları hava kurutun.Püskürtücü şişe ile, alüminyum klorür% 1 etanolik çözeltiile plakaları sprey, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tekrar kuruyan hava takip. 254 nanometre bir UV ışığı altında plakalar üzerinde noktalar görselleştirin ve görüntü almak, daha sonra bilgisayarda, yazılım ImageJ açın. Analiz edilecek görüntüyü açmak için dosyayı tıklatın, aç' ı tıklatın.ImageJ kullanıcı arabiriminde soldaki en dikdörtgen seçim aracını tıklatın. Görüntüdeki YG'yi fareyle anahatolarak belirtin ve ilk YG'yi etiketlemek için bire basın. Dikdörtgen seçimi fareyle birlikte bir sonraki YG'ye doğru hareket ettirin ve ikinci YG'yi etiketlemek için ikiye basın.Diğer tüm ROI'ları iki ye basarak etiketlemek için tekrarlayın. Açılır pencerede tüm RO'lar için profil çizimleri oluşturmak için üçe basın. Ardından, ilgi nin her zirvesi için kapalı bir alan tanımlamak için taban çizgilerini bırakmak için düz çizgi seçim aracını kullanın.ImageJ kullanıcı arabirimindeki ilgili simgeyi tıklatarak değnek aracını etkinleştirin. Açılır penceredeki tüm zirvelerin sonuçlarını görüntülemek için tepenin içini tıklatın. Ardından, Excel'de, orijinal flavonoidin TLC tabanlı standart eğrisini yapmak için açılır penceredeki gri değerleri ilgili flavonoid konsantrasyonlarına göre çizin.Daha sonra ortaya çıkan formüle göre, bu protokolde üretilen faiz flavonoid verimi hesaplamak. Her numuneyi 0,45 mikrometre ve 0,22 mikrometre filtreden sırayla işlemek için bir şırınga kullanın. Numuneleri emme nozulu ile Bir HPLC-MS sistemine yükleyin ve c18 sütunu kullanarak numuneleri 30 santigrat derecede ayırın.Kolonu dakikada bir mililitrede, suda yüzde 10 ila 85 hacimlik asetil nitril bir degrade ile elüate absorbe sini 200 ila 800 nanometre arasında izleyin. LC-MS analizini negatif iyon modunda, dakikada 10 litrelik kuruyan azot akışı yla 300 santigrat derece, dakikada yedi litrelik bir gaz akışıyla 250 santigrat derece, ve yerleşik bir yazılım kullanarak veri toplayın. Tek dalga boyu kromatografileri ayıklamak için nitel analiz programını açın ve dosyayı, veri dosyasını açın'ı tıklatın.Açık veri dosyası penceresinde çözümlenecek dosyayı seçin ve dosyayı açmak için aç'ı tıklatın. Kromatogram sonuçları penceresindefareyi sağ tıklatın ve ardından açılır menüde renklendirin. Tür listesinde, diğer kromatogramları tıklatın.Dedektör açılan kutusunda, DAD1'i seçin ve ardından kromatogram sonuçları penceresinde HPLC sonuçlarını görüntülemek için tamam'ı tıklatın. Kromatogram sonuçları penceresinin üst kısmında sabitlenmiş manuel tümleştirme simgesini tıklatın. Fare ile el ile tümleştirme analizi için gereken tepe noktası için taban çizgisi çizin.Sonuçları görüntülemek için görünüm, tümleştirme tepe listesi'ni tıklatın. Zirve alanlarının sonuçlarını Excel'e kopyalayın ve ilgili flavonoid konsantrasyonlarına karşı otantik flavonoidin HPLC tabanlı standart eğrisini çizin, ardından bu protokolde üretilen ilgi flavonoidinin verimini elde edilen formüle göre hesaplayın. Daha sonra flavonoid bileşiklerin tam kütlesi için MS verilerini analiz etmek için tek dalga boyu kromatogramları ayıklamak için aynı prosedürleri tekrarlayın.Kromatogram sonuçları araç çubuğundaki aralık seç simgesini tıklatın. İlginin zirvesini seçin. Seçili aralıktaki fareyi sağ tıklatın ve sonuçları MS spektrum sonuçları penceresinde görüntülemek için açılır menüdeki ekstre MS spektrumuna tıklayın.Bu in-vitro sistemin flavanonun flavonole dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için sisteme NRN eklendi. Poliamid TLC plakaüzerinde iki yeni nokta ortaya çıktı. Bir nokta DHK benzer bir göç mesafesi gösterdi, ve diğerleri KMF benzer.HPLC ve LC-MS tarafından yapılan daha ileri analizler, yeni kimyasalın sırasıyla 12 dakika ve 20 dakikalık bir tutma süresi gösterdiğini gösterdi, 287 ve 285'te Z'nin üzerindeki yarı moleküler iyon zirvesinde DHK ve KMF ile aynıydı. Sistemin diğer flavanonların ilgili flavonollere dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için ERD sisteme eklendi. Poliamid TLC plakası üzerinde iki yeni nokta, sırasıyla DHQ ve QRC'ye benzer bir geçiş mesafesi görüntülenmiştir.HPLC ve LC-MS analizleri, bu yeni kimyasalların sırasıyla 10 dakika ve 16 dakikalık bir tutma süresi ve 303 ve 301'de Z'nin üzerinde yarı moleküler iyon tepe M'yi ortaya koyduğunu göstermiştir, bu da DHQ ve QRC'ninkilere tam olarak karşılık gelmektedir. Sentetik sistemi hazırlarken, son enzim eklemeniz gerekir, ve son demir sülfat ikinci ekleyin. Evet, diğer sekonder metabolitlerin ekonomik üretimi için bir rehber sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Koruma Grupları aside dayanıksız Saklanmasına için uygun bir Ni-Schiff-Base hidrolizi Kompleksi kullanma Koşullar

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Protein Film kızılötesi elektrokimya H2 oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...