Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Vi anerkender assistance forskning navigation på Maine Medical Center for at hjælpe med indkøb af kliniske væv, og histopatologi og histomorfometri Core (støttet af 1P20GM121301, L. Liaw PI) på Maine Medical Center forskning Institut for skæring og farvning. Dette arbejde blev støttet af NIH give R01 HL141149 (L. Liaw).

Brugen af humane væv i denne undersøgelse blev evalueret og godkendt af den institutionelle Review Board af Maine Medical Center, og alle medarbejdere modtaget passende uddannelse før eksperimenter.
1. præparater
<ol><li>Gøre dissociation buffer af erstatningsgodtgørelse 50 mg dyr-gratis collagenase/dispase blend jeg løsning med 1 mL af nanopure H2O. Forbered 1 mg/mL brugsopløsning ved at tilføje 49 mL af høje glukose DMEM indeholdende 1% w/v BSA til den rekonstituerede ...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation.">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+shades+of+white:+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells.">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li><li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes:+To+What+Extent+Are+They+Related.">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li><li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine.">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li><li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine.">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

Adipøst stamceller fra forskellige depoter varierer meget i fænotype og differentiering potentielle9. Dyrkning af PVAT-afledt ophav fra en enkelt patient donor i samtidige induktion ned tre forskellige slægter, adipogenic, osteogenic, og chondrogenic, giver mulighed for et godt kontrolleret undersøgelse af pluripotente kapacitet af denne roman befolkningen i stamceller. Den metode, der er beskrevet i denne rapport kan bruges til at teste differentiering kapaciteten af stamceller fra menneskeli...

Fedtvæv er en rig kilde af multi potent mesenchymale stamceller (MSC) i stand til at differentiere i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic lineages1. Dette væv udvider gennem hypertrofi af modne adipocytter og de novo differentiering af hjemmehørende MSC til adipocytter. Perivascular fedtvæv (PVAT) omgiver blodkar og regulerer vaskulære funktion2,3. Fedme-induceret PVAT ekspansion forværrer hjerte-kar-sygdomme. Mens den Multipotente potentiale af MSC fra menneskelige subcutan fedt depoter er blevet godt undersøgt4,5, har ingen undersøgelser eksplanterede og evalueret differentiering kapaciteten af menneskelige PVAT-afledte stamceller, sandsynligvis skyldes invasionsevne af indkøb. Målet med dette arbejde er således, at fremlægge en metodologi til explant og udbrede stamceller fra menneskelige aorta PVAT fra patienter med hjerte-kar-sygdom og til at teste deres tilbøjelighed til at differentiere til osteogenic, chondrogenic og adipogenic slægter. Vores PVAT er fra stedet, hvor anastomose af bypass graft på opstigende aorta af overvægtige patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft operation. Frisk isoleret PVAT er enzymatisk adskilles og stromale vaskulære brøken er isoleret og opformeret in vitro, gør det muligt for os at teste for første gang differentiering kapaciteten af menneskelige PVAT-afledte stamceller.
Hjælp af primære kulturperler menneskelige PVAT stromale vaskulære brøkdel, testede vi tre assays designet til at fremkalde stem/stamceller til at differentiere mod adipogenic, osteogenic, eller chondrogenic slægter. Vores forudgående undersøgelse identificeret en befolkning på CD73 +, CD105 + og PDGFRa + (CD140a) celler, der kan håndfast differentiere i adipocytter6, selv om deres multipotency ikke var testet. PVAT regulerer direkte vaskulære tone og betændelse7. Begrundelsen for afprøvning differentiering potentialet i denne roman celle population er at begynde at forstå den specialiserede indflydelse af PVAT på vaskulære funktion, og mekanismer for PVAT ekspansion under fedme. Denne metode øger vores forståelse af funktionerne af fedtvæv afledte stamceller og gør det muligt for os at identificere og sammenligne ligheder og forskelle af stamceller fra forskellige væv kilder. Vi bygge på etablerede og validerede metoder til isolering og differentiere MSC mod forskellige slægter og optimere procedurerne for at maksimere levedygtigheden af menneskelige PVAT-afledte stamceller. Disse teknikker har brede anvendelsesmuligheder inden for stilk og stamfader celle forskning og fedtvæv udvikling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

Fedtvæv er en rig kilde af multi potent mesenchymale stamceller (MSC) i stand til at differentiere i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic slægter. Adipogenic differentieringen af stamceller er en vigtig mekanisme kørsel fedtvæv ekspansion og dysfunktion i svar til fedme. Forståelse ændringer til perivascular fedtvæv (PVAT) er således klinisk relevant i metabolisk sygdom. Tidligere undersøgelser har dog været overvejende udføres i musen og andre dyre modeller. Denne protokol bruger menneskelige thorax PVAT prøver indsamlet fra patienter, der gennemgår koronararterie bypass graft operation. Fedtvæv fra den opstigende aorta blev indsamlet og brugt til explantation af det stromale vaskulære brøkdel. Vi har tidligere bekræftet tilstedeværelsen af adipøst stamceller i menneskelige PVAT med kapacitet til at differentiere i lipid-holdige adipocytter. I denne undersøgelse analyseret vi yderligere differentiering potentiale af celler fra de stromale vaskulære fraktion, der formentlig indeholder flere potent stamceller. Vi sammenlignet PVAT-afledte celler til menneskelig knoglemarv MSC for differentiering af adipogenic, osteogenic, og chondrogenic slægter. Efter 14 dage af differentiering, bestemt pletter blev udnyttet til at opdage lipid ophobning i adipocytter (olie røde O), forkalkede indlån i osteogenic celler (Alizarin rød), eller glycosaminoglycans og kollagen i chondrogenic celler (Masson's Trichrome). Mens knoglemarv MSC effektivt differentieret i alle tre slægter, PVAT-afledte celler havde adipogenic og chondrogenic potentiale, men manglede robust osteogenic potentiale.

Isolering af stromale vaskulære fraktion fra menneskelige PVAT
Figur 1A viser en skematisk af anatomiske området hvor PVAT overliggende opstigende aorta blev opnået. Vi har tidligere beskrevet patientpopulationer gennemgår koronar bypass hvorfra disse prøver blev afledt6. Figur 1B viser et eksempel på den menneskelige PVAT ...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Målet med denne protokol er at teste stamceller afledt af menneskelige perivascular fedtvæv evne til at differentiere i flere celle lineages. Differentiering sammenlignet med mesenkymale stamceller fra menneskelige knoglemarven, som er kendt for at differentiere sig til adipocyt, osteocyte og Chondrocyt lineages er afledt.

Differentiering kapacitet af menneskelige aorta Perivascular fedt stamceller

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Perivascular fedtvæv omgiver blodkar og regulerer hjerte-kar-fysiologi. Denne protokol bruges til at besvare centrale spørgsmål i forbindelse med funktionen af humane fedtædende forfædre i det vaskulære mikromiljø. Fedt progenitor celler varierer afhængigt af deres anatomiske placering.Vi viser, at en population af multipotente forfædre kan udledes med succes fra perivascular fedtvæv fra patienter med hjerte-kar-sygdom. At demonstrere proceduren vil være Spencer Scott, en medicinstuderende fra mit laboratorium. Få en 500 milligram stykke Human Perivascular Adipose Væv eller PVAT fra operationsstuen som beskrevet i tekstprotokollen.Overfør frisk humanT PVAT fra DMEM til et konisk 50 milliliterrør indeholdende 25 milliliter antibiotisk opløsning. Inkubere med vuggende i 20 minutter ved fire grader Celsius. Mens PVAT er i antibiotisk opløsning, tø en aliquot af dissociation buffer på 37 grader Celsius.Tilsæt 50 mikroliter af 100x antibiotikum/antimykotisk opløsning til fem milliliter dissociationsbuffer og steriliseres ved hjælp af et 0,22 mikron sprøjtefilter. Tilsæt en milliliter gelatine opløsning til en brønd af en 24-brønd plade. I en laminar flow hætte, bruge sterile kraftbecer og saks til at overføre PVAT fra antibiotika opløsning til en steril petriskål.Tilføj en milliliter forvarmt dissociationsbuffer til vævet. Hak hele vævet fint i en gylle ved hjælp af sterile saftænt og dissektion saks. Den ene milliliter gylle overføres til fire milliliter dissociationsbuffer.Inkuber røret på sin side i en forvarpret 37 grader Celsius orbital shaker ved 200 rpm i en time. Efter en time skal der ikke være synlige vævsstykker til stede, og opløsningen vises som en uklar celleaffjedring. Opløsningen filtreres gennem en 70 mikrocelles si, der er sat oven på et konisk rør på 50 milliliter.Skyl syrnet med yderligere 10 milliliter antibiotisk opløsning for at fange så mange celler som muligt. Klem ikke semlaksen. Nu pellet cellerne i 12 minutter ved 300 gange g i en svingende spand centrifuge.Efter centrifugering, vil røret blive opdelt i en fed øverste lag af adipocytter, en interphase og en pellet. Pellet er den stromale vaskulære fraktion, der indeholder endotelceller, immunceller, blodlegemer og progenitorceller. Pelletsuspendrer pelletet op igen i 10 milliliter HBSS og centrifuge i fem minutter ved 300 gange g.Gentag dette trin for i alt to vaske i HBSS. Nu aspirere gelatine fra en 24-brønd plade. Vask forsigtigt brønden én gang med HBSS for at fjerne ubundet gelatine.Resuspend den stromale vaskulære fraktion pellet med intakte røde blodlegemer i en milliliter vækstmedium og frø på gelatine-belagt godt. Derefter tilsættes human FGF2 til en endelig koncentration på 25 nanogram pr. milliliter i kulturmediet. Inkuber i 24 timer ved 37 grader Celsius med 5% CO2.Efter dyrkning af cellerne i 24 timer fjernes vækstmediet og cellerne vaskes fem gange med HBSS. Dette vasketrin fjerner røde blodlegemer og døde celler. Derefter tilsættes en milliliter friske vækstmedier suppleret med 25 nanogram pr. milliliter FGF2 til hver brønd.Skift mediet hver 48 timer og sørg for at supplere med 25 nanogram pr. milliliter frisk FGF2 hver gang. Passage celler, når de når 100% sammenløb syv til 10 dage efter explant. For at gøre dette, aspirere vækstmedier og vask monolaget to gange med en milliliter HBSS.Aspirere alle HBSS fra brøndene og tilsæt et par dråber celle dissociation løsning. Tryk og hvirvle pladen flere gange og inkubere ved 37 grader Celsius med 5% CO2 i fem til syv minutter for at løfte cellerne. Derefter tilsættes ca. en milliliter frisk kulturmedium til de fritliggende celler.Fordel 500 mikroliter af de fritliggende celler til to brønde af en 24-brøndplade, der hver indeholder 500 mikroliter vækstmedier og 25 nanogram FGF2. Også, kultur menneskelige knoglemarv Mesenkymal stamceller eller MSC kolonier som beskrevet i tekstprotokollen. Plade det passende antal knoglemarv og PVAT-afledte celler pr brønd af en 12-brønd plade.For adipogene og osteogene tilstande, plade ca 200, 000 til 225, 000 celler pr brønd. Der henviser til, for chondrogenic betingelser, plade 150, 000 til 175, 000 celler pr brønd. Derefter adskille celler fra både den menneskelige PVAT progenitor cellepopulation og den menneskelige knoglemarv MSC population ved at tilføje celle udstationering løsning.Inkuber cellerne i løsrivelsesopløsningen ved 37 grader Celsius og 5% CO2 i fem minutter. Træk populationerne i separate 15 milliliter koniske hætteglas. Drej hætteglassene ned ved 500 gange g i syv minutter for at pellet cellerne.Derefter resuspenderet cellerne i en milliliter PBS og bruge et hæmocytometer til at vurdere celletallet. Plade cellerne i 12-godt retter som før. Giv separate retter til de inducerede og ikke-inducerede aipogene og osteogeniske tilstande.Og tilsæt 1,5 milliliter adipogene og osteogene ledningsmedier til hver brønd af den inducerede tilstand. Derefter tilsættes 1,5 milliliter adipogene og osteogene ikke-induktionsmedier til hver brønd af den ikke-inducerede tilstand. Begynd inkubation af de adipogene og osteogene inducerede og ikke-inducerede cellepopulationer ved 37 grader Celsius og 5% CO2.Spin ned den resterende mængde af humane PVAT progenitor celler og menneskelige knoglemarv MSCs i syv minutter ved 500 gange g. Bestemme volumen er nødvendig for at resuspendere de resterende knoglemarv og PVAT-afledte celle pellets for at opnå en masseitet på 100,000 celler pr 10 mikroliter. Derefter resuspend pellets i den beregnede volumen af MSC vækstmedier for chondrogenic afstamning induktion.Flyt forsigtigt mængden af celler op og ned ved hjælp af en pipette for at sikre en homogen fordeling. Nu pipette en 10 mikroliter dråbe af den koncentrerede celle opløsning i midten af hver brønd til at danne en mikromasse på 100, 000 celler. Placer en milliliter sterilt vand i den tilstødende brønd for at forhindre fordampning.Inkuber mikromassekulturerne i to timer ved 37 grader Celsius og 5% CO2 for at tillade mikromassen at samle. Efter to timer, omhyggeligt tilføje chondrogenic differentiering medier tilsat 10 nanogram pr milliliter human TGF-beta-en til hver af de inducerede tilstand brønde. Nu forsigtigt tilføje 1,5 milliliter af ikke-induktionsmediet til de ikke-inducerede tilstandsbonde.Skrab eller hæld mikromassen i den inducerede chondrogeniske tilstand i en kassette for at dehydrere, integrere og plette prøven som beskrevet i tekstprotokollen. Der blev udført adipogen differentieringsundersøgelser parallelt med humane knoglemarvsbaserede MSC- og PVAT-afledte progenitorceller. I den ikke-inducerede tilstand, ingen lipid ophobning er indlysende.Dette er i modsætning til den inducerede tilstand vist efter farvning af neutrale lipider med Oil Red O.Mens graden af differentiering i de humane aorta PVAT-afledte celler er mere robust, begge menneskelige cellekilder udstillet evnen til at differentiere for den adipogenic afstamning. Den osteogene differentieringsprotokol blev anvendt til humane knoglemarvsbaserede MSC'er og PVAT-afledte celler. Ikke-inducerede celler ikke pletten med Alizarin Red.Efter den osteogeniske differentieringsprotokol udviklede de humane MSC'er forkalkede knuder, der farves med Alizarin Red, mens humane aorta-PVAT-celler ikke gjorde det. Celler afledt af både humane knoglemarv MSCs og menneskelige PVAT viste træk karakteristisk for chondrogenic differentiering med rigelige kollagen ophobning i mikromasse. Mikromasse er dannet af humane knoglemarv MSCs og aorta PVAT-afledte celler også udstillet rigelig ophobning af glycosaminoglycans som angivet ved Alcian Blue farvning.Morfologisk, strukturer svarende til lakuner blev opdaget med celler sidder i hulrum omgivet af kollagen aflejring. Det er afgørende at fint hakke perivascular fedtvæv før enzymatisk disassociation og for at sikre korrekt celletætheder er belagt for hver afstamning differentiering assay. Efter denne procedure bør kvantitativ PCR kombineret med western blot og flow cytometri anvendes til at karakterisere afstamningsspecifikke markører for differentierede stamfader fra perivascular fedt og knoglemarvskilder.Med denne teknik, Vi kan begynde at forstå de mekanismer, der regulerer perivascular fedtvæv ekspansion og dysfunktion under fedme og de konsekvenser, progenitor celler har på vaskulær funktion og hjerte-kar-sygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human cardiomyocytes: En Differentiering Protocol fra Feeder-fri Menneskelige induceret pluripotente stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuel Isolering af Adipose-afledte stamceller fra humane Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Vurdering af Sekretorisk Kapacitet bugspytkirtlen acinusceller

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Vurdering af vaskulær tone reaktionsevne ved hjælp af isolerede Mesenteriske arterier med fokus på graduering af Perivaskulære fedtvæv

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Lever stamfader specifikation fra pluripotente stamceller ved hjælp af et defineret differentieringssystem

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering og berigelse af humane lungeepitelceller til organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Forberedelse af Adipose Stamfader celler fra Mouse Epididymal fedtvæv

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolering, spredning og differentiering af stamceller fra rhesus Macaque

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...